脂质体包裹鼠疫菌VW-aEV76paris株家兔免疫血清的体外杀菌作用研究
作者：裴秀英 张 涛 刘银花 俞 红
单位：裴秀英 宁夏医学院免疫研究室 750004；张 涛 宁夏地方病防治研究所 750004；刘银花 俞 红 宁夏卫生学校 750021
关键词：菌苗；VWaEV76paris株；脂质体；杀菌作用
宁夏医学杂志/990401 【摘要】 目的 观察清除了45MD质粒的巴黎EV76菌株的家兔免疫血清的体外杀菌作用。方法 家兔行背部皮下注射免疫；F1抗体滴度用间接血凝试验标定；体外杀菌试验采用平板活菌计数。结果 用脂质体包裹的VWaEV76paris株免疫家兔，家兔体内可产生杀菌性抗体，该抗体的杀菌效果明显优于单独以EV兰活菌苗的血清抗体，但在接种部位易形成肉芽肿病灶。结论 脂质体包裹的VWaEV76paris家兔免疫血清具有较强的杀菌作用。
, http://www.100md.com
Bactericidal activity in vitro of rabbit immune serum against
VW-aEV76paris coated liposome
Pei Xiuying，Zhang Tao，Liu Yinhua，et al
(Dept.of Immunology，Ningxia Med.Coll.)
【Abstract】 Objectives To observe the bactericidal activity in vitro of rabbit immune serum against VW-aEV76paris coated liposome.Methods The titer of antibody F1 was tested in indirect hemagglutination.And the viable bacteria counts in medium were caculated as the index of serum bactericidal activity in vitro.Results The rabbits injected VW-aEV76paris was able to produce antibody against Y.pestis. The antibody had stronger bactericidal activity than that of the ordinary alive EV vaccine.Conclusion The rabbit immune serum against VW-aEV76paris coated liposome has stronger bactericidal activity
, 百拇医药
【Key words】 Vaccine；VW-aEV76paris strain of Y pestis；Liposomes；Bactericidal，activity
长期以来，我国生产的兰州EV菌苗株(EV兰)，虽然在实验模型上仍然表现为优良的菌苗，但对人体的保护效果不能令人满意，而巴黎EV76株相对残余毒力较高〔1〕。用脂质体包裹虽可增强EV菌苗的免疫效果〔2〕，但EV兰活菌苗皮下接种也存在毒力恢复的可能性和一定的危险性。因此，寻找一种安全强效的减毒菌株作为菌苗是十分必要的。本文用消除了45MD质粒的巴黎EV76株(VW-aEV76paris)，经脂质体包裹后皮下免疫家兔，观察其能否产生高效价抗体及抗体的抗菌效果，从而判断用脂质体来改善减毒后的EV76paris株的免疫效果的可能性。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株：鼠疫菌EV76paris株由卫生部生物制品检定所生产，VW-aEV76paris株由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所制备〔3〕，斜面保存；商品EV兰活菌苗由兰州生物制品所生产。
1.1.2 动物：家兔由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所动物室提供，体重约2kg。
1.1.3 脂质体：按王淑纯〔2〕所提供的方法制备。
1.1.4 F1抗原致敏血球：兰州生物制品研究所生产。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 包被脂质体：取VW-aEV76paris菌株和EV兰菌株48hr斜面培养物，分别用生理盐水配制成10亿菌/ml的菌悬液，连续×10倍稀释，计算活菌数。吸取108菌/ml的稀释液1ml，加入等量的脂质体(200mg/ml)乳浊液(EV兰对照组加入等量生理盐水)，在多用振荡器上振荡5分钟，使其充分混匀。
1.2.2 免疫：家兔8只，随机分成4组，每组2只，分别取脂质体包被的VW-aEV76paris株、脂质体包被的EV兰菌株EV兰菌株和生理盐水各0.5ml，背部皮下注射。每只家兔疫两次，间隔1周。
1.2.3 抗血清制备：于第二次免疫后15天、30天、60天和90天行家兔心脏采血，4℃分离血清，分装0.9ml/管。
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1.2.4 体外杀菌试验：用EV76paris菌48hr斜面培养物为指示菌，于每只血清管中分别加入104菌/ml的菌悬液0.1ml，并作复管，立即取样涂布平板作为试验开始时的活菌数。将上述试验管置37℃培养24hr后再取样涂布平板，计算活菌数。将两个菌量的对数差列入统计，并计算增长速度。
1.2.5 间接血凝试验：按常规方法进行，测定上述血清标本中F1特异性抗体的增长情况。
2 结果
2.1 体外杀菌试验：指示菌24hr后平均增长倍数(见表1)。
表1 各组家兔免疫血清体外杀菌作用的比较 组别
免疫后时间(d)
, http://www.100md.com 15
30
90
未免疫
活菌数对数差(
±s)
4.36±0.31
4.01±0.21
3.91±0.30
平均增长倍数
2.2×104
1.02×104
, 百拇医药
9.1×103
EV兰+生理盐水
活菌数对数差(±s)
2.81±0.38
3.76±0.35
3.83±0.23
平均增长倍数
6.4×102
5.7×103
5.7×103
, 百拇医药
EV兰+脂质体
活菌数对数差(±s)
1.67±0.42
2.13±0.29
3.38±0.45
平均增长倍数
4.6×10
1.34×102
2.3×103
VW-aEV76paris+脂质体
, 百拇医药
活菌数对数差(±s)
1.72±0.40
2.11±0.30
3.57±0.39
平均增长倍数
5.2×10
1.28×102
3.7×103
虽然各试管中指示菌的数量均有增长，但在免疫后一段时间内，免疫动物各管中的指示菌的增长速度远低于未免疫对照管，说明存在杀菌抗体。方差分析表明，脂质体包被的VW-aEV76paris株和EV兰菌株免疫后15d所产生的抗血清，其杀菌效果显著优于单纯用EV兰活菌苗的免疫血清(P<0.05)，至免疫后30d，EV兰活菌苗免疫血清中指示菌的生长速度已和未免疫组没有明显的区别(P>0.05)，但脂质体包被的VW-aEV76paris株和EV兰菌株的免疫血清仍具有显著的杀菌效果(P<0.05)。免疫后90d，各免疫组已不能显示明显的杀菌作用(P>0.05)，F1抗体滴度亦明显下降。实验上免疫后60d，统计学上的差异已不显著(资料未列出)。
, 百拇医药
2.2 F1抗体滴度(见表2)表2 F1抗体滴度 抗原
免疫时间
(d)
血清
(份)
抗体滴度
GMT
1：20
1：40
1：80
1：160
1：320
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1：640
1：1280
1：2560
EV兰+脂质体
15
4
2
2
1810.19
VW-aEV76+脂质体
15
4
, 百拇医药
2
2
1810.19
EV兰+生理盐水
15
4
1
3
190.27
EV兰+脂质体
30
4
4
, 百拇医药
1280.00
VW-aEV76+脂质体
30
4
3
1
1522.19
EV兰+生理盐水
30
4
1
2
, 百拇医药
1
160.00
EV兰+脂质体
90
4
1
2
1
40.00
VW-aEV76+脂质体
90
4
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3
1
47.57
EV兰+生理盐水
90
4
4
20.00
抗体滴度与杀菌能力虽不完全平行，但也可看出，在免疫后30d脂质体包被菌株的免疫血清中，抗体滴度明显高于单纯用EV兰活菌苗免疫血清的滴度(P<0.05)，但发现脂质体包被的VW-aEV76paris菌株免疫的家兔，在接种部位出现肉芽肿样的结节，经病理切片证实。
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3 讨论
研究表明，鼠疫菌在体内的侵袭力和毒力与6MD、45MD和65MD质粒以及和Irp2基因有关〔4〕。45MD质粒介导了在37℃Ca缺乏培养基上鼠疫菌分裂繁殖的停止〔5〕，而选择性地合成了Yops基因编码的10种外膜蛋白和V抗原〔6〕，在Yops蛋白中，除Yopm外，都具有破坏其核靶细胞的作用〔7〕。在不利环境下，Yops蛋白表现出与宿主细胞间竞争铁及其它必需物质的特性。而V抗原是一种免疫抑制剂，能在体内相对抑制IFN-γ和α-TNF的产生，导致机体免疫系统相对减弱，从而造成鼠疫菌在体内的侵袭扩散〔8〕，引起菌血症，造成动物死亡。去除了45MD质粒的VW-a菌株毒力减弱，对各种实验动物均不致死〔9〕。用其免疫家兔和小鼠，发现动物血清抗体较EV兰株早1周出现阳性，且不产生菌血症，但在皮下出现了较大结节，脂质体作为载体，能将低毒的菌株运载到中心免疫器官，作为菌体抗原起到免疫作用〔10〕，但局部肉芽肿的形成，限制了被脂质体包裹的鼠疫弱毒株向血液的释放，要解决这一问题，还有待于进一步的研究。
, 百拇医药
本实验研究表明，家兔的鼠疫菌免疫血清在体外确实能杀伤鼠疫杆菌，这种杀菌作用是由补体介导的〔11〕。用脂质体包裹的VW-aEV76paris株和EV兰株均较单纯的EV兰活菌苗的免疫效果好，说明脂质体能增强鼠疫菌菌免疫效果，这在对抗大剂量鼠疫菌感染时有较强的保护作用。脂质体包裹的VW-aEV76paris株较EV兰株早出现抗体，其体外杀菌效果至少不弱于脂质体包裹的EV兰菌株，且较EV兰菌株安全，这在新菌苗的研制上很有意义，但其易形成皮下结节却是需要进一步解决的问题。
4 参考文献
1 俞东征，等.EV76paris菌在小鼠体内存活时间的观察.中国地方病防治杂志，1989，4(4)：162
, 百拇医药
2 王淑纯，等.用脂质体包裹鼠疫菌F1抗原和EV兰活菌苗免疫动物抗体动态观察.中华流行病学杂志，鼠疫论文专辑.1987
3 吴明寿，等.脂质体包裹鼠疫菌VW-aEV76paris株对小鼠主动保护作用的实验研究.中国地方病防治杂志，1994，4(3)：141
4 Lindler L E ，et al.Y.pestis pH6 antigen forms fimbriae and is induced by intracellular association with macrophages.Mol Microbiol，1993，8：311～324
5 Charnetzky W.T，R.R. Brubaker.RNA synthesis in yersinia pestis during growth restriction in calcium deficient medium ， J Bacteriol，1982，149：1089～1095
, http://www.100md.com
6 Mehigh R J,et al.Expression of the low-calcium response in Y pestis. Micro Pathog，1989，6：203～217
7 Straley S.C.，et al.Regulation by Ca in the yersinia low-Ca response.Mol Microbiol，1993，8：1005～1010
8 Nakajima，et al.Association between virulence of Y.pestis suppression of gamma interferon and tumor necrosis factor alpha.Infect Immune，1993，61：23～31
9 Higuchi,et al.Studies on the nutrition and physiology of pasteurella pestis. J Bacteriol,1959，77：317
10 李维东，等.中国地方病防治杂志，1991，6(第三届全国鼠疫学术会论文集)：97
11 高明，等.免疫血清对鼠疫杆菌的杀伤作用.中华流行病学杂志，1986，7：149
责编：杨自革
(收稿：1998—11—20), 百拇医药
单位：裴秀英 宁夏医学院免疫研究室 750004；张 涛 宁夏地方病防治研究所 750004；刘银花 俞 红 宁夏卫生学校 750021
关键词：菌苗；VWaEV76paris株；脂质体；杀菌作用
宁夏医学杂志/990401 【摘要】 目的 观察清除了45MD质粒的巴黎EV76菌株的家兔免疫血清的体外杀菌作用。方法 家兔行背部皮下注射免疫；F1抗体滴度用间接血凝试验标定；体外杀菌试验采用平板活菌计数。结果 用脂质体包裹的VWaEV76paris株免疫家兔，家兔体内可产生杀菌性抗体，该抗体的杀菌效果明显优于单独以EV兰活菌苗的血清抗体，但在接种部位易形成肉芽肿病灶。结论 脂质体包裹的VWaEV76paris家兔免疫血清具有较强的杀菌作用。
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Bactericidal activity in vitro of rabbit immune serum against
VW-aEV76paris coated liposome
Pei Xiuying，Zhang Tao，Liu Yinhua，et al
(Dept.of Immunology，Ningxia Med.Coll.)
【Abstract】 Objectives To observe the bactericidal activity in vitro of rabbit immune serum against VW-aEV76paris coated liposome.Methods The titer of antibody F1 was tested in indirect hemagglutination.And the viable bacteria counts in medium were caculated as the index of serum bactericidal activity in vitro.Results The rabbits injected VW-aEV76paris was able to produce antibody against Y.pestis. The antibody had stronger bactericidal activity than that of the ordinary alive EV vaccine.Conclusion The rabbit immune serum against VW-aEV76paris coated liposome has stronger bactericidal activity
, 百拇医药
【Key words】 Vaccine；VW-aEV76paris strain of Y pestis；Liposomes；Bactericidal，activity
长期以来，我国生产的兰州EV菌苗株(EV兰)，虽然在实验模型上仍然表现为优良的菌苗，但对人体的保护效果不能令人满意，而巴黎EV76株相对残余毒力较高〔1〕。用脂质体包裹虽可增强EV菌苗的免疫效果〔2〕，但EV兰活菌苗皮下接种也存在毒力恢复的可能性和一定的危险性。因此，寻找一种安全强效的减毒菌株作为菌苗是十分必要的。本文用消除了45MD质粒的巴黎EV76株(VW-aEV76paris)，经脂质体包裹后皮下免疫家兔，观察其能否产生高效价抗体及抗体的抗菌效果，从而判断用脂质体来改善减毒后的EV76paris株的免疫效果的可能性。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株：鼠疫菌EV76paris株由卫生部生物制品检定所生产，VW-aEV76paris株由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所制备〔3〕，斜面保存；商品EV兰活菌苗由兰州生物制品所生产。
1.1.2 动物：家兔由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所动物室提供，体重约2kg。
1.1.3 脂质体：按王淑纯〔2〕所提供的方法制备。
1.1.4 F1抗原致敏血球：兰州生物制品研究所生产。
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1.2 方法
1.2.1 包被脂质体：取VW-aEV76paris菌株和EV兰菌株48hr斜面培养物，分别用生理盐水配制成10亿菌/ml的菌悬液，连续×10倍稀释，计算活菌数。吸取108菌/ml的稀释液1ml，加入等量的脂质体(200mg/ml)乳浊液(EV兰对照组加入等量生理盐水)，在多用振荡器上振荡5分钟，使其充分混匀。
1.2.2 免疫：家兔8只，随机分成4组，每组2只，分别取脂质体包被的VW-aEV76paris株、脂质体包被的EV兰菌株EV兰菌株和生理盐水各0.5ml，背部皮下注射。每只家兔疫两次，间隔1周。
1.2.3 抗血清制备：于第二次免疫后15天、30天、60天和90天行家兔心脏采血，4℃分离血清，分装0.9ml/管。
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1.2.4 体外杀菌试验：用EV76paris菌48hr斜面培养物为指示菌，于每只血清管中分别加入104菌/ml的菌悬液0.1ml，并作复管，立即取样涂布平板作为试验开始时的活菌数。将上述试验管置37℃培养24hr后再取样涂布平板，计算活菌数。将两个菌量的对数差列入统计，并计算增长速度。
1.2.5 间接血凝试验：按常规方法进行，测定上述血清标本中F1特异性抗体的增长情况。
2 结果
2.1 体外杀菌试验：指示菌24hr后平均增长倍数(见表1)。
表1 各组家兔免疫血清体外杀菌作用的比较 组别
免疫后时间(d)
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30
90
未免疫
活菌数对数差(
±s)4.36±0.31
4.01±0.21
3.91±0.30
平均增长倍数
2.2×104
1.02×104
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9.1×103
EV兰+生理盐水
活菌数对数差(
±s)2.81±0.38
3.76±0.35
3.83±0.23
平均增长倍数
6.4×102
5.7×103
5.7×103
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EV兰+脂质体
活菌数对数差(
±s)1.67±0.42
2.13±0.29
3.38±0.45
平均增长倍数
4.6×10
1.34×102
2.3×103
VW-aEV76paris+脂质体
, 百拇医药
活菌数对数差(
±s)1.72±0.40
2.11±0.30
3.57±0.39
平均增长倍数
5.2×10
1.28×102
3.7×103
虽然各试管中指示菌的数量均有增长，但在免疫后一段时间内，免疫动物各管中的指示菌的增长速度远低于未免疫对照管，说明存在杀菌抗体。方差分析表明，脂质体包被的VW-aEV76paris株和EV兰菌株免疫后15d所产生的抗血清，其杀菌效果显著优于单纯用EV兰活菌苗的免疫血清(P<0.05)，至免疫后30d，EV兰活菌苗免疫血清中指示菌的生长速度已和未免疫组没有明显的区别(P>0.05)，但脂质体包被的VW-aEV76paris株和EV兰菌株的免疫血清仍具有显著的杀菌效果(P<0.05)。免疫后90d，各免疫组已不能显示明显的杀菌作用(P>0.05)，F1抗体滴度亦明显下降。实验上免疫后60d，统计学上的差异已不显著(资料未列出)。
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2.2 F1抗体滴度(见表2)表2 F1抗体滴度 抗原
免疫时间
(d)
血清
(份)
抗体滴度
GMT
1：20
1：40
1：80
1：160
1：320
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1：640
1：1280
1：2560
EV兰+脂质体
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4
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1810.19
VW-aEV76+脂质体
15
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EV兰+生理盐水
15
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1
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EV兰+脂质体
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VW-aEV76+脂质体
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EV兰+生理盐水
30
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160.00
EV兰+脂质体
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VW-aEV76+脂质体
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47.57
EV兰+生理盐水
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抗体滴度与杀菌能力虽不完全平行，但也可看出，在免疫后30d脂质体包被菌株的免疫血清中，抗体滴度明显高于单纯用EV兰活菌苗免疫血清的滴度(P<0.05)，但发现脂质体包被的VW-aEV76paris菌株免疫的家兔，在接种部位出现肉芽肿样的结节，经病理切片证实。
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3 讨论
研究表明，鼠疫菌在体内的侵袭力和毒力与6MD、45MD和65MD质粒以及和Irp2基因有关〔4〕。45MD质粒介导了在37℃Ca缺乏培养基上鼠疫菌分裂繁殖的停止〔5〕，而选择性地合成了Yops基因编码的10种外膜蛋白和V抗原〔6〕，在Yops蛋白中，除Yopm外，都具有破坏其核靶细胞的作用〔7〕。在不利环境下，Yops蛋白表现出与宿主细胞间竞争铁及其它必需物质的特性。而V抗原是一种免疫抑制剂，能在体内相对抑制IFN-γ和α-TNF的产生，导致机体免疫系统相对减弱，从而造成鼠疫菌在体内的侵袭扩散〔8〕，引起菌血症，造成动物死亡。去除了45MD质粒的VW-a菌株毒力减弱，对各种实验动物均不致死〔9〕。用其免疫家兔和小鼠，发现动物血清抗体较EV兰株早1周出现阳性，且不产生菌血症，但在皮下出现了较大结节，脂质体作为载体，能将低毒的菌株运载到中心免疫器官，作为菌体抗原起到免疫作用〔10〕，但局部肉芽肿的形成，限制了被脂质体包裹的鼠疫弱毒株向血液的释放，要解决这一问题，还有待于进一步的研究。
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本实验研究表明，家兔的鼠疫菌免疫血清在体外确实能杀伤鼠疫杆菌，这种杀菌作用是由补体介导的〔11〕。用脂质体包裹的VW-aEV76paris株和EV兰株均较单纯的EV兰活菌苗的免疫效果好，说明脂质体能增强鼠疫菌菌免疫效果，这在对抗大剂量鼠疫菌感染时有较强的保护作用。脂质体包裹的VW-aEV76paris株较EV兰株早出现抗体，其体外杀菌效果至少不弱于脂质体包裹的EV兰菌株，且较EV兰菌株安全，这在新菌苗的研制上很有意义，但其易形成皮下结节却是需要进一步解决的问题。
4 参考文献
1 俞东征，等.EV76paris菌在小鼠体内存活时间的观察.中国地方病防治杂志，1989，4(4)：162
, 百拇医药
2 王淑纯，等.用脂质体包裹鼠疫菌F1抗原和EV兰活菌苗免疫动物抗体动态观察.中华流行病学杂志，鼠疫论文专辑.1987
3 吴明寿，等.脂质体包裹鼠疫菌VW-aEV76paris株对小鼠主动保护作用的实验研究.中国地方病防治杂志，1994，4(3)：141
4 Lindler L E ，et al.Y.pestis pH6 antigen forms fimbriae and is induced by intracellular association with macrophages.Mol Microbiol，1993，8：311～324
5 Charnetzky W.T，R.R. Brubaker.RNA synthesis in yersinia pestis during growth restriction in calcium deficient medium ， J Bacteriol，1982，149：1089～1095
, http://www.100md.com
6 Mehigh R J,et al.Expression of the low-calcium response in Y pestis. Micro Pathog，1989，6：203～217
7 Straley S.C.，et al.Regulation by Ca in the yersinia low-Ca response.Mol Microbiol，1993，8：1005～1010
8 Nakajima，et al.Association between virulence of Y.pestis suppression of gamma interferon and tumor necrosis factor alpha.Infect Immune，1993，61：23～31
9 Higuchi,et al.Studies on the nutrition and physiology of pasteurella pestis. J Bacteriol,1959，77：317
10 李维东，等.中国地方病防治杂志，1991，6(第三届全国鼠疫学术会论文集)：97
11 高明，等.免疫血清对鼠疫杆菌的杀伤作用.中华流行病学杂志，1986，7：149
责编：杨自革
(收稿：1998—11—20), 百拇医药