水稻条纹病毒两个分离物RNA4基因间隔区的序列比较
作者：魏太云 林含新 吴祖建 林奇英 谢联辉
单位：福建农业大学植物病毒研究所，福建省植物病毒学重点实验室，福州 350002
关键词：水稻条纹病毒；RNA4基因间隔区；序列比较
中国病毒学000210 摘要：通过RT-PCR扩增了我国水稻条纹病毒(RSV)山东济宁(JN)、云南宜良(YL)两个分离物RNA4基因间隔区(intergenic region,IR)序列，并克隆于pGEM-T easy载体上。序列分析结果表明：JN、YL两分离物RNA4 IR均由654个核苷酸组成，两者之间的同源率为92%。JN、YL两个分离物RNA4 IR在AU碱基富集处可形成两个明显的发夹结构，其中一个序列比较保守，形成的发夹结构稳定；但另一个由于碱基变异导致所形成的发夹结构的稳定性在各个分离物中差异较大。这些结果说明了我国水稻条纹病毒存在明显的分子变异。
, 百拇医药
中图分类号：S432.41 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0156-07
Sequence Comparison of Intergenic Region between Two Isolates of Rice Stripe Virus RNA4
WEI Tai-yun,LIN Han-xin,WU Zu-jian,LIN Qi-ying,XIE Lian-hui
(Institute of Plant Virology of Fujian Agricultural University,Key Laboratory of
Plant Virology of Fujian Province,Fuzhou 350002,China)
, 百拇医药
Abstract:The RNA4 intergenic regions of two isolates of rice stripe virus (RSV) in China (de-signated as RSV-JN and RSV-YL) were amplified by RT-PCR and cloned into pGEM-T easy vector.Sequence analysis showed that they were all 654 bp in length,and shared only 92% identity at the nucleotide level.Computer-assisted folding analysis showed that the intergenic region was rich in A and U residues where two distant hairpin structures could be formed.One was highly conserved and stable,but the other was rather unstable because of bases variation.Therefore,there were molecular variation among isolates of rice stripe virus in China.
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Key words:Rice stripe virus; RNA4 intergenic regions; Sequence comparison
水稻条纹叶枯病是中国、日本、朝鲜及远东地区水稻上的一种重要的病毒病。在我国，该病从南到北广泛分布于十六个省市，曾造成严重的损失，至今仍在云南各地区猖獗危害[1]，其病原为水稻条纹病毒(rice stripe virus,RSV)，是纤细病毒属(Tenuivirus)的典型成员，其基因组由4个ssRNA片段组成。除RNA1采用负链编码策略外，RNA2、RNA3和RNA4均采取双义编码策略(ambisense coding strategy)。RSV可能编码的蛋白中，现已证实RNA3负链编码病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)，RNA4正链编码病害特异性蛋白(disease-specific protein,SP)[2～5]。
日本学者根据各分离物的致病性以及SP分子量的差异，已划分出鸿巢、P、N、T、M等多个株系[3，6]。其中，T株系的全序列已测定，M株系也测定了RNA3、4两个片段的序列。RNA4序列比较发现，T株系的IR比M株系多了一个19bp的插入序列，RNA4 IR存在U和A碱基富集带及可能的发夹结构[2，3，8，9]。由于IR的发夹结构可能具有终止mRNA转录及保持ssRNA稳定性的作用，又易于突变，所以被认为具有重要的功能[3，7]。
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我国地域辽阔，地理生态多样性丰富，各地区的RSV之间极可能存在分子变异或株系分化。为此，本研究选择我国RSV的山东济宁(JN)、云南宜良(YL)两个分离物，通过比较分析其RNA4 IR的序列，为进一步研究我国RSV的分子变异或株系分化及IR等调控元件在病毒基因组双义表达过程中的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 病毒 为本所采自山东济宁、云南宜良、经分离纯化并保存于合系28水稻品种上的RSV JN、YL两个分离物。
1.2 引物 根据Kakutani等[8]报道的RSV RNA4的基因序列，设计一对用于扩增RNA4 IR的寡聚核苷酸引物，引物由上海植物生理研究所合成，序列如下：
P1：5′CCAACCTCTTCTACACAAGAC3′(与RNA4 5′端567～587bp相对应)；
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P2：5′GTAGGTGAGATAACCAGTTCC3′(与RNA4 5′端1208～1228bp互补)。
1.3 病毒提纯 参照Ishikawa等[10]的方法，略作修改。
1.4 病毒RNA的提取 根据Toriyama等[11]的方法，略作改进。提纯的病毒经SDS、蛋白酶K处理，酚-氯仿抽提得到病毒RNA，经紫外测定浓度为0.52μg/μL。
1.5 cDNA合成及PCR扩增 1.0μg病毒RNA模板和10pmol/L的3′端引物先在95℃处理10min，再按Promega公司的cDNA合成试剂盒说明书进行cDNA第一条链的合成。PCR扩增是在50μL反应体系中进行，包括反转录产物2μL、P1和P2(10pmol/L)各5μL、dNTP(每份10mmol/L) 1μL、10×buffer 5μL、DDW 28μL、MgCl2(25mmol/L) 3μL、Taq DNA聚合酶(4u/μL,MBI公司产品) 1μL。采用双退火温度进行扩增：前5个循环，94℃变性1min、30℃退火2min、72℃延伸2min；后25个循环，除退火温度改为37℃外，其余同前。最后一个循环结束后，72℃保温10min。
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1.6 克隆及测序 PCR产物在1.5%琼脂糖上电泳后，切取目的基因片段，用QIAEXⅡ Gel Extration Kit(QIAGEN公司产品)回收后，直接连接于pGEM-T easy载体(Promega公司产品)上的克隆位点，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选、PCR扩增及EcoRI酶切分析鉴定插入片段。DNA测序由上海基康生物技术有限公司在ABI 377型DNA测序仪上进行。
1.7 核苷酸序列分析 用DNASIS软件(Hitachi software Engineering Co.Ltd)进行序列分析。
2 结果与分析
2.1 RT-PCR扩增
提取的病毒RNA经RT-PCR扩增后，RSV的JN和YL两个分离物都得到一个长度约为680bp的扩增片段，与预期的662bp的扩增片段相近(图1)。
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2.2 重组质粒的筛选和鉴定
扩增产物经纯化后克隆到pGEM-T easy载体上，经蓝白斑筛选、PCR检测及EcoRI酶切分析鉴定后，证实所得到的克隆均为含有插入片段的重组子，JN和YL两个分离物RNA4 IR的克隆分别命名为pTE-JN、pTE-YL，因为EcoR I酶切位点分别位于pGEM-T easy载体上的52nt、70nt处，故酶切片段比RT-PCR扩增片段长19bp，达到700bp左右(图2)。
图1 1.5%琼脂糖电泳检测RT-PCR扩增结果
M:DNA marker ladder;
1:RSV-JN RNA4基因间隔区RT-PCR产物；
, http://www.100md.com 2:RSV-YL RNA4基因间隔区RT-PCR产物。
Fig.1 1.5% Agarose gel electrophoresis
of RT-PCR product
M:DNA marker ladder;
Lane 1:product of RT-PCR of RSV-JN RNA4 IR;
Lane 2:product of RT-PCR of RSV-YL RNA4 IR.
图2 重组质粒的EcoRⅠ酶切鉴定
M:DNA marker ladder; 1:pGEM-T easy载体；
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2-3:重组质粒pTE-JN、pTE-YL；
4:EcoRⅠ酶切pGEM-T easy载体；
5-6:EcoRⅠ酶切pTE-JN、pTE-YL。
Fig.2 Identification of recombinant plasmid
digested by EcoRⅠ
M:DNA marker ladder;
Lane 1:pGEM-T easy vector;
Lane 2-3:recombinant plasmid pTE-JN、pTE-YL;
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Lane 4:pGEM-T easy vector/EcoRⅠ;
Lane 5-6:pTE-JN/EcoRⅠ、pTE-YL/EcoRⅠ.
2.3 基因间隔区核酸序列分析
核酸序列分析结果表明：JN、YL两个分离物RNA4 IR均含有654个核苷酸，与日本报道的T分离物RNA4 IR核苷酸数目相同，但和M分离物RNA4 IR相比多了一段19bp的插入片段。插入片段的序列均为5′CAUAGAAACAUGAGAGUAU3′；和T分离物的插入片段(5′CAUAGAAACAUGAGAGCAU3′)相比有一个碱基的差异。另外，JN和T分离物的插入片段位置均在第296～314nt之间，而YL分离物的插入位置在第299～317nt之间(图3)。DNASIS软件分析结果表明：JN、YL、T 3个分离物RNA4 IR序列之间的同源率均为92%，而JN、YL与M分离物之间的同源率均为87%左右(图3)。RNA二级结构预测分析发现，JN、YL分离物RNA4 IR和T、M分离物一样，在AU碱基富集处可形成两个明显的发夹结构，其中JN、T分离物在第326～361nt、YL分离物在第329～362nt、M分离物在第313～334nt(图3第一条下划线处)可形成发夹结构，这个区段由于碱基变异较大，形成的发夹结构很不稳定。一般而言，发夹结构的最低自由能越低，结构越稳定。JN、YL、M与T四个分离物在这一区段序列所形成的发夹结构所预测的最低自由能(ΔG)分别为0.84kj、-3.4kj、-7.14kj和-36kj，很明显，这一区段序列所形成的发夹结构中，T分离物最为稳定。对T分离物而言，JN分离物在第328nt处有U→G碱基突变、在第349nt处有A→U碱基突变；YL分离物第335～336nt处有两个A碱基缺失突变、在第349nt处有A→U碱基突变；M分离物在第351nt处有U→C碱基突变、在第361nt处有G→A碱基突变。显然，各个分离物在这一区段序列所形成的发夹结构的稳定性不同是由这些碱基突变所致。JN、YL和T3个分离物在第420～463nt、M分离物在第400～461nt(图3第二条下划线处)可形成另一发夹结构，这一段序列比较保守，形成的发夹结构稳定，其最低自由能(ΔG)为-160kj，M分离物在这一区段虽有两个碱基的缺失突变(相对于T分离物，在第448-449nt处有UG两个碱基缺失突变)但并没有影响其发夹结构的稳定性(图4)。
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图3 JN、YL、T及M 4个分离物RNA4基因间隔区序列分析比较
-:相同的碱基，*缺失的碱基。单下划线表示两个可能形成发夹结构的核苷酸的位置。波线表示相对于M分离物有一段19bp插入序列的位置。T和M两个分离的序列分别引自Zhu等(1992)、Kakutani等(1990)。
Fig.3 Alignment of nucleotide sequence of RNA4 intergenic region within JN、YL、T、M、4 isolates
-:same nucleotide,*:missed nucleotide.
Single underlines indicate the nucleotide positions of the two predicated hairpin strucures.
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Wavy underline indicates the nucleotide positions of 19-base insertion relative to this region of M isolete.
The nucleotide sequences of T and M isolates from Zhu et al (1992)、Kakutani et al (1990).
图4 RNA4基因间隔区内两个可能的发夹结构
(a)四个分离物中稳定性不同的发夹结构，(b)四个分离物共有的、稳定的发夹结构。
*:茎区的碱基配对，ΔG：最低自由能。(a)标出发夹结构的核苷酸位置(距5′末端)。T和M两个分离物的序列分别引自Zhu等(1992)、Kakutani等(1990)。
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Fig.4 The two predicted hairpin structures in the RNA4 intergenic region
(a) the hairpin structures different in stability among 4 isolates,(b)the same and stable hairpin structures among 4 isolates.
*:base-pairing in the stem region,ΔG:the lowest free energy.The nucleotide positions were showed (from the 5′ termini).The nucleotide sequences of T and M isolates from Zhu et al(1992)、Kakutain et al (1990).
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3 讨论
研究结果表明，各分离物RNA4 IR序列碱基变异较大，同源率不高，在AU碱基富集处可形成两个发夹结构，其中一个序列比较保守，形成的发夹结构稳定，但另一个由于碱基突变造成所形成的发夹结构的稳定性在各个分离物中差异较大。Auperin等[7]认为这种发夹结构对间隔区两旁基因编码区转录终止及ssRNA稳定性有重要作用。Zhu等[3]也提出RSV RNA4 IR可能具有高级的结构，且易于突变，认为正是这种复杂的结构是参与病毒功能的重要因素，并提出RSV RNA4 IR和病毒的生物学性状包括病症可能相关。而RSV RNA4 vRNA上的ORF编码病害特异性蛋白被认为是一种与病症有紧密相关的蛋白[12，13]，是否各个分离物正是通过这种稳定性不同的发夹结构，影响IR两旁ORF的转录终止及ssRNA的稳定性，进而导致其生物学性状差异呢这是值得进一步研究的问题。这个结果启发我们在进行抗病毒转基因工程的研究中，可采取反义RNA策略，以IR的反义RNA封闭其保守序列及茎-环结构，有可能干扰RSV基因组的转录和ssRNA的稳定性，进而提高转基因植物的抗性。
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RSV RNA4 IR在某些区段碱基变异较大，变异的原因可能有两点：(1)PCR扩增时所使用的Taq DNA聚合酶缺乏5′ -3′端矫正功能，大约有0.25%的错配率[14]，这种影响显然是微乎其微的；(2)病毒在与寄主的协同进化过程中受环境选择压力的影响。对采自JN、YL两个分离物RNA4 IR进行了比较，其同源率只有92%，而它们与T分离物RNA4相应区段却同样有92%左右的同源率，前三个RSV分离物RNA4 IR与M分离物RNA4相应区段相比多了19bp的插入序列，都约有87%的同源率。这从一个侧面提示了：(1)JN、YL分离物与T分离物的亲缘关系可能比与M分离物的亲缘关系更为接近；(2)我国RSV各分离物存在分子变异与株系分化。
我国幅员辽阔，各地生态环境千变万化，水稻的耕作制度和品种布局各不相同，这就为RSV产生分子变异和株系分化提供了很好的条件。对其进一步的研究将为揭示RSV的分子演化规律提供依据。
国家自然科学基金资助项目(39670489);福建省自然科学基金资助项目(C97031)
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魏太云(1975-),男,福建省福清市人,硕士研究生.研究方向为植物病毒学.
参考文献
[1]林含新，林奇英，谢联辉.水稻条纹病毒分子生物学研究进展[J].中国病毒学，1997，12(3)：202～209
[2]Zhu Y,Hayakawa T,Toriyama S,et al.Complete nucleotide sequence of RNA3 of rice stripe virus:an ambisense coding strategy.J Gen Virol,1991,72:763～767
[3]Zhu Y,Hayajawa T,Toriyama S.Complete nucleotide sequence of RNA4 of rice stripe virus isolate T and comparison with another isolate and with maize stripe virus[J].J Gen Virol,1992,73:1309～1312
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[4]Takahashi M,Toriyama S,Hamamatst C,et al.Nucleotide sequence and possible ambisense coding strategy of rice stripe virus RNA segment 2[J].J Gen Virol,1993,74(4):769～733
[5]Toriyama S.Nucleotide sequence of RNA1,the largest genomic segment of rice stripe virus,the prototype of the tenuiviruses[J].J Gen Virol,1994,75:3569～3579
[6]Hayaski T,Usugi T,Nakano M,et al.On the strains of rice stripe virus (1):An attempt to detect strains by difference in molecular size of disease-specific proteins[J].Proceeding of the Association for plant Protection of Kyushu.J Gen Virol,1989,35:1～2
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[9]Kakutani T,Hayashi T,Minobe Y.Ambisense segment 3 of rice stripe virus:the first instance of a virus containing two ambisense segments[J].J Gen Virol,1991,72(2):465～468
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[13]林奇田，林含新，吴祖建，等.水稻条纹病毒外壳蛋白和病害特异蛋白在寄主体内的积累[J].福建农业大学学报，1998，27(3)：322～326
[14]Tindali K,Kunkel T.Fidelity of DNA synthesis by the thermus aquatieus DNA Polymerase[J].Biochemistry,1988,27:6008～6013
1999-03-03
1999-07-29, 百拇医药
单位：福建农业大学植物病毒研究所，福建省植物病毒学重点实验室，福州 350002
关键词：水稻条纹病毒；RNA4基因间隔区；序列比较
中国病毒学000210 摘要：通过RT-PCR扩增了我国水稻条纹病毒(RSV)山东济宁(JN)、云南宜良(YL)两个分离物RNA4基因间隔区(intergenic region,IR)序列，并克隆于pGEM-T easy载体上。序列分析结果表明：JN、YL两分离物RNA4 IR均由654个核苷酸组成，两者之间的同源率为92%。JN、YL两个分离物RNA4 IR在AU碱基富集处可形成两个明显的发夹结构，其中一个序列比较保守，形成的发夹结构稳定；但另一个由于碱基变异导致所形成的发夹结构的稳定性在各个分离物中差异较大。这些结果说明了我国水稻条纹病毒存在明显的分子变异。
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中图分类号：S432.41 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0156-07
Sequence Comparison of Intergenic Region between Two Isolates of Rice Stripe Virus RNA4
WEI Tai-yun,LIN Han-xin,WU Zu-jian,LIN Qi-ying,XIE Lian-hui
(Institute of Plant Virology of Fujian Agricultural University,Key Laboratory of
Plant Virology of Fujian Province,Fuzhou 350002,China)
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Abstract:The RNA4 intergenic regions of two isolates of rice stripe virus (RSV) in China (de-signated as RSV-JN and RSV-YL) were amplified by RT-PCR and cloned into pGEM-T easy vector.Sequence analysis showed that they were all 654 bp in length,and shared only 92% identity at the nucleotide level.Computer-assisted folding analysis showed that the intergenic region was rich in A and U residues where two distant hairpin structures could be formed.One was highly conserved and stable,but the other was rather unstable because of bases variation.Therefore,there were molecular variation among isolates of rice stripe virus in China.
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Key words:Rice stripe virus; RNA4 intergenic regions; Sequence comparison
水稻条纹叶枯病是中国、日本、朝鲜及远东地区水稻上的一种重要的病毒病。在我国，该病从南到北广泛分布于十六个省市，曾造成严重的损失，至今仍在云南各地区猖獗危害[1]，其病原为水稻条纹病毒(rice stripe virus,RSV)，是纤细病毒属(Tenuivirus)的典型成员，其基因组由4个ssRNA片段组成。除RNA1采用负链编码策略外，RNA2、RNA3和RNA4均采取双义编码策略(ambisense coding strategy)。RSV可能编码的蛋白中，现已证实RNA3负链编码病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)，RNA4正链编码病害特异性蛋白(disease-specific protein,SP)[2～5]。
日本学者根据各分离物的致病性以及SP分子量的差异，已划分出鸿巢、P、N、T、M等多个株系[3，6]。其中，T株系的全序列已测定，M株系也测定了RNA3、4两个片段的序列。RNA4序列比较发现，T株系的IR比M株系多了一个19bp的插入序列，RNA4 IR存在U和A碱基富集带及可能的发夹结构[2，3，8，9]。由于IR的发夹结构可能具有终止mRNA转录及保持ssRNA稳定性的作用，又易于突变，所以被认为具有重要的功能[3，7]。
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我国地域辽阔，地理生态多样性丰富，各地区的RSV之间极可能存在分子变异或株系分化。为此，本研究选择我国RSV的山东济宁(JN)、云南宜良(YL)两个分离物，通过比较分析其RNA4 IR的序列，为进一步研究我国RSV的分子变异或株系分化及IR等调控元件在病毒基因组双义表达过程中的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 病毒 为本所采自山东济宁、云南宜良、经分离纯化并保存于合系28水稻品种上的RSV JN、YL两个分离物。
1.2 引物 根据Kakutani等[8]报道的RSV RNA4的基因序列，设计一对用于扩增RNA4 IR的寡聚核苷酸引物，引物由上海植物生理研究所合成，序列如下：
P1：5′CCAACCTCTTCTACACAAGAC3′(与RNA4 5′端567～587bp相对应)；
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P2：5′GTAGGTGAGATAACCAGTTCC3′(与RNA4 5′端1208～1228bp互补)。
1.3 病毒提纯 参照Ishikawa等[10]的方法，略作修改。
1.4 病毒RNA的提取 根据Toriyama等[11]的方法，略作改进。提纯的病毒经SDS、蛋白酶K处理，酚-氯仿抽提得到病毒RNA，经紫外测定浓度为0.52μg/μL。
1.5 cDNA合成及PCR扩增 1.0μg病毒RNA模板和10pmol/L的3′端引物先在95℃处理10min，再按Promega公司的cDNA合成试剂盒说明书进行cDNA第一条链的合成。PCR扩增是在50μL反应体系中进行，包括反转录产物2μL、P1和P2(10pmol/L)各5μL、dNTP(每份10mmol/L) 1μL、10×buffer 5μL、DDW 28μL、MgCl2(25mmol/L) 3μL、Taq DNA聚合酶(4u/μL,MBI公司产品) 1μL。采用双退火温度进行扩增：前5个循环，94℃变性1min、30℃退火2min、72℃延伸2min；后25个循环，除退火温度改为37℃外，其余同前。最后一个循环结束后，72℃保温10min。
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1.6 克隆及测序 PCR产物在1.5%琼脂糖上电泳后，切取目的基因片段，用QIAEXⅡ Gel Extration Kit(QIAGEN公司产品)回收后，直接连接于pGEM-T easy载体(Promega公司产品)上的克隆位点，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选、PCR扩增及EcoRI酶切分析鉴定插入片段。DNA测序由上海基康生物技术有限公司在ABI 377型DNA测序仪上进行。
1.7 核苷酸序列分析 用DNASIS软件(Hitachi software Engineering Co.Ltd)进行序列分析。
2 结果与分析
2.1 RT-PCR扩增
提取的病毒RNA经RT-PCR扩增后，RSV的JN和YL两个分离物都得到一个长度约为680bp的扩增片段，与预期的662bp的扩增片段相近(图1)。
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2.2 重组质粒的筛选和鉴定
扩增产物经纯化后克隆到pGEM-T easy载体上，经蓝白斑筛选、PCR检测及EcoRI酶切分析鉴定后，证实所得到的克隆均为含有插入片段的重组子，JN和YL两个分离物RNA4 IR的克隆分别命名为pTE-JN、pTE-YL，因为EcoR I酶切位点分别位于pGEM-T easy载体上的52nt、70nt处，故酶切片段比RT-PCR扩增片段长19bp，达到700bp左右(图2)。
图1 1.5%琼脂糖电泳检测RT-PCR扩增结果
M:DNA marker ladder;
1:RSV-JN RNA4基因间隔区RT-PCR产物；
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Fig.1 1.5% Agarose gel electrophoresis
of RT-PCR product
M:DNA marker ladder;
Lane 1:product of RT-PCR of RSV-JN RNA4 IR;
Lane 2:product of RT-PCR of RSV-YL RNA4 IR.
图2 重组质粒的EcoRⅠ酶切鉴定
M:DNA marker ladder; 1:pGEM-T easy载体；
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2-3:重组质粒pTE-JN、pTE-YL；
4:EcoRⅠ酶切pGEM-T easy载体；
5-6:EcoRⅠ酶切pTE-JN、pTE-YL。
Fig.2 Identification of recombinant plasmid
digested by EcoRⅠ
M:DNA marker ladder;
Lane 1:pGEM-T easy vector;
Lane 2-3:recombinant plasmid pTE-JN、pTE-YL;
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Lane 4:pGEM-T easy vector/EcoRⅠ;
Lane 5-6:pTE-JN/EcoRⅠ、pTE-YL/EcoRⅠ.
2.3 基因间隔区核酸序列分析
核酸序列分析结果表明：JN、YL两个分离物RNA4 IR均含有654个核苷酸，与日本报道的T分离物RNA4 IR核苷酸数目相同，但和M分离物RNA4 IR相比多了一段19bp的插入片段。插入片段的序列均为5′CAUAGAAACAUGAGAGUAU3′；和T分离物的插入片段(5′CAUAGAAACAUGAGAGCAU3′)相比有一个碱基的差异。另外，JN和T分离物的插入片段位置均在第296～314nt之间，而YL分离物的插入位置在第299～317nt之间(图3)。DNASIS软件分析结果表明：JN、YL、T 3个分离物RNA4 IR序列之间的同源率均为92%，而JN、YL与M分离物之间的同源率均为87%左右(图3)。RNA二级结构预测分析发现，JN、YL分离物RNA4 IR和T、M分离物一样，在AU碱基富集处可形成两个明显的发夹结构，其中JN、T分离物在第326～361nt、YL分离物在第329～362nt、M分离物在第313～334nt(图3第一条下划线处)可形成发夹结构，这个区段由于碱基变异较大，形成的发夹结构很不稳定。一般而言，发夹结构的最低自由能越低，结构越稳定。JN、YL、M与T四个分离物在这一区段序列所形成的发夹结构所预测的最低自由能(ΔG)分别为0.84kj、-3.4kj、-7.14kj和-36kj，很明显，这一区段序列所形成的发夹结构中，T分离物最为稳定。对T分离物而言，JN分离物在第328nt处有U→G碱基突变、在第349nt处有A→U碱基突变；YL分离物第335～336nt处有两个A碱基缺失突变、在第349nt处有A→U碱基突变；M分离物在第351nt处有U→C碱基突变、在第361nt处有G→A碱基突变。显然，各个分离物在这一区段序列所形成的发夹结构的稳定性不同是由这些碱基突变所致。JN、YL和T3个分离物在第420～463nt、M分离物在第400～461nt(图3第二条下划线处)可形成另一发夹结构，这一段序列比较保守，形成的发夹结构稳定，其最低自由能(ΔG)为-160kj，M分离物在这一区段虽有两个碱基的缺失突变(相对于T分离物，在第448-449nt处有UG两个碱基缺失突变)但并没有影响其发夹结构的稳定性(图4)。
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图3 JN、YL、T及M 4个分离物RNA4基因间隔区序列分析比较
-:相同的碱基，*缺失的碱基。单下划线表示两个可能形成发夹结构的核苷酸的位置。波线表示相对于M分离物有一段19bp插入序列的位置。T和M两个分离的序列分别引自Zhu等(1992)、Kakutani等(1990)。
Fig.3 Alignment of nucleotide sequence of RNA4 intergenic region within JN、YL、T、M、4 isolates
-:same nucleotide,*:missed nucleotide.
Single underlines indicate the nucleotide positions of the two predicated hairpin strucures.
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Wavy underline indicates the nucleotide positions of 19-base insertion relative to this region of M isolete.
The nucleotide sequences of T and M isolates from Zhu et al (1992)、Kakutani et al (1990).
图4 RNA4基因间隔区内两个可能的发夹结构
(a)四个分离物中稳定性不同的发夹结构，(b)四个分离物共有的、稳定的发夹结构。
*:茎区的碱基配对，ΔG：最低自由能。(a)标出发夹结构的核苷酸位置(距5′末端)。T和M两个分离物的序列分别引自Zhu等(1992)、Kakutani等(1990)。
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Fig.4 The two predicted hairpin structures in the RNA4 intergenic region
(a) the hairpin structures different in stability among 4 isolates,(b)the same and stable hairpin structures among 4 isolates.
*:base-pairing in the stem region,ΔG:the lowest free energy.The nucleotide positions were showed (from the 5′ termini).The nucleotide sequences of T and M isolates from Zhu et al(1992)、Kakutain et al (1990).
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3 讨论
研究结果表明，各分离物RNA4 IR序列碱基变异较大，同源率不高，在AU碱基富集处可形成两个发夹结构，其中一个序列比较保守，形成的发夹结构稳定，但另一个由于碱基突变造成所形成的发夹结构的稳定性在各个分离物中差异较大。Auperin等[7]认为这种发夹结构对间隔区两旁基因编码区转录终止及ssRNA稳定性有重要作用。Zhu等[3]也提出RSV RNA4 IR可能具有高级的结构，且易于突变，认为正是这种复杂的结构是参与病毒功能的重要因素，并提出RSV RNA4 IR和病毒的生物学性状包括病症可能相关。而RSV RNA4 vRNA上的ORF编码病害特异性蛋白被认为是一种与病症有紧密相关的蛋白[12，13]，是否各个分离物正是通过这种稳定性不同的发夹结构，影响IR两旁ORF的转录终止及ssRNA的稳定性，进而导致其生物学性状差异呢这是值得进一步研究的问题。这个结果启发我们在进行抗病毒转基因工程的研究中，可采取反义RNA策略，以IR的反义RNA封闭其保守序列及茎-环结构，有可能干扰RSV基因组的转录和ssRNA的稳定性，进而提高转基因植物的抗性。
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RSV RNA4 IR在某些区段碱基变异较大，变异的原因可能有两点：(1)PCR扩增时所使用的Taq DNA聚合酶缺乏5′ -3′端矫正功能，大约有0.25%的错配率[14]，这种影响显然是微乎其微的；(2)病毒在与寄主的协同进化过程中受环境选择压力的影响。对采自JN、YL两个分离物RNA4 IR进行了比较，其同源率只有92%，而它们与T分离物RNA4相应区段却同样有92%左右的同源率，前三个RSV分离物RNA4 IR与M分离物RNA4相应区段相比多了19bp的插入序列，都约有87%的同源率。这从一个侧面提示了：(1)JN、YL分离物与T分离物的亲缘关系可能比与M分离物的亲缘关系更为接近；(2)我国RSV各分离物存在分子变异与株系分化。
我国幅员辽阔，各地生态环境千变万化，水稻的耕作制度和品种布局各不相同，这就为RSV产生分子变异和株系分化提供了很好的条件。对其进一步的研究将为揭示RSV的分子演化规律提供依据。
国家自然科学基金资助项目(39670489);福建省自然科学基金资助项目(C97031)
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魏太云(1975-),男,福建省福清市人,硕士研究生.研究方向为植物病毒学.
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1999-03-03
1999-07-29, 百拇医药