线粒体DNA与人精子活力间的相关性分析
作者：郑英 周作民 沙家豪
单位：郑 英(扬州大学医学院组织学胚胎学教研室，扬州 225001)；周作民 沙家豪(南京医科大学江苏省生殖医学重点实验室，南京 210029)
关键词：线粒体DNA；精子活力；长链PCR
解剖学报000109 摘 要：目的 探讨线粒体DNA与人精子活力间的关系。 方法 用长链PCR技术，对60例精子活力正常和40例精子活力异常不育患者的精子线粒体DNA(mtDNA)进行了多重缺失的分析。 结果 两组不育患者中共有8例具有mtDNA的多重缺失(其中精子活力正常不育患者6名，精子活力异常不育患者2名)，但缺失型mtDNA(S5除外)在总mtDNA中所占比例很小(0.16%～1.85%)，1例精子活力正常的不育患者(S5)具有2.6kb的缺失型mtDNA，且缺失型mtDNA占总mtDNA的91.02%，其序列分析发现mtDNA编码区域大部分缺失。 结论 精子活力与mtDNA的多重缺失间无相关性。
, 百拇医药
分类号：Q523 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-34
ANALYSIS OF THE CORRELATION BETWEEN MITOCHONDRIAL
DNA AND HUMAN SPERM MOBILITY
ZHENG Ying
(Department of Histolog and Embryology,Medical College of Yangzhou University,Yangzhou 225001,China)
ZHOU Zuo-min
(Key Laboratory of Jiangsu Reproductive Medicine,Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)
, 百拇医药
SHA Jia-hao
(Key Laboratory of Jiangsu Reproductive Medicine,Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)
Abstract：Objective To analyze the correlation between mitochondrial DNA and human sperm mobility. Methods By using long polymerase chain reaction techniques,we studied multiple deletions of sperm mitochondrial DNA(mtDNA) in 100 infertile patients(60 with normal sperm mobility and 40 asthenospermia). Results Six of 60 patients with normal sperm mobility and two of 40 asthenospermia had multiple mtDNA deletions,but percentage of deletions in mtDNA(DmtDNA) in total mtDNA was very low(from 0.16% to 1.85%).A 2.6kb DmtDNA was found in one of infertile patients (No.S5) with normal sperm mobility,and percentage of 2.6kb DmtDNA in total mtDNA was 91.02%.Sequence analysis revealed that most of mtDNA sequence encoding RNA and polypeptide were deleted. Conclusion There is no relationship between multiple deletions in mtDNA and human sperm mobility.
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Key words：Mitochondrial DNA; Sperm mobility; Long polymerase chain reaction▲
线粒体是真核生物细胞内能量转换体系和供能中心，它含有一个独立的半自主复制的DNA，称为线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)。mtDNA是16.569kb的闭环双链DNA分子，编码氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)中的13种多肽，这些多肽与细胞核DNA编码生成的多肽一起参与OXPHOS[1]。细胞通过OXPHOS产生的ATP占细胞生命活动所需能量的90%以上，因此mtDNA对维持细胞的正常功能起重要的作用。但mtDNA易发生突变，其突变率比核DNA高出5～10倍，由基因损害导致OXPHOS的异常主要是由于mtDNA而不是核DNA突变所造成[2，3]。近年来研究发现，mtDNA缺失(deletion in mitochondrial DNA,DmtDNA)与人类衰老和多种疾病有关[2，4]。线粒体鞘是精子的重要结构之一，mtDNA突变与人类男性不育症，特别是精子活力低下不育症是否有关也引起了人们的关注。我们运用长链PCR(long polymerase chain reaction,LPCR)技术对精子活动力正常及活动力低下不育患者精子mtDNA进行了多重缺失(multiple deletions)的分析，以观察mtDNA缺失与精子运动的关系，现将结果报道如下。
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材料和方法
1.标本来源和采集
60例精子活力正常及40例活力低下不育患者均来自不育专科门诊，禁欲3～5d，手淫法采集精液，37℃孵育30min液化后进行观察。
2.实验方法
2.1 精子活力测定：按照WHO标准，将精子活力分为4级：A.快速向前运动；B.慢或呆滞的向前运动；C.非前向运动；D.不动。其中，A级活力>25%或A+B级活力>50%为正常。
2.2 精子DNA的提取：取2ml精液标本3 000 r/min离心10min，将沉淀加入300μl细胞裂解液(其中含10mmol/L Tris-HCl,pH8.0，0.5mol/L EDTA,10%十二烷基磺酸钠，0.1%蛋白酶K)，55℃ 2h，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)，12 000r/min离心10min，移上层水相入新管，加1/10体积3mol/L醋酸钠(pH 6.0)，2.5倍体积无水乙醇沉淀DNA，离心浓缩DNA，Tris-HCl缓冲液溶解，-20℃保存备用。
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2.3 LPCR引物：LPCR引物参照Cheng等[5]设计，并与mtDNA核苷酸序列核对无误。引物序列如下：RH1065(L14841)：5’-TGAGGCCAAA-TATCATTCTGAGGGGC-3’；RH1066(H15149)：5’-TTTCATCATGCGGAGATGTTGGATGG-3’。期待扩增产物为16.3kb，扩增片段中包括mtDNA的全部编码RNA和多肽。该引物由上海植物生理研究所合成。
2.4 LPCR：LPCR采用ExpansTMLong Template PCR System(Boehringer Mannheim产品)，反应体系为2.25mmol/L MgCl2，350 μmol/LdNTPs，2.62U聚合酶混合物及LPCR buffer,300nmol/L引物×2，总反应体积为50μl。反应置94℃预变性2min，94℃变性10s，68℃退火30s，共30个循环，后20个循环中每个循环68℃延伸10min后再自动延伸20s。取5μl扩增产物置0.8%琼脂糖凝胶(含10g/L溴乙锭)，40V电泳1.5h，观察结果。
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2.5 LPCR产物定量分析：采用Thermal Imaging System(Pharmacia产品)，Imagemaster○ RVDS软件包分析。
2.6 缺失型mtDNA(DmtDNA)序列测定；S5号标本DmtDNA从上游引物起，应用全自动测序分析仪对DmtDNA片段进行测定，分析DmtDNA的点突变和片段缺失情况。
结 果
1.精子活力测定
60例精子活力正常(S1～S60)不育患者精子活力测定均为A级+B级活力精子≥50%，40例精子活力异常(F1-F40)不育患者精子活力测定均为A级活力精子<10%，且A级+B级活力精子≤30%。
2.LPCR检测
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电泳结果显示，60例精子活力正常不育患者中，6例患者(S1，S2，S5，S28，S31，S47)具有mtDNA的多重缺失，其中S5号标本16.3kb扩增条带较弱，而DmtDNA条带很强。40例精子活力异常不育患者中2例患者(F9，F11)具有mtDNA的多重缺失，其他标本未见多重缺失(图1)。
3.LPCR产物定量分析
运用Imagemaster○ RVDS对LPCR产物的定量分析结果显示，S1，S2，S28，S31，S47，F9，F11号标本LPCR产物DmtDNA在总mtDNA中含量很低(0.16%～1.85%)，而以野生型mtDNA为主。S5号标本野生型mtDNA含量较低，主要为DmtDNA，它在总mtDNA中的含量为91.02%(表1，图2)。
4.S5 DmtDNA序列测定
对S5号标本DmtDNA序列测定结果发现，DmtDNA全长为2574bp，其缺失的13 700bp片段位于15432位点与12552位点之间。DmtDNA仅编码呼吸链中cytb、ND5、ND6 3种多肽及tRNAGlu，其他mtDNA编码的蛋白如：ND1、ND2、ND3、ND4L、ND4，COⅠ、COⅡ、COⅢ、ATP酶6、ATP酶及21种tRNA、12s和16s rDNA均缺失。另外，在一些位点还发现点突变：15301位G→A及12075位C→T，不影响编码氨基酸；15209位A→T，15210位C→T，编码氨基酸由酪氨酸变为苯丙氨酸；15326位A→T，编码氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸；12811位T→C，编码氨基酸由酪氨酸变为组氨酸(图3，4)。
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图1 LPCR产物凝胶电泳结果 M，λDNA经Eco R Ⅰ+Hind Ⅲ酶切分子量标准；1，4，5分别为F2、S3、S4号标本扩增产物，未见DmtDNA;2，3分别为S1、S2号标本扩增产物，除16.3kb扩增条带外还可见少量DmtDNA;6为S5号标本扩增产物，16.3kb条带较弱，另可见2.6kb的DmtDNA强扩增条带。
Fig.1 Electrophoretogram of LPCR products.M,Lambda DNA EcoR I and Hind Ⅲ digest; Lane 1,lane 4 and lane 5 represent LPCR products amplified from NoF2,NoS3,NoS4 samples,showing no deletions; Lane 2 and lane 3 indicate the LPCR products amplified from NoS1 and NoS2 samples,showing few multiple deletions; Lane 6:LPCR product amplified from NoS5 sample,showing a robust 2.6kb DmtDNA band.
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图2 LPCR产物凝胶电泳泳道绘图 图中每1条线代表1个泳道，线中每个峰相应于该泳道的每条带，每个峰的位置标出了该条带的分子量，峰下面积可用来计算每个条带的量。图中箭头所示为S5号标本2.6kb条带的吸收峰。
Fig.2 Lane profile graph of LPCR products.Each line on the graph represents one lane.The bands in each lane correspond to the peaks in each line on the graph.Each peak represents a molecular weight value for that particular band.The area under the peaks is the area used to calculate the volume.The marked peak represents the 2.7kb band amplified from NoS5.
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图3 mtDNA缺失位点序列测定结果 mtDNA在15432位点与12552位点之间有约13.7kb的缺失片段，另▲所示为点突变：15209：A→T，15210：C→T，15301：G→T，15326：A→T，12705：C→T，12811：T→C
Fig.3 Sequence analysis for DmtDNA.There is a 13.7kb deletion between positions 15432 and 12552.▲：mtDNA point mutation 15209:A→T,15210:C→T,15301:G→A,15326:A→T,12705:C→T,12811：T→C
图4 人mtDNA示意图 mtDNA全长16.569kb，从OH起始沿逆时针方向走行。图中显示了mtDNA的各编码功能区，外环表示rRNA和mRNA基因的第1个、最后1个核苷酸及mtDNA引物的部位，tRNA基因用大写字母表示。最内大半环为S5号标本mtDNA缺失片段。
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Fig.4 The human mtDNA map.The mtDNA encompasses 16.569kb with numbering starting at OH and proceeding counterclockwise around the circular map.The function of each gene is identified by shading according to the designations within the circle.The first and last nucleotides of the rRNA、mRNA genes and the positions of mtDNA primers are given on the external arcs.The tRNA genes are indicated by the letter of their cognate amino acid.The deleted sequence of No.S5 is showed on the internal arcs.
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附表 各患者LPCR产物定量分析结果
Table Quantitative determination of LPCR products in each patient 分子量(kb)
molecular weight(kb)
F2号(ng)
No.F2(ng)
S1号(ng)
No.S1(ng)
S2号(ng)
No.S2(ng)
S3号(ng)
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No.S3(ng)
S4号(ng)
No.S4(ng)
S5号(ng)
No.S5(ng)
16.3
298.55
(100%)*
590.66
(99.84%)*
440.04
(97.50%)*
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614.02
(100%)*
293.37
(100%)*
41.45
(8.98%)*
10.0
8.36
(1.85%)*
4.6
0.92
, http://www.100md.com (0.16%)*
3.0
2.92
(0.65%)*
2.6
419.47
(91.02%)*
总量(ng)
total(ng)
298.55
591.58
451.32
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614.02
293.37
461.92
注：*该扩增产物在总LPCR产物中的百分率
Note:*Percentage of the product in total LPCR products
讨 论
精子活力是衡量精液质量和男性生育力的一个重要指标。炎症、免疫因素、理化因子等作用均可导致精子活力降低，其中能量障碍为一个重要原因。ATP是精子活动的首要能量来源，它主要来自两个代谢途径：无氧酵解和线粒体呼吸链氧化磷酸化途径(有氧氧化)。经典的理论认为精子中段线粒体所形成的线粒体鞘在精子运动过程中供给所需能量，凡影响ATP生成的任何因素，如呼吸酶抑制剂及其他代谢阻滞剂均可直接或间接影响精子的活力[6，7]。该理论得到众多的实验支持。Folgero等[8]对1名线粒体酶复合物Ⅰ和Ⅳ功能缺陷患者的研究发现其精子活力明显降低。Kao等[9]对21名生育男性和19名不育男性精子mtDNA 4 977bp缺失的研究发现，随着精子活力的降低，mtDNA 4 977bp的缺失率逐渐增加。Johns等[10]亦报道1名具有mtDNA多重缺失的不育患者，其精子活力降低。这些结果均表明线粒体功能缺陷是精子活力降低的原因之一。令人难以理解的是：(1)位于睾丸曲精小管基底小室的精原细胞主要依靠有氧氧化途径获得能量，随着生精细胞向近腔小室迁移，能量的来源逐渐依靠无氧酵解，射出精子的代谢过程主要为无氧酵解，这似乎表明精子的泳动能量主要不是来自线粒体。(2)在精子发生过程，每个精母细胞中线粒体数约为300～400个，在精子中线粒体数仅为75个左右，而每个线粒体mtDNA分子拷贝数则由2～5个减少到1个，显示了在精子发生过程中大量线粒体丢失的现象[11]。(3)哺乳动物mtDNA为母系遗传，在受精卵形成后胚胎发育2细胞期和4细胞期，来自精子mtDNA就完全消失，子代中也未见父系mtDNA[12]。上述几点是否表明精子线粒体参与能量代谢功能的逐渐退化以便适应mtDNA母系遗传的需要?
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长链PCR技术是一种高效率的DNA扩增技术，能够扩增人类基因组DNA 22kb和质粒DNA 42kb长的片段，而标准PCR至多能扩增DNA靶序列达4～5kb。运用LPCR方法可以扩增mtDNA几乎全长序列，因而能够用于检测mtDNA的多重缺失[13]。标准PCR方法则需设计多对引物，进行多次PCR反应才能检测所有mtDNA的缺失，并且mtDNA缺失片段过长时(如缺失片段达到4kb以上)又因扩增效率的因素而产生较多的假阴性结果(即缺失率高)。我们应用LPCR方法分析了60例精子活力正常和40例精子活力低下不育患者精子标本，结果发现92%的精子标本无mtDNA的多重缺失，5例精子活力正常(无S5)和2例精子活力异常不育患者虽有mtDNA的多重缺失，但在总mtDNA中所占比例极少，仅为0.16%～1.85%，这一结果显示，不管精子活力是否正常，精液中含DmtDNA的精子数很少，而绝大部分精子mtDNA为野生型。另外我们还发现一名精子活力正常的不育患者(S5)精子mtDNA扩增产物除了1条较弱的16.3kb条带外，还可见1条2.6kb的DmtDNA强扩增条带。用Imagemaster○ RVDS软件包对LPCR产物定量分析显示，该患者DmtDNA在总mtDNA中所占比例高达91.02%。进一步对DmtDNA进行序列测定分析，发现DmtDNA丢失的片段长达13.7kb，占整个mtDNA长度的82.68%(13.7/16.569)，缺失区域编码OXPHOS复合物中的10种多肽、21种tRNA、12s及16s rRNA，这种大范围的缺失可以使线粒体内进行的氧化磷酸化过程因缺乏多种必需的酶而发生中断，从而使有氧氧化的产能过程发生障碍。但该患者精子活力正常：A级+B级活力精子为55%。上述结果表明，精子活力正常和异常不育患者均可有mtDNA的多重缺失，而具有mtDNA多重缺失的不育患者，即使总mtDNA中DmtDNA占绝大多数，精子活力也可表现为正常，因而精子mtDNA的多重缺失与精子活力间无相关性。1996年John等[13]对人精子中mtDNA 4.9kb、7.4kb缺失的研究也发现mtDNA的这两种缺失与精子活力无关，这一结果与我们的研究相一致。上述结果同时也表明线粒体内有氧氧化产能可能与精子活力间无相关性，精子射出体外后运动所需能量主要通过糖酵解而获得。mtDNA突变率比较DNA高10～20倍，而且无修复机制，S5号标本的DmtDNA中出现较多的点突变验证了这一现象。但值得注意的是，该男性仍为不育症患者。已知mtDNA除了参与有氧氧化功能外，还有许多功能尚未阐明，因而mtDNA缺失是否与其不育有关尚需进一步研究。■
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作者简介：郑英(1970—)，女，江苏通州市人，医学硕士，讲师
参考文献：
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[3]Dimauro S,Moraes CT.Mitochondrial encephalomyopathies[J].Arch Neurol,1993,50(11):1197-1208.
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[7]Ford WCL,Harrison A.The role of oxidative phosphorylation in the generation of ATP in human spermatozoa[J].J Reprod Fert,1981,63(1):271-278.
, 百拇医药
[8]Folgero T,Bertheussen K,Lindal S,et al.Mitochondrial disease and reduced sperm motility[J].Hum Reprod,1993,8(11):1863-1868.
[9]Kao SH,Chao HT,Wei YH.Mitochondrial deoxyribonucleic acid 4 977bp deletion is associated with diminished fertility and motility of human sperm[J].Biol Reprod,1995,52(4)：729-736.
[10]Johns DR.Mitochondrial mutations and male infertility[J].Nat Med,1997,3(2):124-125.
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[12]Giles RE,Blanc H,Cann HM,et al.Maternal inheritance of human mitochondrial DNA[J].Proc Natl Acad Sci USA,1980,77(11)6715-6719.
[13]Barratt C,Jonge CD,Mortimer D,et al.Genetics of human male fertility[M].Paris:Editions Medicales et Scientifques,1997:333-347.
收稿日期：1998-7-17
修回日期：1999-4-22, 百拇医药
单位：郑 英(扬州大学医学院组织学胚胎学教研室，扬州 225001)；周作民 沙家豪(南京医科大学江苏省生殖医学重点实验室，南京 210029)
关键词：线粒体DNA；精子活力；长链PCR
解剖学报000109 摘 要：目的 探讨线粒体DNA与人精子活力间的关系。 方法 用长链PCR技术，对60例精子活力正常和40例精子活力异常不育患者的精子线粒体DNA(mtDNA)进行了多重缺失的分析。 结果 两组不育患者中共有8例具有mtDNA的多重缺失(其中精子活力正常不育患者6名，精子活力异常不育患者2名)，但缺失型mtDNA(S5除外)在总mtDNA中所占比例很小(0.16%～1.85%)，1例精子活力正常的不育患者(S5)具有2.6kb的缺失型mtDNA，且缺失型mtDNA占总mtDNA的91.02%，其序列分析发现mtDNA编码区域大部分缺失。 结论 精子活力与mtDNA的多重缺失间无相关性。
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分类号：Q523 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-34
ANALYSIS OF THE CORRELATION BETWEEN MITOCHONDRIAL
DNA AND HUMAN SPERM MOBILITY
ZHENG Ying
(Department of Histolog and Embryology,Medical College of Yangzhou University,Yangzhou 225001,China)
ZHOU Zuo-min
(Key Laboratory of Jiangsu Reproductive Medicine,Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)
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SHA Jia-hao
(Key Laboratory of Jiangsu Reproductive Medicine,Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)
Abstract：Objective To analyze the correlation between mitochondrial DNA and human sperm mobility. Methods By using long polymerase chain reaction techniques,we studied multiple deletions of sperm mitochondrial DNA(mtDNA) in 100 infertile patients(60 with normal sperm mobility and 40 asthenospermia). Results Six of 60 patients with normal sperm mobility and two of 40 asthenospermia had multiple mtDNA deletions,but percentage of deletions in mtDNA(DmtDNA) in total mtDNA was very low(from 0.16% to 1.85%).A 2.6kb DmtDNA was found in one of infertile patients (No.S5) with normal sperm mobility,and percentage of 2.6kb DmtDNA in total mtDNA was 91.02%.Sequence analysis revealed that most of mtDNA sequence encoding RNA and polypeptide were deleted. Conclusion There is no relationship between multiple deletions in mtDNA and human sperm mobility.
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Key words：Mitochondrial DNA; Sperm mobility; Long polymerase chain reaction▲
线粒体是真核生物细胞内能量转换体系和供能中心，它含有一个独立的半自主复制的DNA，称为线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)。mtDNA是16.569kb的闭环双链DNA分子，编码氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)中的13种多肽，这些多肽与细胞核DNA编码生成的多肽一起参与OXPHOS[1]。细胞通过OXPHOS产生的ATP占细胞生命活动所需能量的90%以上，因此mtDNA对维持细胞的正常功能起重要的作用。但mtDNA易发生突变，其突变率比核DNA高出5～10倍，由基因损害导致OXPHOS的异常主要是由于mtDNA而不是核DNA突变所造成[2，3]。近年来研究发现，mtDNA缺失(deletion in mitochondrial DNA,DmtDNA)与人类衰老和多种疾病有关[2，4]。线粒体鞘是精子的重要结构之一，mtDNA突变与人类男性不育症，特别是精子活力低下不育症是否有关也引起了人们的关注。我们运用长链PCR(long polymerase chain reaction,LPCR)技术对精子活动力正常及活动力低下不育患者精子mtDNA进行了多重缺失(multiple deletions)的分析，以观察mtDNA缺失与精子运动的关系，现将结果报道如下。
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材料和方法
1.标本来源和采集
60例精子活力正常及40例活力低下不育患者均来自不育专科门诊，禁欲3～5d，手淫法采集精液，37℃孵育30min液化后进行观察。
2.实验方法
2.1 精子活力测定：按照WHO标准，将精子活力分为4级：A.快速向前运动；B.慢或呆滞的向前运动；C.非前向运动；D.不动。其中，A级活力>25%或A+B级活力>50%为正常。
2.2 精子DNA的提取：取2ml精液标本3 000 r/min离心10min，将沉淀加入300μl细胞裂解液(其中含10mmol/L Tris-HCl,pH8.0，0.5mol/L EDTA,10%十二烷基磺酸钠，0.1%蛋白酶K)，55℃ 2h，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)，12 000r/min离心10min，移上层水相入新管，加1/10体积3mol/L醋酸钠(pH 6.0)，2.5倍体积无水乙醇沉淀DNA，离心浓缩DNA，Tris-HCl缓冲液溶解，-20℃保存备用。
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2.3 LPCR引物：LPCR引物参照Cheng等[5]设计，并与mtDNA核苷酸序列核对无误。引物序列如下：RH1065(L14841)：5’-TGAGGCCAAA-TATCATTCTGAGGGGC-3’；RH1066(H15149)：5’-TTTCATCATGCGGAGATGTTGGATGG-3’。期待扩增产物为16.3kb，扩增片段中包括mtDNA的全部编码RNA和多肽。该引物由上海植物生理研究所合成。
2.4 LPCR：LPCR采用ExpansTMLong Template PCR System(Boehringer Mannheim产品)，反应体系为2.25mmol/L MgCl2，350 μmol/LdNTPs，2.62U聚合酶混合物及LPCR buffer,300nmol/L引物×2，总反应体积为50μl。反应置94℃预变性2min，94℃变性10s，68℃退火30s，共30个循环，后20个循环中每个循环68℃延伸10min后再自动延伸20s。取5μl扩增产物置0.8%琼脂糖凝胶(含10g/L溴乙锭)，40V电泳1.5h，观察结果。
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2.5 LPCR产物定量分析：采用Thermal Imaging System(Pharmacia产品)，Imagemaster○ RVDS软件包分析。
2.6 缺失型mtDNA(DmtDNA)序列测定；S5号标本DmtDNA从上游引物起，应用全自动测序分析仪对DmtDNA片段进行测定，分析DmtDNA的点突变和片段缺失情况。
结 果
1.精子活力测定
60例精子活力正常(S1～S60)不育患者精子活力测定均为A级+B级活力精子≥50%，40例精子活力异常(F1-F40)不育患者精子活力测定均为A级活力精子<10%，且A级+B级活力精子≤30%。
2.LPCR检测
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电泳结果显示，60例精子活力正常不育患者中，6例患者(S1，S2，S5，S28，S31，S47)具有mtDNA的多重缺失，其中S5号标本16.3kb扩增条带较弱，而DmtDNA条带很强。40例精子活力异常不育患者中2例患者(F9，F11)具有mtDNA的多重缺失，其他标本未见多重缺失(图1)。
3.LPCR产物定量分析
运用Imagemaster○ RVDS对LPCR产物的定量分析结果显示，S1，S2，S28，S31，S47，F9，F11号标本LPCR产物DmtDNA在总mtDNA中含量很低(0.16%～1.85%)，而以野生型mtDNA为主。S5号标本野生型mtDNA含量较低，主要为DmtDNA，它在总mtDNA中的含量为91.02%(表1，图2)。
4.S5 DmtDNA序列测定
对S5号标本DmtDNA序列测定结果发现，DmtDNA全长为2574bp，其缺失的13 700bp片段位于15432位点与12552位点之间。DmtDNA仅编码呼吸链中cytb、ND5、ND6 3种多肽及tRNAGlu，其他mtDNA编码的蛋白如：ND1、ND2、ND3、ND4L、ND4，COⅠ、COⅡ、COⅢ、ATP酶6、ATP酶及21种tRNA、12s和16s rDNA均缺失。另外，在一些位点还发现点突变：15301位G→A及12075位C→T，不影响编码氨基酸；15209位A→T，15210位C→T，编码氨基酸由酪氨酸变为苯丙氨酸；15326位A→T，编码氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸；12811位T→C，编码氨基酸由酪氨酸变为组氨酸(图3，4)。
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图1 LPCR产物凝胶电泳结果 M，λDNA经Eco R Ⅰ+Hind Ⅲ酶切分子量标准；1，4，5分别为F2、S3、S4号标本扩增产物，未见DmtDNA;2，3分别为S1、S2号标本扩增产物，除16.3kb扩增条带外还可见少量DmtDNA;6为S5号标本扩增产物，16.3kb条带较弱，另可见2.6kb的DmtDNA强扩增条带。
Fig.1 Electrophoretogram of LPCR products.M,Lambda DNA EcoR I and Hind Ⅲ digest; Lane 1,lane 4 and lane 5 represent LPCR products amplified from NoF2,NoS3,NoS4 samples,showing no deletions; Lane 2 and lane 3 indicate the LPCR products amplified from NoS1 and NoS2 samples,showing few multiple deletions; Lane 6:LPCR product amplified from NoS5 sample,showing a robust 2.6kb DmtDNA band.
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图2 LPCR产物凝胶电泳泳道绘图 图中每1条线代表1个泳道，线中每个峰相应于该泳道的每条带，每个峰的位置标出了该条带的分子量，峰下面积可用来计算每个条带的量。图中箭头所示为S5号标本2.6kb条带的吸收峰。
Fig.2 Lane profile graph of LPCR products.Each line on the graph represents one lane.The bands in each lane correspond to the peaks in each line on the graph.Each peak represents a molecular weight value for that particular band.The area under the peaks is the area used to calculate the volume.The marked peak represents the 2.7kb band amplified from NoS5.
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图3 mtDNA缺失位点序列测定结果 mtDNA在15432位点与12552位点之间有约13.7kb的缺失片段，另▲所示为点突变：15209：A→T，15210：C→T，15301：G→T，15326：A→T，12705：C→T，12811：T→C
Fig.3 Sequence analysis for DmtDNA.There is a 13.7kb deletion between positions 15432 and 12552.▲：mtDNA point mutation 15209:A→T,15210:C→T,15301:G→A,15326:A→T,12705:C→T,12811：T→C
图4 人mtDNA示意图 mtDNA全长16.569kb，从OH起始沿逆时针方向走行。图中显示了mtDNA的各编码功能区，外环表示rRNA和mRNA基因的第1个、最后1个核苷酸及mtDNA引物的部位，tRNA基因用大写字母表示。最内大半环为S5号标本mtDNA缺失片段。
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Fig.4 The human mtDNA map.The mtDNA encompasses 16.569kb with numbering starting at OH and proceeding counterclockwise around the circular map.The function of each gene is identified by shading according to the designations within the circle.The first and last nucleotides of the rRNA、mRNA genes and the positions of mtDNA primers are given on the external arcs.The tRNA genes are indicated by the letter of their cognate amino acid.The deleted sequence of No.S5 is showed on the internal arcs.
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附表 各患者LPCR产物定量分析结果
Table Quantitative determination of LPCR products in each patient 分子量(kb)
molecular weight(kb)
F2号(ng)
No.F2(ng)
S1号(ng)
No.S1(ng)
S2号(ng)
No.S2(ng)
S3号(ng)
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No.S3(ng)
S4号(ng)
No.S4(ng)
S5号(ng)
No.S5(ng)
16.3
298.55
(100%)*
590.66
(99.84%)*
440.04
(97.50%)*
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614.02
(100%)*
293.37
(100%)*
41.45
(8.98%)*
10.0
8.36
(1.85%)*
4.6
0.92
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3.0
2.92
(0.65%)*
2.6
419.47
(91.02%)*
总量(ng)
total(ng)
298.55
591.58
451.32
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614.02
293.37
461.92
注：*该扩增产物在总LPCR产物中的百分率
Note:*Percentage of the product in total LPCR products
讨 论
精子活力是衡量精液质量和男性生育力的一个重要指标。炎症、免疫因素、理化因子等作用均可导致精子活力降低，其中能量障碍为一个重要原因。ATP是精子活动的首要能量来源，它主要来自两个代谢途径：无氧酵解和线粒体呼吸链氧化磷酸化途径(有氧氧化)。经典的理论认为精子中段线粒体所形成的线粒体鞘在精子运动过程中供给所需能量，凡影响ATP生成的任何因素，如呼吸酶抑制剂及其他代谢阻滞剂均可直接或间接影响精子的活力[6，7]。该理论得到众多的实验支持。Folgero等[8]对1名线粒体酶复合物Ⅰ和Ⅳ功能缺陷患者的研究发现其精子活力明显降低。Kao等[9]对21名生育男性和19名不育男性精子mtDNA 4 977bp缺失的研究发现，随着精子活力的降低，mtDNA 4 977bp的缺失率逐渐增加。Johns等[10]亦报道1名具有mtDNA多重缺失的不育患者，其精子活力降低。这些结果均表明线粒体功能缺陷是精子活力降低的原因之一。令人难以理解的是：(1)位于睾丸曲精小管基底小室的精原细胞主要依靠有氧氧化途径获得能量，随着生精细胞向近腔小室迁移，能量的来源逐渐依靠无氧酵解，射出精子的代谢过程主要为无氧酵解，这似乎表明精子的泳动能量主要不是来自线粒体。(2)在精子发生过程，每个精母细胞中线粒体数约为300～400个，在精子中线粒体数仅为75个左右，而每个线粒体mtDNA分子拷贝数则由2～5个减少到1个，显示了在精子发生过程中大量线粒体丢失的现象[11]。(3)哺乳动物mtDNA为母系遗传，在受精卵形成后胚胎发育2细胞期和4细胞期，来自精子mtDNA就完全消失，子代中也未见父系mtDNA[12]。上述几点是否表明精子线粒体参与能量代谢功能的逐渐退化以便适应mtDNA母系遗传的需要?
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长链PCR技术是一种高效率的DNA扩增技术，能够扩增人类基因组DNA 22kb和质粒DNA 42kb长的片段，而标准PCR至多能扩增DNA靶序列达4～5kb。运用LPCR方法可以扩增mtDNA几乎全长序列，因而能够用于检测mtDNA的多重缺失[13]。标准PCR方法则需设计多对引物，进行多次PCR反应才能检测所有mtDNA的缺失，并且mtDNA缺失片段过长时(如缺失片段达到4kb以上)又因扩增效率的因素而产生较多的假阴性结果(即缺失率高)。我们应用LPCR方法分析了60例精子活力正常和40例精子活力低下不育患者精子标本，结果发现92%的精子标本无mtDNA的多重缺失，5例精子活力正常(无S5)和2例精子活力异常不育患者虽有mtDNA的多重缺失，但在总mtDNA中所占比例极少，仅为0.16%～1.85%，这一结果显示，不管精子活力是否正常，精液中含DmtDNA的精子数很少，而绝大部分精子mtDNA为野生型。另外我们还发现一名精子活力正常的不育患者(S5)精子mtDNA扩增产物除了1条较弱的16.3kb条带外，还可见1条2.6kb的DmtDNA强扩增条带。用Imagemaster○ RVDS软件包对LPCR产物定量分析显示，该患者DmtDNA在总mtDNA中所占比例高达91.02%。进一步对DmtDNA进行序列测定分析，发现DmtDNA丢失的片段长达13.7kb，占整个mtDNA长度的82.68%(13.7/16.569)，缺失区域编码OXPHOS复合物中的10种多肽、21种tRNA、12s及16s rRNA，这种大范围的缺失可以使线粒体内进行的氧化磷酸化过程因缺乏多种必需的酶而发生中断，从而使有氧氧化的产能过程发生障碍。但该患者精子活力正常：A级+B级活力精子为55%。上述结果表明，精子活力正常和异常不育患者均可有mtDNA的多重缺失，而具有mtDNA多重缺失的不育患者，即使总mtDNA中DmtDNA占绝大多数，精子活力也可表现为正常，因而精子mtDNA的多重缺失与精子活力间无相关性。1996年John等[13]对人精子中mtDNA 4.9kb、7.4kb缺失的研究也发现mtDNA的这两种缺失与精子活力无关，这一结果与我们的研究相一致。上述结果同时也表明线粒体内有氧氧化产能可能与精子活力间无相关性，精子射出体外后运动所需能量主要通过糖酵解而获得。mtDNA突变率比较DNA高10～20倍，而且无修复机制，S5号标本的DmtDNA中出现较多的点突变验证了这一现象。但值得注意的是，该男性仍为不育症患者。已知mtDNA除了参与有氧氧化功能外，还有许多功能尚未阐明，因而mtDNA缺失是否与其不育有关尚需进一步研究。■
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作者简介：郑英(1970—)，女，江苏通州市人，医学硕士，讲师
参考文献：
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收稿日期：1998-7-17
修回日期：1999-4-22, 百拇医药