不同区引物检测庚型肝炎病毒RNA
作者：仝文斌 高巍 邵杰 费然 冯百芳 陶其敏
单位：北京医科大学人民医院肝病研究所，北京 100044
关键词：
北京医科大学学报990524 1995年Genelabs和Abbott公司相继报道了一种与人类肝炎相关的RNA病毒，分别命名为HGV(hepatitis G virus)和GBV-C(GB virus C)[1，2]，即庚型肝炎病毒(本文统称为HGV)。此后国内外许多学者应用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-PCR， RT-PCR)技术在多组不同人群中检出了HGV，其阳性率1.2%～33.3%[3]。我们根据HGV的病毒全序列[4]和国内外部分研究资料[5～8]，分别设计合成了HGV基因组不同区的4组引物，同时对同一批样品进行了比较分析，探讨不同区引物检测HGV-RNA的情况。
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1 材料与方法
引物：采用逆转录-套式聚合酶链反应(reverse transcription-nested PCR, RT-nPCR)技术，引物分别源于HGV基因组的5′端非编码区(A)、非结构区5(B、C)和非结构区3(D)，均由上海生工生物工程公司合成，PAGE纯化，引物序列及所扩增片段的相对分子质量见表1。
表1 本研究中HGV-RNA检测所用引物序列
Table 1 Nucleotide sequence of primers used to detect HGV-RNA in the study Sets
HGV region
Primer
Sequence (5′→3′)
, 百拇医药
Product
A
5′UTR
1
AGGTGGTGGATGGGTGAT
280 bp
2
TGCCACCCGCCCTCACCCGAA
3
TGGTAGGTCGTAAATCCCGGT
4
GGRGCTGGGTGGCCYCATGCWT
, 百拇医药
B
NS5
1
GTTACACTTATGAGGARGC
210 bp
2
GCRTCCACACAGATGGCGCA
3
CTGGTTGGGGGTGTACTGG
4
GAGATACTTGAAGGGACTCC
C
, 百拇医药
NS5
1
CCAGTTTACTCTACCAAGCT
290 bp
2
GAGATAAGTGCWGGCGATGG
3
TGGGCTGAGGTGGTGGTGACC
4
GCATCTCTCGGCTACTACCA
D
NS3
, 百拇医药
1
GCTCGCCTATGACTCAGCAT
280 bp
2
GTCACCTCAACGACCTCCTC
3
CCACCAACCCACAGTCGGTG
4
ATCCATAATTGAGACAAAGCTGGA
血清标本：60例，系丙型肝炎病毒(HCV)感染的有偿献血员标本，来自河北省。
酶与试剂：异硫氰酸胍和十二烷基肌氨酸钠为Sigma产品，逆转录酶(AMV-RT)、DNA聚合酶(Taq-P)和核糖核酸酶抑制剂RNasin系Promega公司产品，三磷酸核苷酸dNTPs购自Boehringer Mannheim公司。
, 百拇医药
方法：50 μl血清参照文献[9]取RNA模板，将核酸沉淀溶于5.5 μl含RNasin(1 U.μl-1)的DEPC水中，70 ℃变性5 min、冰浴2 min后加入逆转录反应混合液，混匀，42 ℃反应1 h。10 μl逆转录反应体系中含1×AMV-RT Buffer、dNTPs200 μmol.L-1、AMV-RT2U及相应的HGV引物A-2、B-2、C-2、D-2各25 pmol。逆转录反应结束后95 ℃ 10 min使AMV-RT失活，加入PCR反应混合液混匀、液体石蜡封顶。第1次PCR的50 μl反应体系中含1×PCR Buffer、MgCl2 1.5 mmol.L-1、dNTPs 200 μmol.L-1、Taq-P 1.5 U及相应的HGV引物A-1和A-2、B-1和B-2、C-1和C-2、D-1和D-2各50 pmol；第1次PCR反应结束后取5μl进行第2次PCR，第2次PCR分别含相应的HGV引物A-3和A-4、B-3和B-4、C-3和C-4、D-3和D-4各50 pmol，其余同第1次PCR。循环参数两次PCR相同，均为94 ℃变性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min，扩增30个循环。第2次PCR反应结束后取产物经60 g.L-1聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
, 百拇医药
2 结果
灵敏度实验：取1份HGV-RNA强阳性血清，10倍系列稀释后分别用A、B、C、D 4组引物进行RT-nPCR检测，比较4组引物的检测灵敏度。结果发现A、B、C、D 4组引物的最低检测稀释度分别为10-3、10-5、10-4、10-1。
不同区引物检测HGV-RNA的结果：利用A、B、C、D 4组不同区引物(A为5′UTR，B和C为NS5，D为NS3)分别对60份感染HCV的有偿献血员血清标本进行RT-nPCR检测。结果A、B、C、D 4组引物分别检出HGV-RNA阳性8、11、9、4例。60份样品中HGV-RNA合计11例阳性，这11例阳性标本A、B、C、D 4组引物的检出情况见表2。表2 11例HGV-RNA阳性标本不同区引物检出情况分析
Table 2 Detection of 11 HGV-RNA positive samples with different region primers No.
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A(5′UTR)
B(NS5)
C(NS5)
D(NS3)
1
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2
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3
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4
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3 讨论
HGV为单股正链RNA病毒，其基因组结构与同属黄病毒科的人类肝炎病毒HCV极为相似，但种系发生分析已证实HGV并非HCV的变异株，而是一个独立的新成员。最近的研究结果又提示HGV基因组结构与HCV虽然相似，但仍有很大不同，具体表现为HGV的C功能区的缺失、5′UTR序列的较大变异及其致病性的不同等。因此，有些学者指出，鉴于HGV和HCV在病原学、致病性等许多方面的不同，以往所应用的完全照搬HCV的分析方法对HGV进行研究的思路似乎是不正确的，我们应该去重新认识HGV在人类肝炎中的地位和作用[10]。
由于HGV的研究时间尚短，尚未建立起稳定、成熟的检测HGV抗体的免疫学技术，因此对HGV核酸的检测也就成为目前唯一较可靠的病原学诊断方法，而其中RT-nPCR条件的优化也就具有重要意义。有文献报道，与HCV不同，HGV病毒基因组的5′UTR并不很保守，其序列分析发现有0.5%～29.1%的核苷酸变异；另外，NS5区的核苷酸变异率不高，显示了一定的高保守性。据此我们在目前常用于设计HGV-RNA检测引物的NS3、NS5和5′UTR区分别合成了4组引物，其中A组为5′UTR区、B组和C组为NS5区、D组为NS3区。不同区引物对60 例感染HCV的有偿献血员血清标本检测结果表明(表2)：4组引物中，以D组NS3区引物对HGV-RNA的检出率最低。有两份样品(No.6和No.11)只有NS5区引物检测为HGV-RNA阳性(均经3次重复实验证实)。以上结果提示，对HGV-RNA进行RT-nPCR检测时，以在5′UTR区和NS5区设计引物为宜，其中NS5区似乎较5′UTR区更好。同时灵敏度实验结果又表明，对于同一份HGV-RNA阳性标本，NS5区引物的检测灵敏度也最高(最低检测稀释度B组、C组分别为10-5、10-4)，5′UTR引物略低(10-3)，NS3区最差(10-1)。因此，我们分析NS3区引物对HGV的低检出率可能既与该区核苷酸变异率较高、引物和模板不能很好地退火有关，同时也有灵敏度较低等因素的影响。总之，本研究的结果提示NS3区引物用于HGV-RNA的临床常规检测是不合适的，NS5区应该是较好的选择。
, 百拇医药
另外，本研究在感染HCV的有偿献血员中HGV的检出率为18.3%(11/60)，与国外报道相似[6]，明显高于正常人群，提示HGV与HCV有相似的传染途径和危险因素。
注：美国中华医学会(CMB)基金(93-582)资助课题。
参考文献
1 Simons JN, Leary TP, Dawson GJ, et al. Isolation of novel virus-like sequences associated with human hepatitis. Nat Med, 1995, 1(6):564-569
2 Leary TP, Nuerhoff AS, Simons JN, et al. Sequence and genomic organization of GBV-C: A novel member of the flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis. J Med Virol, 1996, 48(1):60-67
, 百拇医药
3 王 宇，Okamoto H, 安 萍，等. 我国献血员中庚型肝炎病毒感染状况的研究. 北京医科大学学报，1996, 28(2):97
4 Linnen J, Wages J, Zhang-Keck ZY, et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a tranfusion-transmissible agent. Science, 1996, 271(5248):505-508
5 戎广亚，孙 杰，周继文，等.利用多组套式引物检测庚型肝炎病毒RNA. 中华实验和临床病毒学杂志，1997,11(2):141-143
6 Jarvis LM, Davidson F, Hanley JP, et al. Infection with hepatitis G virus among recipients of plasma products. Lancet, 1996, 348(9038):1352-1355
, 百拇医药
7 Seipp S, Wahl R, Mueller H, et al. Sequence analysis of GB virus C(GBV-C) isolates from 14 patients. Virus Res, 1996,46(1-2):81-88
8 魏 来，常锦红，陶其敏，等. 肝癌病人血清中庚型肝炎病毒非结构基因(NS) 5区cDNA的序列分析. 中华实验和临床病毒学杂志，1996, 10(4):301-304
9 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-choroform extraction. Anal Biochem, 1987, 162(1):156-159
10 金冬雁. 庚型肝炎病毒是肝炎病毒吗？中华实验和临床病毒学杂志，1997, 11(4):301-305
(1998-09-09收稿), 百拇医药
单位：北京医科大学人民医院肝病研究所，北京 100044
关键词：
北京医科大学学报990524 1995年Genelabs和Abbott公司相继报道了一种与人类肝炎相关的RNA病毒，分别命名为HGV(hepatitis G virus)和GBV-C(GB virus C)[1，2]，即庚型肝炎病毒(本文统称为HGV)。此后国内外许多学者应用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-PCR， RT-PCR)技术在多组不同人群中检出了HGV，其阳性率1.2%～33.3%[3]。我们根据HGV的病毒全序列[4]和国内外部分研究资料[5～8]，分别设计合成了HGV基因组不同区的4组引物，同时对同一批样品进行了比较分析，探讨不同区引物检测HGV-RNA的情况。
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1 材料与方法
引物：采用逆转录-套式聚合酶链反应(reverse transcription-nested PCR, RT-nPCR)技术，引物分别源于HGV基因组的5′端非编码区(A)、非结构区5(B、C)和非结构区3(D)，均由上海生工生物工程公司合成，PAGE纯化，引物序列及所扩增片段的相对分子质量见表1。
表1 本研究中HGV-RNA检测所用引物序列
Table 1 Nucleotide sequence of primers used to detect HGV-RNA in the study Sets
HGV region
Primer
Sequence (5′→3′)
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Product
A
5′UTR
1
AGGTGGTGGATGGGTGAT
280 bp
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TGCCACCCGCCCTCACCCGAA
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TGGTAGGTCGTAAATCCCGGT
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GGRGCTGGGTGGCCYCATGCWT
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GTTACACTTATGAGGARGC
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GCRTCCACACAGATGGCGCA
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CTGGTTGGGGGTGTACTGG
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GAGATACTTGAAGGGACTCC
C
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1
CCAGTTTACTCTACCAAGCT
290 bp
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GAGATAAGTGCWGGCGATGG
3
TGGGCTGAGGTGGTGGTGACC
4
GCATCTCTCGGCTACTACCA
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NS3
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GCTCGCCTATGACTCAGCAT
280 bp
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GTCACCTCAACGACCTCCTC
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CCACCAACCCACAGTCGGTG
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ATCCATAATTGAGACAAAGCTGGA
血清标本：60例，系丙型肝炎病毒(HCV)感染的有偿献血员标本，来自河北省。
酶与试剂：异硫氰酸胍和十二烷基肌氨酸钠为Sigma产品，逆转录酶(AMV-RT)、DNA聚合酶(Taq-P)和核糖核酸酶抑制剂RNasin系Promega公司产品，三磷酸核苷酸dNTPs购自Boehringer Mannheim公司。
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方法：50 μl血清参照文献[9]取RNA模板，将核酸沉淀溶于5.5 μl含RNasin(1 U.μl-1)的DEPC水中，70 ℃变性5 min、冰浴2 min后加入逆转录反应混合液，混匀，42 ℃反应1 h。10 μl逆转录反应体系中含1×AMV-RT Buffer、dNTPs200 μmol.L-1、AMV-RT2U及相应的HGV引物A-2、B-2、C-2、D-2各25 pmol。逆转录反应结束后95 ℃ 10 min使AMV-RT失活，加入PCR反应混合液混匀、液体石蜡封顶。第1次PCR的50 μl反应体系中含1×PCR Buffer、MgCl2 1.5 mmol.L-1、dNTPs 200 μmol.L-1、Taq-P 1.5 U及相应的HGV引物A-1和A-2、B-1和B-2、C-1和C-2、D-1和D-2各50 pmol；第1次PCR反应结束后取5μl进行第2次PCR，第2次PCR分别含相应的HGV引物A-3和A-4、B-3和B-4、C-3和C-4、D-3和D-4各50 pmol，其余同第1次PCR。循环参数两次PCR相同，均为94 ℃变性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min，扩增30个循环。第2次PCR反应结束后取产物经60 g.L-1聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
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2 结果
灵敏度实验：取1份HGV-RNA强阳性血清，10倍系列稀释后分别用A、B、C、D 4组引物进行RT-nPCR检测，比较4组引物的检测灵敏度。结果发现A、B、C、D 4组引物的最低检测稀释度分别为10-3、10-5、10-4、10-1。
不同区引物检测HGV-RNA的结果：利用A、B、C、D 4组不同区引物(A为5′UTR，B和C为NS5，D为NS3)分别对60份感染HCV的有偿献血员血清标本进行RT-nPCR检测。结果A、B、C、D 4组引物分别检出HGV-RNA阳性8、11、9、4例。60份样品中HGV-RNA合计11例阳性，这11例阳性标本A、B、C、D 4组引物的检出情况见表2。表2 11例HGV-RNA阳性标本不同区引物检出情况分析
Table 2 Detection of 11 HGV-RNA positive samples with different region primers No.
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3 讨论
HGV为单股正链RNA病毒，其基因组结构与同属黄病毒科的人类肝炎病毒HCV极为相似，但种系发生分析已证实HGV并非HCV的变异株，而是一个独立的新成员。最近的研究结果又提示HGV基因组结构与HCV虽然相似，但仍有很大不同，具体表现为HGV的C功能区的缺失、5′UTR序列的较大变异及其致病性的不同等。因此，有些学者指出，鉴于HGV和HCV在病原学、致病性等许多方面的不同，以往所应用的完全照搬HCV的分析方法对HGV进行研究的思路似乎是不正确的，我们应该去重新认识HGV在人类肝炎中的地位和作用[10]。
由于HGV的研究时间尚短，尚未建立起稳定、成熟的检测HGV抗体的免疫学技术，因此对HGV核酸的检测也就成为目前唯一较可靠的病原学诊断方法，而其中RT-nPCR条件的优化也就具有重要意义。有文献报道，与HCV不同，HGV病毒基因组的5′UTR并不很保守，其序列分析发现有0.5%～29.1%的核苷酸变异；另外，NS5区的核苷酸变异率不高，显示了一定的高保守性。据此我们在目前常用于设计HGV-RNA检测引物的NS3、NS5和5′UTR区分别合成了4组引物，其中A组为5′UTR区、B组和C组为NS5区、D组为NS3区。不同区引物对60 例感染HCV的有偿献血员血清标本检测结果表明(表2)：4组引物中，以D组NS3区引物对HGV-RNA的检出率最低。有两份样品(No.6和No.11)只有NS5区引物检测为HGV-RNA阳性(均经3次重复实验证实)。以上结果提示，对HGV-RNA进行RT-nPCR检测时，以在5′UTR区和NS5区设计引物为宜，其中NS5区似乎较5′UTR区更好。同时灵敏度实验结果又表明，对于同一份HGV-RNA阳性标本，NS5区引物的检测灵敏度也最高(最低检测稀释度B组、C组分别为10-5、10-4)，5′UTR引物略低(10-3)，NS3区最差(10-1)。因此，我们分析NS3区引物对HGV的低检出率可能既与该区核苷酸变异率较高、引物和模板不能很好地退火有关，同时也有灵敏度较低等因素的影响。总之，本研究的结果提示NS3区引物用于HGV-RNA的临床常规检测是不合适的，NS5区应该是较好的选择。
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另外，本研究在感染HCV的有偿献血员中HGV的检出率为18.3%(11/60)，与国外报道相似[6]，明显高于正常人群，提示HGV与HCV有相似的传染途径和危险因素。
注：美国中华医学会(CMB)基金(93-582)资助课题。
参考文献
1 Simons JN, Leary TP, Dawson GJ, et al. Isolation of novel virus-like sequences associated with human hepatitis. Nat Med, 1995, 1(6):564-569
2 Leary TP, Nuerhoff AS, Simons JN, et al. Sequence and genomic organization of GBV-C: A novel member of the flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis. J Med Virol, 1996, 48(1):60-67
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3 王 宇，Okamoto H, 安 萍，等. 我国献血员中庚型肝炎病毒感染状况的研究. 北京医科大学学报，1996, 28(2):97
4 Linnen J, Wages J, Zhang-Keck ZY, et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a tranfusion-transmissible agent. Science, 1996, 271(5248):505-508
5 戎广亚，孙 杰，周继文，等.利用多组套式引物检测庚型肝炎病毒RNA. 中华实验和临床病毒学杂志，1997,11(2):141-143
6 Jarvis LM, Davidson F, Hanley JP, et al. Infection with hepatitis G virus among recipients of plasma products. Lancet, 1996, 348(9038):1352-1355
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7 Seipp S, Wahl R, Mueller H, et al. Sequence analysis of GB virus C(GBV-C) isolates from 14 patients. Virus Res, 1996,46(1-2):81-88
8 魏 来，常锦红，陶其敏，等. 肝癌病人血清中庚型肝炎病毒非结构基因(NS) 5区cDNA的序列分析. 中华实验和临床病毒学杂志，1996, 10(4):301-304
9 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-choroform extraction. Anal Biochem, 1987, 162(1):156-159
10 金冬雁. 庚型肝炎病毒是肝炎病毒吗？中华实验和临床病毒学杂志，1997, 11(4):301-305
(1998-09-09收稿), 百拇医药