反相离子对色谱法测定马来酸噻吗洛尔及其滴眼液中有关物质
作者：霍秀敏
单位：霍秀敏(天津市药品检验所 300070)
关键词：反相离子对高效液相色谱法；有关物质；马来酸噻吗洛尔；马来酸噻吗洛尔滴眼液
药物分析杂志000316 摘要 目的：建立用反相离子对色谱法测定马来酸噻吗洛尔及其滴眼液中有关物质的方法。方法：采用国产YWG-C18柱，0.065%辛烷磺酸钠磷酸盐缓冲液-乙腈(70∶30)为流动相，检测波长297 nm。结果：该方法在3.0～11.2 μg.mL-1范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系(r=0.999 3)。结论：该方法简便、快速、准确，优于薄层法。
Determination of Related Substances in Timolol Maleate and
, 百拇医药
its Eye Drops by Reversed Phase Ion-pair HPLC
Huo Xiumin
(Tianjin Institute for Drug Control,300070)
Abstract Objective：A reversed phase ion-pair HPLC method was developed of the determination of related substances in timolol maleate and its eye drops.Methods:The analysis was carried on an ODS column.The mobile phase consisted of 0.065% sodium octylsulphonate phosphate buffer-acetonitrile(70∶30).Detection was at 297 nm.Result:The good linearity was obtained between peak area and concentration ranging from 3.0～11.2 μg.mL-1(r=0.999 3).Conclusion:The method was proved to be simple,rapid,and accurate.And better than thin layer chromatography method.
, 百拇医药
Key words reversed phase ion-pair HPLC,related substances,timolol maleate,timolol maleate eye drops
马来酸噻吗洛尔是一种非选择性β-肾上腺能阻滞剂，有明显降低眼内压的作用，其滴眼液治疗原发性开角型青光眼及无晶状体青光眼在临床上得到广泛应用。中国药典1995年版收载了原料药及其滴眼液[1]，USP Ⅹ 也有收载[2]，均采用薄层层析法，其有关物质的检查，BP 1993[3]是采用高效液相色谱法，但使用国产C18柱按其色谱条件不能得到理想的色谱图，本实验经过对多种色谱条件的筛选，采用反相离子对高效液相色谱法，可以快速、准确地进行样品测定。
1 仪器、药品与试剂
岛津LC-10AD泵，SPD-10A紫外检测器，CTO-10A柱温箱，C-R6A数据处理机。
, http://www.100md.com
马来酸噻吗洛尔(天津中央制药厂)，马来酸噻吗洛尔滴眼液(天津市售产品)，辅料及中间产物(天津中央制药厂)。
乙腈(色谱纯)，磷酸二氢钠(化学纯)，辛烷磺酸钠(山东禹王实业总公司化学试剂厂)。
2 色谱条件
色谱柱：YWG-C18(10 μm,4.6 mm×250 mm)；流动相：0.065%辛烷磺酸钠磷酸盐缓冲液[取磷酸二氢钠1.56 g，加水1000 mL,用磷酸(1→10)调节pH至3.50±0.05，加入辛烷磺酸钠0.65 g使溶解，摇匀]-乙腈(70∶30)；流速：0.7 mL.min-1;检测波长：297 nm；积分仪衰减：0；纸速：1.5 mm.min-1；灵敏度：0.05 AUFS；柱温：40 ℃，理论板数不低于2 000。
, 百拇医药
3 实验方法
3.1 色谱条件的选择 经过对不同磷酸盐、不同浓度(0.02，0.01，0.005 mol.L-1)缓冲溶液与甲醇或乙腈以不同配比(65∶35，70∶30，75∶25)筛选，并对加入不同离子对试剂(己烷磺酸钠及辛烷磺酸钠)，比较其不同浓度(0.085%，0.065%，0.045%)，不同pH条件(pH=3.0,pH=3.5)。最终选择0.01 mol.L-1磷酸二氢钠缓冲液[用磷酸(1→10)调pH=3.5]配制的0.065%辛烷磺酸钠溶液与乙腈(70∶30)组成的流动相为最佳条件(图1)。另以流动相溶解原料作紫外扫描，最大吸收297 nm为检测波长。
图1 原料药(A)及滴眼液(B)色谱图
, 百拇医药 1.马来酸 2，3.杂质峰 4.噻吗洛尔
3.2 线性实验 精密取马来酸噻吗洛尔适量(约相当于噻吗洛尔12.5 mg)置200 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度。分别精密取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，进样20 μL,以浓度(μg.mL-1)为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到噻吗洛尔的回归方程：
Y=875.19X-137.05 r=0.999 3
结果表明浓度在3.0～11.2 μg.mL-1范围内，线性关系良好。
3.3 有关影响因素实验 取生产厂提供的马来酸噻吗洛尔中间体噻二唑、
唑烷进行实验，均对主峰无影响(图2)。另按滴眼液处方配制空白辅料溶液，在规定的色谱条件下，基本为一直线，对本实验也无干扰。
, http://www.100md.com
图2 中间体图谱
A.噻二唑 B.唑烷
3.4 精密度实验 精密称取马来酸噻吗洛尔(980102批)适量(约相当于噻吗洛尔12.5 mg)，置25 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，重复进样6次，噻吗洛尔RSD=0.35%,马来酸RSD=0.44%，有较好的精密度。
3.5 加速实验 将原料药980102批及滴眼液980502光照27 d后，实验结果见表1。原料药经光照后比较稳定，色谱图无变化，滴眼液色谱图有明显改变(图3)，杂质峰增多，含量下降。本实验说明，该方法能够反映出样品的变化，可以控制产品质量。
表1 光照对样品的影响(n=3) 样 品
, http://www.100md.com 初始含量/%
光照后含量/%
结论
原料药
99.2
99.2
稳定
滴眼液
98.8
86.6
不稳定(杂质峰增多)
图3 光照27 d色谱图
, http://www.100md.com
A.原料药 B.滴眼液
3.6 本法与TLC法的比较 按照中国药典1995年版马来酸噻吗洛尔原料药有关物质TLC法对2批原料及滴眼液(980502批)，光照7 d及27 d的样品进行测定，与本方法比较结果见表2。结果表明HPLC法比TLC法分析灵敏度高且能准确定量，TLC法检出的杂斑数较少且不容易判断结果。
表2 HPLC法与TLC法检查有关物质的比较 样品
批号
HPLC法
(杂峰数)
TLC法
(杂斑数)
原料药
, 百拇医药
960302
960401
1
1
未检出
未检出
滴眼液
980502
(光照7 d)
(光照27 d)
4
8
1
, 百拇医药
3
4 样品测定
4.1 原料药 取本品(约相当于噻吗洛尔12.5 mg)，精密称定，置25 mL量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。精密取供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取对照溶液20 μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高约为记录仪满量程的10%～20%，再取供试品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍(主成分保留时间应在10 min后)，除马来酸峰之外，供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，量取各杂质峰面积的和不得大于对照溶液的峰面积。结果见表3。
4.2 滴眼液 精密量取本品1 mL(约相当于噻吗洛尔5 mg)置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取1 mL置100 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度作为对照溶液，照上述方法检查，应符合规定。结果见表3。
, 百拇医药
表3 样品有关物质测定结果 样品
批号
对照峰面积(n=3)
杂质峰面积之和
杂质量/%
原
料
药
960401
960402
910302
910401
980102
, 百拇医药
5082
5332
5120
5120
4584
—
—
24
24
—
—
—
0.004
, 百拇医药 0.004
—
滴
眼
液
970601
980501
980502
980306
980504
5146
4807
4862
, http://www.100md.com
5554
5014
3092
1672
1922
1422
1560
0.60
0.35
0.40
0.26
0.31
5 讨论
, 百拇医药
5.1 实验中流动相比例的调整，以主峰保留时间在10 min之后为宜，马来酸峰与相邻杂质峰基线分离较好。
5.2 方法中规定记录色谱图为主峰保留时间的3倍，是由于原料药中间体噻二唑的保留时间约为26 min，实验中970601批滴眼液中检出该杂峰。
5.3 本实验供试液自然放置24 h后复测，溶液浓度不变，杂质量不增加，比较稳定。
参考文献
1，中国药典.1995.二部：46
2，USP.ⅩⅩⅢ.1553
3，BP.1993.1132
(本文于1999年4月16日收到), 百拇医药
单位：霍秀敏(天津市药品检验所 300070)
关键词：反相离子对高效液相色谱法；有关物质；马来酸噻吗洛尔；马来酸噻吗洛尔滴眼液
药物分析杂志000316 摘要 目的：建立用反相离子对色谱法测定马来酸噻吗洛尔及其滴眼液中有关物质的方法。方法：采用国产YWG-C18柱，0.065%辛烷磺酸钠磷酸盐缓冲液-乙腈(70∶30)为流动相，检测波长297 nm。结果：该方法在3.0～11.2 μg.mL-1范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系(r=0.999 3)。结论：该方法简便、快速、准确，优于薄层法。
Determination of Related Substances in Timolol Maleate and
, 百拇医药
its Eye Drops by Reversed Phase Ion-pair HPLC
Huo Xiumin
(Tianjin Institute for Drug Control,300070)
Abstract Objective：A reversed phase ion-pair HPLC method was developed of the determination of related substances in timolol maleate and its eye drops.Methods:The analysis was carried on an ODS column.The mobile phase consisted of 0.065% sodium octylsulphonate phosphate buffer-acetonitrile(70∶30).Detection was at 297 nm.Result:The good linearity was obtained between peak area and concentration ranging from 3.0～11.2 μg.mL-1(r=0.999 3).Conclusion:The method was proved to be simple,rapid,and accurate.And better than thin layer chromatography method.
, 百拇医药
Key words reversed phase ion-pair HPLC,related substances,timolol maleate,timolol maleate eye drops
马来酸噻吗洛尔是一种非选择性β-肾上腺能阻滞剂，有明显降低眼内压的作用，其滴眼液治疗原发性开角型青光眼及无晶状体青光眼在临床上得到广泛应用。中国药典1995年版收载了原料药及其滴眼液[1]，USP Ⅹ 也有收载[2]，均采用薄层层析法，其有关物质的检查，BP 1993[3]是采用高效液相色谱法，但使用国产C18柱按其色谱条件不能得到理想的色谱图，本实验经过对多种色谱条件的筛选，采用反相离子对高效液相色谱法，可以快速、准确地进行样品测定。
1 仪器、药品与试剂
岛津LC-10AD泵，SPD-10A紫外检测器，CTO-10A柱温箱，C-R6A数据处理机。
, http://www.100md.com
马来酸噻吗洛尔(天津中央制药厂)，马来酸噻吗洛尔滴眼液(天津市售产品)，辅料及中间产物(天津中央制药厂)。
乙腈(色谱纯)，磷酸二氢钠(化学纯)，辛烷磺酸钠(山东禹王实业总公司化学试剂厂)。
2 色谱条件
色谱柱：YWG-C18(10 μm,4.6 mm×250 mm)；流动相：0.065%辛烷磺酸钠磷酸盐缓冲液[取磷酸二氢钠1.56 g，加水1000 mL,用磷酸(1→10)调节pH至3.50±0.05，加入辛烷磺酸钠0.65 g使溶解，摇匀]-乙腈(70∶30)；流速：0.7 mL.min-1;检测波长：297 nm；积分仪衰减：0；纸速：1.5 mm.min-1；灵敏度：0.05 AUFS；柱温：40 ℃，理论板数不低于2 000。
, 百拇医药
3 实验方法
3.1 色谱条件的选择 经过对不同磷酸盐、不同浓度(0.02，0.01，0.005 mol.L-1)缓冲溶液与甲醇或乙腈以不同配比(65∶35，70∶30，75∶25)筛选，并对加入不同离子对试剂(己烷磺酸钠及辛烷磺酸钠)，比较其不同浓度(0.085%，0.065%，0.045%)，不同pH条件(pH=3.0,pH=3.5)。最终选择0.01 mol.L-1磷酸二氢钠缓冲液[用磷酸(1→10)调pH=3.5]配制的0.065%辛烷磺酸钠溶液与乙腈(70∶30)组成的流动相为最佳条件(图1)。另以流动相溶解原料作紫外扫描，最大吸收297 nm为检测波长。
图1 原料药(A)及滴眼液(B)色谱图
, 百拇医药 1.马来酸 2，3.杂质峰 4.噻吗洛尔
3.2 线性实验 精密取马来酸噻吗洛尔适量(约相当于噻吗洛尔12.5 mg)置200 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度。分别精密取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，进样20 μL,以浓度(μg.mL-1)为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到噻吗洛尔的回归方程：
Y=875.19X-137.05 r=0.999 3
结果表明浓度在3.0～11.2 μg.mL-1范围内，线性关系良好。
3.3 有关影响因素实验 取生产厂提供的马来酸噻吗洛尔中间体噻二唑、
唑烷进行实验，均对主峰无影响(图2)。另按滴眼液处方配制空白辅料溶液，在规定的色谱条件下，基本为一直线，对本实验也无干扰。, http://www.100md.com
图2 中间体图谱
A.噻二唑 B.
唑烷3.4 精密度实验 精密称取马来酸噻吗洛尔(980102批)适量(约相当于噻吗洛尔12.5 mg)，置25 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，重复进样6次，噻吗洛尔RSD=0.35%,马来酸RSD=0.44%，有较好的精密度。
3.5 加速实验 将原料药980102批及滴眼液980502光照27 d后，实验结果见表1。原料药经光照后比较稳定，色谱图无变化，滴眼液色谱图有明显改变(图3)，杂质峰增多，含量下降。本实验说明，该方法能够反映出样品的变化，可以控制产品质量。
表1 光照对样品的影响(n=3) 样 品
, http://www.100md.com 初始含量/%
光照后含量/%
结论
原料药
99.2
99.2
稳定
滴眼液
98.8
86.6
不稳定(杂质峰增多)
图3 光照27 d色谱图
, http://www.100md.com
A.原料药 B.滴眼液
3.6 本法与TLC法的比较 按照中国药典1995年版马来酸噻吗洛尔原料药有关物质TLC法对2批原料及滴眼液(980502批)，光照7 d及27 d的样品进行测定，与本方法比较结果见表2。结果表明HPLC法比TLC法分析灵敏度高且能准确定量，TLC法检出的杂斑数较少且不容易判断结果。
表2 HPLC法与TLC法检查有关物质的比较 样品
批号
HPLC法
(杂峰数)
TLC法
(杂斑数)
原料药
, 百拇医药
960302
960401
1
1
未检出
未检出
滴眼液
980502
(光照7 d)
(光照27 d)
4
8
1
, 百拇医药
3
4 样品测定
4.1 原料药 取本品(约相当于噻吗洛尔12.5 mg)，精密称定，置25 mL量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。精密取供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取对照溶液20 μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高约为记录仪满量程的10%～20%，再取供试品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍(主成分保留时间应在10 min后)，除马来酸峰之外，供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，量取各杂质峰面积的和不得大于对照溶液的峰面积。结果见表3。
4.2 滴眼液 精密量取本品1 mL(约相当于噻吗洛尔5 mg)置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取1 mL置100 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度作为对照溶液，照上述方法检查，应符合规定。结果见表3。
, 百拇医药
表3 样品有关物质测定结果 样品
批号
对照峰面积(n=3)
杂质峰面积之和
杂质量/%
原
料
药
960401
960402
910302
910401
980102
, 百拇医药
5082
5332
5120
5120
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—
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—
0.004
, 百拇医药 0.004
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滴
眼
液
970601
980501
980502
980306
980504
5146
4807
4862
, http://www.100md.com
5554
5014
3092
1672
1922
1422
1560
0.60
0.35
0.40
0.26
0.31
5 讨论
, 百拇医药
5.1 实验中流动相比例的调整，以主峰保留时间在10 min之后为宜，马来酸峰与相邻杂质峰基线分离较好。
5.2 方法中规定记录色谱图为主峰保留时间的3倍，是由于原料药中间体噻二唑的保留时间约为26 min，实验中970601批滴眼液中检出该杂峰。
5.3 本实验供试液自然放置24 h后复测，溶液浓度不变，杂质量不增加，比较稳定。
参考文献
1，中国药典.1995.二部：46
2，USP.ⅩⅩⅢ.1553
3，BP.1993.1132
(本文于1999年4月16日收到), 百拇医药