中药病毒宁滴剂抗呼吸道病毒作用的研究
作者：邓学龙 朱宇同 黄真炎 符林春 李玉书 刘 妮 胡英杰 李国桥
单位：邓学龙 朱宇同 符林春 刘 妮 胡英杰 李国桥 广州中医药大学热带医学研究所，广州 510405；黄真炎 广州中医药大学电镜室，广州 510405；李玉书 北京宇维生科贸有限责任公司，北京 100850
关键词：@病毒宁滴剂；药理学；@病毒宁滴剂；投药和剂量；感冒；中药疗法；辛凉解表剂；治疗应用；正粘病毒A型；药物作用；呼吸道合胞病毒；药物作用；鼻病毒属；药物作用；小鼠
广州中医药大学学报990215 摘要：病毒宁滴剂为广州中医药大学热带医学研究所和北京市宇维生科贸技术有限公司联合研制的、主要用于外感风热初起型感冒的中药滴鼻制剂，该药由柴胡、甘草等药组成。为探讨其抗病毒作用，从体内外抗病毒实验对病毒宁滴剂抗呼吸道病毒作用进行了研究。结果显示：在5种培养细胞上病毒宁滴剂20g/L浓度组对7种呼吸道病毒毒株均有明显的抑制病毒致细胞病变的作用。体内试验表明，病毒宁滴剂100g/L浓度滴鼻0.05mL/(鼠.次)，每天2次，对流感病毒引起的小鼠肺炎实变有明显的抑制作用，200g/L、100g/L浓度组能抑制流感病毒增殖(与病毒对照组比较，P<0.05或P<0.01)，200g/L浓度组能延长流感病毒感染的小鼠生存时间。
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中图分类号：R373.1
文献标识码：A
文章编号：1007-3213(1999)02-0130-05
Antiviral Effects of Bingdu Ning Drop in Respiratory Tract
DENG Xuelong1， ZHU Yutong1, HUANG Zhengyan2， FU Linchun1，LI Yushu3， LIU Ni1， HU Yingjie1, LI Guoqiao1
(1.Tropical Medigine Institute, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China; 2.Dept. of Electron Microscope, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405 ,China; 3.Yuwei Bioscience of Beijing Trade Ltd. Co，Beijing 100850， China)
, 百拇医药
Abstract Antiviral effects of Bingdu Ning Drop (BND) in the respiratory tract were studied both in vivo and in vitro. The experiment in vitro showed that BND at the concentration of 20mg/mL obviously inhibited the cytopathy of seven kinds of respiratory tract virus strains cultured in five kinds of culture cells.
Experiments in vivo showed that BND at the concentration of 100g/L for the intranasal treatment (0.05mL twice daily) markedly inhibited the lung consolidation of mice with pneunonitis caused by the infection of influenza virus. BND at the concentrations of 200g/L and 100g/L significantly inhibited the proliferation of influenza virus (P<0.05 or P<0.01) as compared with the control group, and prolonged the survival time of mice infected with influenza virus at the concentration of 200g/L.
, 百拇医药
Key words @BINGDU NING DROP/ pharmacology; @BINGDU NING DROP/AD； COMMON COLD/TCD therapy;
PUNGENT-COOL DIAPHORETIC AGENT/ther. use; ORTHOMYXOVIRUSES TYPE A/drug effects;
RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUSES/drug effects; RHINOVIRUS/drug effects; MICE
引起感冒病因较多，常见如鼻病毒、流感病毒、腺病毒等，而合成药中尚无理想广谱的能消除症状的抗病毒药物问世[1]。病毒宁滴剂是由广州中医药大学热带医学研究所和北京市宇维生科贸技术有限公司联合研制，该药由柴胡、甘草等药组成，具有辛凉解表，宣肺通窍之功效，主要用于外感风热初起，症见恶寒发热，鼻塞，喷嚏，咽干咽痛等。为研究其抗病毒作用，我们选择了包括鼻病毒在内的7种呼吸道病毒，从体外、体内进行了抗病毒作用研究。
, 百拇医药
1 实验材料
1.1 药物 病毒宁滴剂由广州中医药大学热带医学研究所药化制剂室提供，批号 961001，病毒宁所用浓度均按每升相当于含生药量多少克表示。病毒唑由湖北省医工所提供，批号 950303。
1.2 动物 NIH小白鼠由本校实验动物中心提供，批号：医动字第26-026，雌雄不拘，体重14～16g。
1.3 毒种
1.3.1 鼻病毒 鼻病毒R14型由中国医学科学院病毒所分赠。原毒种为美国ATCC提供，在国家鉴定之KMB17 双倍体细胞中传代，于33℃，5%CO2恒温箱培养。
1.3.2 流感病毒 流感病毒FM1株由中国医学科学院医药生物技术研究所提供，于MDCK狗肾细胞传代，以病变及豚鼠红血球血凝法来判断其滴度，在35℃，5%CO2培养箱培养。
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1.3.3 呼吸道合胞病毒 毒种由广州市儿童医院病毒实验室提供，为RSV-N3株，于Hep-2细胞或Hela细胞上扩增，并进行测定。
1.3.4 腺病毒3型 毒种来源同呼吸道合胞病毒，并于Hela细胞上传代，滴定与检测。
1.3.5 疱疹病毒Ⅰ型与Ⅱ型 毒种来源同呼吸道合胞病毒，在BHK细胞上传代与检测。
1.3.6 副流感病毒3型 毒种来源同呼吸道合胞病毒，于Hela细胞及KMB17细胞上用豚鼠红血球血吸附法检测。
1.4 细胞 人肺KMB17原代细胞株第18代，由中国医学科学院昆明生物制品研究所分赠；狗肾细胞株(MDCK)，由广东省防疫站病毒室赠送；地鼠肾细胞株(BHK)，由广州市儿童医院病毒实验室提供；Hep-2细胞和Hela细胞，为本所病毒实验室保存细胞株。
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1.5 免疫血清 用鸡胚尿囊液传代的流感病毒 FM1 株免疫家兔，获得高效价的免疫血清 (血凝抑制效价>1∶1280)，置-40℃冰箱保存，用前测定抗体效价。
1.6 标记抗体 由华美公司的羊抗兔IgG-FITC，置4℃保存，用时以1∶15稀释。
1.7 细胞培养液和维持液 各为含10%、2%小牛血清、100kU/L青霉素、链霉素的DMEM(GIBCOBRL公司产品)。
2 方法
2.1 对病毒致细胞病变的体外抗病毒作用
以上抗病毒试验在96孔微量板上进行，每孔0.1mL，细胞数为5×105个，长成单层后，将病毒宁药液用维持液稀释成不同浓度，抛掉原培养液后将不同浓度病毒宁药液加入细胞孔中，0.1mL/孔，以细胞不出现病变的最小稀释度为该药液对细胞无毒界限。通过毒性试验观察到病毒宁20g/L和病毒唑1g/L浓度对5种细胞生长无明显影响，同时在相应敏感细胞上测定攻击病毒之TCID50。试验时设病毒对照、细胞对照、药物毒性对照及三氮唑核苷(病毒唑)对照，置33℃或37℃CO2培养箱内，每天在倒置显微镜下观察病变并记录。当病毒对照孔细胞出现+++病变时，继续观察4d则终止。细胞出现病变的程度按以下6级标准记录：-：细胞生长正常，无病变出现；±：细胞病变少于整个单层细胞的10%；+：细胞病变约占整个单层细胞的25%；++：细胞病变约占整个单层细胞的50%；+++：细胞病变约占整个单层细胞的75%；++++：细胞病变约占整个单层细胞的75%以上。
, 百拇医药
2.2 对小鼠流感病毒性肺炎的影响
将体重为14～16g的NIH小鼠随机分组，药物组于感染前1d开始滴鼻给药，0.05mL/次，2次/d，连续5d，对照组给予同容积蒸馏水滴鼻。各组在乙醚轻度麻醉下感染流感病毒鼠肺适应株FM115LD50，感染后96h处死，称体重后取肺称重，逐个算出肺指数值(每100g体重的肺质量，即肺指数=肺质量/体重×100)和肺指数抑制率[(病毒对照组平均肺指数-实验组平均肺指数)/病毒对照组平均肺指数×100%]，与对照组比较进行组间t检验。
2.3 对小鼠体内流感病毒增殖的影响
在乙醚轻度麻醉下以流感病毒FM11000LD50量感染小鼠，人工感染前1d开始滴鼻给药，2次/d， 0.05mL/只。在感染后48h，解剖取肺，固定，制成组织切片，脱腊，先以 FM1兔免疫血清(HAI 1∶1280)浸染，冲洗后再加1∶15稀释的羊抗兔IgG荧光抗体(华美生物工程公司生产)，于荧光显微镜下观察整个切片所有的细支气管数量，计算含有特异性荧光颗粒的细支气管数量，计算各组细支气管内含特异性荧光颗粒百分率(出现特异性荧光颗粒的细支气管数量/计数的细支气管总数×100%)，荧光阳性率高表明病毒颗粒增殖多，并进行统计学处理[7]。
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2.4 对小鼠体内感染流感病毒的死亡保护和延长病鼠生命的作用
将小鼠随机分为病毒对照组和病毒宁200g/L组，分别以FM12LD50滴鼻感染，给药组自感染病毒前1d开始到感染后4d，共滴鼻给药0.05mL/次，2次/d，病毒对照组滴鼻给予等量蒸馏水，逐日观察动物发病和记录死亡数，共观察14d，计算死亡保护率[(对照组死亡率-给药组死亡率)×100%]、延长生命率[(给药组平均存活日数-对照组平均存活日数)/对照组平均存活日数×100%]。
3 结果
3.1 对病毒致细胞病变的体外抗病毒作用
表1结果表明：在病毒宁20g/L浓度下，即较临床应用浓度稀释5倍情况下仍可对鼻病毒、流感病毒产生较好的抑制病变作用，较病毒唑更具广谱作用。该实验重复2次，结果与表1完全一致。
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3.2 对小鼠流感病毒性肺炎的影响
表2结果表明：病毒宁组按100g/L浓度每次滴鼻0.05mL,2次/d的剂量对小鼠流感病毒性肺炎有显著治疗作用，其疗效优于1.05g/L病毒唑组的。
3.3 对小鼠体内流感病毒增殖的影响
表3结果表明：病毒对照组出现特异性荧光率为61%，而病毒宁200g/L和100g/L组荧光率分别为9.5%与20%(P<0.01)，且呈量效关系；病毒唑(1.05g/L)滴鼻亦有一定抑制作用，但效果不如病毒宁明显。
3.4 对小鼠体内感染流感病毒的死亡保护和延长病鼠生命的作用
表4结果表明：病毒宁200g/L组对小鼠体内感染流感病毒有死亡保护和延长病鼠生命的作用。
, 百拇医药
4 讨论
呼吸道病毒感染首先入侵鼻咽、口咽、喉部和扁桃体的局部粘膜和粘膜下，在这些部位复制并释放病毒颗粒和毒素而引起感冒症状。由于仅引起呼吸道局部表面感染，除腺病毒外，所产生的抗体量少，故再感染经常发生[2]。因此直接在鼻咽和口咽部给予抗病毒滴剂药物，可以直接作用于感染靶位，收到较好的疗效，给药剂量较口服途径小数十到数百倍，方便实用且有宣通开窍，消除症状的作用。我国自古代就有许多局部鼻咽给药的报道[3]，但目前尚未有类似抗感
表2 病毒宁对小鼠流感病毒性肺炎的作用 组 别
N/只
ρ浓度/
(g.L-1)
, 百拇医药
K肺指数值/
(
±s)
p抑制/%
病毒对照
8
-
1.58±0.47
-
正常对照
10
-
, 百拇医药 0.94±0.10
-
病毒唑
12
1.05
1.17±0.26
25.95*
病毒宁
11
100
1.00±0.19
36.71**
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病毒宁
15
50
1.20±0.38
24.05*
病毒对照
9
-
1.73±0.46
-
正常对照
9
-
, 百拇医药
1.02±0.29
-
病毒唑
9
1.05
1.21±0.23
30.06*
病毒宁
10
100
1.17±0.34
32.37**
, 百拇医药
病毒宁
10
50
1.43±0.50
17.34
病毒宁
9
25
1.63±0.56
5.78
*与病毒对照组比较P<0.05，**P<0.01表3 病毒宁对流感病毒增殖的影响 组 别
N动物/
, 百拇医药
只
ρ浓度/
(g*L-1)
N有/
条
N无/
条
N总/
条
p/%
χ2
P值
, 百拇医药
病毒对照
11
-
202
131
333
61
-
-
病毒宁
12
200
38
361
, 百拇医药
399
9.5
215
<0.01
病毒宁
12
100
80
314
394
20
123
<0.01
, 百拇医药
病毒唑
12
1.05
174
228
402
43
20
<0.01
N有：含有特异性荧光颗粒的细支气管数量；N无：没有特异性荧光颗粒的细支气管数量；N总：各组细支气管总数；p=N有/N总表4 病毒宁对小鼠体内感染流感病毒
, 百拇医药
的死亡保护作用 组 别
N总/
只
N死亡/
只
p死亡/%
p死亡保护/%
t平均存活/d
病毒对照组
10
8
80
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-
10.7
病毒宁
200g/L组
10
3
30
50*
13.5**
*与病毒对照组比较P<0.05， **P<0.01表1 病毒宁对病毒致病变抑制作用 病 毒 株
靶细胞
XTCLD50
, 百拇医药
不同质量浓度(ρ)对病毒的抑制作用
ρ1=20g.L-1
ρ2=10g.L-1
ρ3=5g.L-1
ρ4=1g.L-1
鼻病毒R14型
KMB17
30
, 百拇医药 +
+
+
-
流感病毒A型FM1
MDCK
100
+
-
-
+
呼吸道合胞病毒
Hep-2
, 百拇医药
100
+
+
+
+
腺病毒3型
Hela
100
+
±
-
-
疱疹病毒Ⅰ型
BHK
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100
+
+
+
+
疱疹病毒Ⅱ型
BHK
100
+
+
+
-
副流感3型
KMB17
, 百拇医药
100
+
-
-
+
+：表示抑制；±：表示不肯定；-：表示不抑制
冒病毒滴剂在临床应用。
引起感冒等急性上呼吸道感染的主要病毒，除鼻病毒外，尚有腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、肠道病毒的柯萨奇A21、A24、A1-10、ECHO19、20等等。Reed估计50%的感冒为鼻病毒和呼吸道合胞病毒引起，其余则为肠道病毒等所致[4]。我国的感冒病人中除鼻病毒外则以流感病毒感染较为多见，并且呈周期性大流行，严重威胁着人类健康。目前西方和国内临床用于抗A型流感病毒的药物有金刚烷胺(amatadine)、甲基金刚烷胺(rimantadine)、病毒唑(virazole)和干扰素等，前二者可引起中枢性眩晕和迅速耐药毒株的出现[1]；而低剂量口服病毒唑1.0g/d无明显抗病毒作用，大剂量口服对无并发症流感患者退热与症状消除的作用较快[5]，但大剂量口服的毒性较大，且对B型流感无治疗作用；干扰素在预防鼻病毒方面是有效的，而对流感和副流感的感染者的治疗效果，目前看法不一。
, 百拇医药
应用祖国医学中草药治疗流感有数千年历史，临床有效的方药不少，但有许多缺乏现代病毒学实验研究。50～70年代，国内曾用体外方法对大量的中草药进行筛选，有人统计425种中草药在体外细胞水平对流感病毒有抑制作用者达67种，占15.5%[6]。但其后能通过动物体内实验证实有肯定的抑制流感病毒者不多，有明确的现代病毒学实验基础的中药有正柴胡饮[7]、清肺饮[8]、鱼腥草醇提物[9]等。我们的实验结果显示，病毒宁20g/L浓度组在体外细胞水平有广谱抑制呼吸道病毒的作用；体内实验也证明其有抗小鼠流感病毒性肺炎和抑制小鼠体内流感病毒增殖的作用，且呈量效关系；并可延长流感病毒感染小鼠的存活时间。这些都表明病毒宁滴剂对病毒性感冒的病因治疗具有良好的前景，关于其在抗菌消炎、解热镇痛与对免疫系统作用的研究将在另文报导。
作者简介：第一作者，男，助理研究员第一作者，男，助理研究员
参考文献：
, 百拇医药
[1] Wade R C.‘Flu’and structure-based drug design[J].Structure，1997，5(9):1139
[2] 黄祯祥，洪涛，刘崇柏，等主编.医学病毒学基础及实验技术[M].北京：科学出版社，1990.656～657
[3] 程爵容.中医鼻脐疗法[M].北京：人民军医出版社，1993.8～14
[4] 杜平，朱关福，刘湘云，等主编.现代临床病毒学[M].北京：人民卫生出版社，1991.302～309
[5] Stain D S ,Creticos C M, Jackson G G, et al. Antimicrobe agents[J]. Chemother, 1987, 31:1285
, http://www.100md.com [6] 胡起.从国外抗病毒化学药物研究的经验展望我国抗病毒中草药的研究[J].中草药通迅，1978，12：43
[7] 富杭育，卢长安，贺玉琢，等.正柴胡饮对流感病毒和致病菌作用的实验研究[J].中药通报，1986，11(4)：238
[8] 欧敏，杜怀棠，郭元吉，等.清肺饮抗小鼠流感病毒性肺炎的实验研究[J].中华实验和临床病毒学杂志，1996，10(4)：381
[9] Zhu Yutong, Lin Peiru, Zhang Zhongliang, et al.A Chinese vegetable (Houttuynia Cordate, Thunb) can inhibit infection of influenza virus in mice[J].Virus Information Exchange Newsletter, 1992,9(3):102
收稿日期：1998-12-02, 百拇医药
单位：邓学龙 朱宇同 符林春 刘 妮 胡英杰 李国桥 广州中医药大学热带医学研究所，广州 510405；黄真炎 广州中医药大学电镜室，广州 510405；李玉书 北京宇维生科贸有限责任公司，北京 100850
关键词：@病毒宁滴剂；药理学；@病毒宁滴剂；投药和剂量；感冒；中药疗法；辛凉解表剂；治疗应用；正粘病毒A型；药物作用；呼吸道合胞病毒；药物作用；鼻病毒属；药物作用；小鼠
广州中医药大学学报990215 摘要：病毒宁滴剂为广州中医药大学热带医学研究所和北京市宇维生科贸技术有限公司联合研制的、主要用于外感风热初起型感冒的中药滴鼻制剂，该药由柴胡、甘草等药组成。为探讨其抗病毒作用，从体内外抗病毒实验对病毒宁滴剂抗呼吸道病毒作用进行了研究。结果显示：在5种培养细胞上病毒宁滴剂20g/L浓度组对7种呼吸道病毒毒株均有明显的抑制病毒致细胞病变的作用。体内试验表明，病毒宁滴剂100g/L浓度滴鼻0.05mL/(鼠.次)，每天2次，对流感病毒引起的小鼠肺炎实变有明显的抑制作用，200g/L、100g/L浓度组能抑制流感病毒增殖(与病毒对照组比较，P<0.05或P<0.01)，200g/L浓度组能延长流感病毒感染的小鼠生存时间。
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中图分类号：R373.1
文献标识码：A
文章编号：1007-3213(1999)02-0130-05
Antiviral Effects of Bingdu Ning Drop in Respiratory Tract
DENG Xuelong1， ZHU Yutong1, HUANG Zhengyan2， FU Linchun1，LI Yushu3， LIU Ni1， HU Yingjie1, LI Guoqiao1
(1.Tropical Medigine Institute, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China; 2.Dept. of Electron Microscope, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405 ,China; 3.Yuwei Bioscience of Beijing Trade Ltd. Co，Beijing 100850， China)
, 百拇医药
Abstract Antiviral effects of Bingdu Ning Drop (BND) in the respiratory tract were studied both in vivo and in vitro. The experiment in vitro showed that BND at the concentration of 20mg/mL obviously inhibited the cytopathy of seven kinds of respiratory tract virus strains cultured in five kinds of culture cells.
Experiments in vivo showed that BND at the concentration of 100g/L for the intranasal treatment (0.05mL twice daily) markedly inhibited the lung consolidation of mice with pneunonitis caused by the infection of influenza virus. BND at the concentrations of 200g/L and 100g/L significantly inhibited the proliferation of influenza virus (P<0.05 or P<0.01) as compared with the control group, and prolonged the survival time of mice infected with influenza virus at the concentration of 200g/L.
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Key words @BINGDU NING DROP/ pharmacology; @BINGDU NING DROP/AD； COMMON COLD/TCD therapy;
PUNGENT-COOL DIAPHORETIC AGENT/ther. use; ORTHOMYXOVIRUSES TYPE A/drug effects;
RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUSES/drug effects; RHINOVIRUS/drug effects; MICE
引起感冒病因较多，常见如鼻病毒、流感病毒、腺病毒等，而合成药中尚无理想广谱的能消除症状的抗病毒药物问世[1]。病毒宁滴剂是由广州中医药大学热带医学研究所和北京市宇维生科贸技术有限公司联合研制，该药由柴胡、甘草等药组成，具有辛凉解表，宣肺通窍之功效，主要用于外感风热初起，症见恶寒发热，鼻塞，喷嚏，咽干咽痛等。为研究其抗病毒作用，我们选择了包括鼻病毒在内的7种呼吸道病毒，从体外、体内进行了抗病毒作用研究。
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1 实验材料
1.1 药物 病毒宁滴剂由广州中医药大学热带医学研究所药化制剂室提供，批号 961001，病毒宁所用浓度均按每升相当于含生药量多少克表示。病毒唑由湖北省医工所提供，批号 950303。
1.2 动物 NIH小白鼠由本校实验动物中心提供，批号：医动字第26-026，雌雄不拘，体重14～16g。
1.3 毒种
1.3.1 鼻病毒 鼻病毒R14型由中国医学科学院病毒所分赠。原毒种为美国ATCC提供，在国家鉴定之KMB17 双倍体细胞中传代，于33℃，5%CO2恒温箱培养。
1.3.2 流感病毒 流感病毒FM1株由中国医学科学院医药生物技术研究所提供，于MDCK狗肾细胞传代，以病变及豚鼠红血球血凝法来判断其滴度，在35℃，5%CO2培养箱培养。
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1.3.3 呼吸道合胞病毒 毒种由广州市儿童医院病毒实验室提供，为RSV-N3株，于Hep-2细胞或Hela细胞上扩增，并进行测定。
1.3.4 腺病毒3型 毒种来源同呼吸道合胞病毒，并于Hela细胞上传代，滴定与检测。
1.3.5 疱疹病毒Ⅰ型与Ⅱ型 毒种来源同呼吸道合胞病毒，在BHK细胞上传代与检测。
1.3.6 副流感病毒3型 毒种来源同呼吸道合胞病毒，于Hela细胞及KMB17细胞上用豚鼠红血球血吸附法检测。
1.4 细胞 人肺KMB17原代细胞株第18代，由中国医学科学院昆明生物制品研究所分赠；狗肾细胞株(MDCK)，由广东省防疫站病毒室赠送；地鼠肾细胞株(BHK)，由广州市儿童医院病毒实验室提供；Hep-2细胞和Hela细胞，为本所病毒实验室保存细胞株。
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1.5 免疫血清 用鸡胚尿囊液传代的流感病毒 FM1 株免疫家兔，获得高效价的免疫血清 (血凝抑制效价>1∶1280)，置-40℃冰箱保存，用前测定抗体效价。
1.6 标记抗体 由华美公司的羊抗兔IgG-FITC，置4℃保存，用时以1∶15稀释。
1.7 细胞培养液和维持液 各为含10%、2%小牛血清、100kU/L青霉素、链霉素的DMEM(GIBCOBRL公司产品)。
2 方法
2.1 对病毒致细胞病变的体外抗病毒作用
以上抗病毒试验在96孔微量板上进行，每孔0.1mL，细胞数为5×105个，长成单层后，将病毒宁药液用维持液稀释成不同浓度，抛掉原培养液后将不同浓度病毒宁药液加入细胞孔中，0.1mL/孔，以细胞不出现病变的最小稀释度为该药液对细胞无毒界限。通过毒性试验观察到病毒宁20g/L和病毒唑1g/L浓度对5种细胞生长无明显影响，同时在相应敏感细胞上测定攻击病毒之TCID50。试验时设病毒对照、细胞对照、药物毒性对照及三氮唑核苷(病毒唑)对照，置33℃或37℃CO2培养箱内，每天在倒置显微镜下观察病变并记录。当病毒对照孔细胞出现+++病变时，继续观察4d则终止。细胞出现病变的程度按以下6级标准记录：-：细胞生长正常，无病变出现；±：细胞病变少于整个单层细胞的10%；+：细胞病变约占整个单层细胞的25%；++：细胞病变约占整个单层细胞的50%；+++：细胞病变约占整个单层细胞的75%；++++：细胞病变约占整个单层细胞的75%以上。
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2.2 对小鼠流感病毒性肺炎的影响
将体重为14～16g的NIH小鼠随机分组，药物组于感染前1d开始滴鼻给药，0.05mL/次，2次/d，连续5d，对照组给予同容积蒸馏水滴鼻。各组在乙醚轻度麻醉下感染流感病毒鼠肺适应株FM115LD50，感染后96h处死，称体重后取肺称重，逐个算出肺指数值(每100g体重的肺质量，即肺指数=肺质量/体重×100)和肺指数抑制率[(病毒对照组平均肺指数-实验组平均肺指数)/病毒对照组平均肺指数×100%]，与对照组比较进行组间t检验。
2.3 对小鼠体内流感病毒增殖的影响
在乙醚轻度麻醉下以流感病毒FM11000LD50量感染小鼠，人工感染前1d开始滴鼻给药，2次/d， 0.05mL/只。在感染后48h，解剖取肺，固定，制成组织切片，脱腊，先以 FM1兔免疫血清(HAI 1∶1280)浸染，冲洗后再加1∶15稀释的羊抗兔IgG荧光抗体(华美生物工程公司生产)，于荧光显微镜下观察整个切片所有的细支气管数量，计算含有特异性荧光颗粒的细支气管数量，计算各组细支气管内含特异性荧光颗粒百分率(出现特异性荧光颗粒的细支气管数量/计数的细支气管总数×100%)，荧光阳性率高表明病毒颗粒增殖多，并进行统计学处理[7]。
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2.4 对小鼠体内感染流感病毒的死亡保护和延长病鼠生命的作用
将小鼠随机分为病毒对照组和病毒宁200g/L组，分别以FM12LD50滴鼻感染，给药组自感染病毒前1d开始到感染后4d，共滴鼻给药0.05mL/次，2次/d，病毒对照组滴鼻给予等量蒸馏水，逐日观察动物发病和记录死亡数，共观察14d，计算死亡保护率[(对照组死亡率-给药组死亡率)×100%]、延长生命率[(给药组平均存活日数-对照组平均存活日数)/对照组平均存活日数×100%]。
3 结果
3.1 对病毒致细胞病变的体外抗病毒作用
表1结果表明：在病毒宁20g/L浓度下，即较临床应用浓度稀释5倍情况下仍可对鼻病毒、流感病毒产生较好的抑制病变作用，较病毒唑更具广谱作用。该实验重复2次，结果与表1完全一致。
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3.2 对小鼠流感病毒性肺炎的影响
表2结果表明：病毒宁组按100g/L浓度每次滴鼻0.05mL,2次/d的剂量对小鼠流感病毒性肺炎有显著治疗作用，其疗效优于1.05g/L病毒唑组的。
3.3 对小鼠体内流感病毒增殖的影响
表3结果表明：病毒对照组出现特异性荧光率为61%，而病毒宁200g/L和100g/L组荧光率分别为9.5%与20%(P<0.01)，且呈量效关系；病毒唑(1.05g/L)滴鼻亦有一定抑制作用，但效果不如病毒宁明显。
3.4 对小鼠体内感染流感病毒的死亡保护和延长病鼠生命的作用
表4结果表明：病毒宁200g/L组对小鼠体内感染流感病毒有死亡保护和延长病鼠生命的作用。
, 百拇医药
4 讨论
呼吸道病毒感染首先入侵鼻咽、口咽、喉部和扁桃体的局部粘膜和粘膜下，在这些部位复制并释放病毒颗粒和毒素而引起感冒症状。由于仅引起呼吸道局部表面感染，除腺病毒外，所产生的抗体量少，故再感染经常发生[2]。因此直接在鼻咽和口咽部给予抗病毒滴剂药物，可以直接作用于感染靶位，收到较好的疗效，给药剂量较口服途径小数十到数百倍，方便实用且有宣通开窍，消除症状的作用。我国自古代就有许多局部鼻咽给药的报道[3]，但目前尚未有类似抗感
表2 病毒宁对小鼠流感病毒性肺炎的作用 组 别
N/只
ρ浓度/
(g.L-1)
, 百拇医药
K肺指数值/
(
±s)p抑制/%
病毒对照
8
-
1.58±0.47
-
正常对照
10
-
, 百拇医药 0.94±0.10
-
病毒唑
12
1.05
1.17±0.26
25.95*
病毒宁
11
100
1.00±0.19
36.71**
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病毒宁
15
50
1.20±0.38
24.05*
病毒对照
9
-
1.73±0.46
-
正常对照
9
-
, 百拇医药
1.02±0.29
-
病毒唑
9
1.05
1.21±0.23
30.06*
病毒宁
10
100
1.17±0.34
32.37**
, 百拇医药
病毒宁
10
50
1.43±0.50
17.34
病毒宁
9
25
1.63±0.56
5.78
*与病毒对照组比较P<0.05，**P<0.01表3 病毒宁对流感病毒增殖的影响 组 别
N动物/
, 百拇医药
只
ρ浓度/
(g*L-1)
N有/
条
N无/
条
N总/
条
p/%
χ2
P值
, 百拇医药
病毒对照
11
-
202
131
333
61
-
-
病毒宁
12
200
38
361
, 百拇医药
399
9.5
215
<0.01
病毒宁
12
100
80
314
394
20
123
<0.01
, 百拇医药
病毒唑
12
1.05
174
228
402
43
20
<0.01
N有：含有特异性荧光颗粒的细支气管数量；N无：没有特异性荧光颗粒的细支气管数量；N总：各组细支气管总数；p=N有/N总表4 病毒宁对小鼠体内感染流感病毒
, 百拇医药
的死亡保护作用 组 别
N总/
只
N死亡/
只
p死亡/%
p死亡保护/%
t平均存活/d
病毒对照组
10
8
80
, http://www.100md.com
-
10.7
病毒宁
200g/L组
10
3
30
50*
13.5**
*与病毒对照组比较P<0.05， **P<0.01表1 病毒宁对病毒致病变抑制作用 病 毒 株
靶细胞
XTCLD50
, 百拇医药
不同质量浓度(ρ)对病毒的抑制作用
ρ1=20g.L-1
ρ2=10g.L-1
ρ3=5g.L-1
ρ4=1g.L-1
鼻病毒R14型
KMB17
30
, 百拇医药 +
+
+
-
流感病毒A型FM1
MDCK
100
+
-
-
+
呼吸道合胞病毒
Hep-2
, 百拇医药
100
+
+
+
+
腺病毒3型
Hela
100
+
±
-
-
疱疹病毒Ⅰ型
BHK
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100
+
+
+
+
疱疹病毒Ⅱ型
BHK
100
+
+
+
-
副流感3型
KMB17
, 百拇医药
100
+
-
-
+
+：表示抑制；±：表示不肯定；-：表示不抑制
冒病毒滴剂在临床应用。
引起感冒等急性上呼吸道感染的主要病毒，除鼻病毒外，尚有腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、肠道病毒的柯萨奇A21、A24、A1-10、ECHO19、20等等。Reed估计50%的感冒为鼻病毒和呼吸道合胞病毒引起，其余则为肠道病毒等所致[4]。我国的感冒病人中除鼻病毒外则以流感病毒感染较为多见，并且呈周期性大流行，严重威胁着人类健康。目前西方和国内临床用于抗A型流感病毒的药物有金刚烷胺(amatadine)、甲基金刚烷胺(rimantadine)、病毒唑(virazole)和干扰素等，前二者可引起中枢性眩晕和迅速耐药毒株的出现[1]；而低剂量口服病毒唑1.0g/d无明显抗病毒作用，大剂量口服对无并发症流感患者退热与症状消除的作用较快[5]，但大剂量口服的毒性较大，且对B型流感无治疗作用；干扰素在预防鼻病毒方面是有效的，而对流感和副流感的感染者的治疗效果，目前看法不一。
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应用祖国医学中草药治疗流感有数千年历史，临床有效的方药不少，但有许多缺乏现代病毒学实验研究。50～70年代，国内曾用体外方法对大量的中草药进行筛选，有人统计425种中草药在体外细胞水平对流感病毒有抑制作用者达67种，占15.5%[6]。但其后能通过动物体内实验证实有肯定的抑制流感病毒者不多，有明确的现代病毒学实验基础的中药有正柴胡饮[7]、清肺饮[8]、鱼腥草醇提物[9]等。我们的实验结果显示，病毒宁20g/L浓度组在体外细胞水平有广谱抑制呼吸道病毒的作用；体内实验也证明其有抗小鼠流感病毒性肺炎和抑制小鼠体内流感病毒增殖的作用，且呈量效关系；并可延长流感病毒感染小鼠的存活时间。这些都表明病毒宁滴剂对病毒性感冒的病因治疗具有良好的前景，关于其在抗菌消炎、解热镇痛与对免疫系统作用的研究将在另文报导。
作者简介：第一作者，男，助理研究员第一作者，男，助理研究员
参考文献：
, 百拇医药
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[2] 黄祯祥，洪涛，刘崇柏，等主编.医学病毒学基础及实验技术[M].北京：科学出版社，1990.656～657
[3] 程爵容.中医鼻脐疗法[M].北京：人民军医出版社，1993.8～14
[4] 杜平，朱关福，刘湘云，等主编.现代临床病毒学[M].北京：人民卫生出版社，1991.302～309
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[9] Zhu Yutong, Lin Peiru, Zhang Zhongliang, et al.A Chinese vegetable (Houttuynia Cordate, Thunb) can inhibit infection of influenza virus in mice[J].Virus Information Exchange Newsletter, 1992,9(3):102
收稿日期：1998-12-02, 百拇医药