包埋后的几丁质与软骨细胞体外培养的实验研究
作者：刘彦春 王炜 曹谊林 商庆新 钟伟
单位：200011 上海第二医科大学附属第九人民医院整形外科(刘彦春、王炜)；上海第二医科大学组织工程研究中心(曹谊林、商庆新)；复旦大学高分子科学系(钟伟)
关键词：细胞支架；细胞，培养的；软骨；体外研究
中华外科杂志/980816 【摘要】 目的 探讨几丁质作为组织工程技术中细胞培养支架的可行性。 方法 采用聚乳酸、卵磷脂及多聚赖氨酸分别或共同包埋几丁质与软骨细胞体外培养，观察其亲水性的改变、对细胞吸附力和细胞功能的影响。 结果 以聚乳酸包埋的几丁质对细胞的生长有抑制作用；以卵磷脂包埋的几丁质亲水性增强；以多聚赖氨酸包埋的几丁质对细胞吸附力增强；以卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋的几丁质具有良好的亲水性和对细胞吸附力，并可使细胞更好地发挥功能。 结论 聚乳酸、卵磷脂及多聚赖氨酸共同包埋几丁质具有作为组织工程技术中细胞培养支架的应用前景。
, http://www.100md.com
Culture of chondrocytes seeded onto chitin scaffoldings coating with different materials: experimental study Liu Yanchun,Wang Wei,Cao Yilin,et al. Department of Plastic Surgery, Shanghai Ninth Hospital, Shanghai Second Medical University,Shanghai 200011.
【Abstract】 Objective To find the possibility of chitin used as scaffolds in tissue engineering.Method Chondrocytes were cultured when they were seeded onto chitin meshcoated with polylactic acid (PLA) lecithin (LEC) and poly-l-lysine(PLYS).With light microscope and scanning electron microscope, the scaffolds in hydrophilia and adsorptivity to chondrocytes and the function of the cells were observed. Result LEC can change the hydrophilia of scaffolds. PLYS can strengthen the adsorptivity of the scaffolds. and promote the matrices production of chondrocytes. Conclusion The chitin coated with LEC and PLYS can be used as scaffolds in tissue engineering.
, 百拇医药
【Key words】 Cytoskeleton Cells,cultured Cartilage In vitro
组织工程技术中细胞培养支架的选择是研究的焦点之一。以聚乳酸包埋的聚羟基乙酸无纺网是组织工程技术中应用较为广泛的支架[1]，但其来源主要靠进口，价格昂贵，且需特殊物质的包埋。用其它材料作为组织工程技术中细胞培养支架也有报道[2]，但都有各自的缺点。几丁质在医学领域已有广泛应用[3]，但作为组织工程技术中细胞培养支架尚未见报道。我们采用聚乳酸、卵磷脂及多聚赖氨酸分别和共同包埋几丁质，观察其亲水性的改变及对细胞吸附力和细胞功能的影响，以探索几丁质作为组织工程技术中细胞培养支架的可行性。
材料与方法
1.几丁质(chitin，CHIT)支架预制：将直径15 μm纤维，间隔150～200 μm，厚度100 μm的几丁质无纺网(复旦大学提供)以2 %的聚乳酸(polylactic acid，PLA)二氯甲烷溶液包埋，再分别以1 %的卵磷脂(lecithin，LEC)无水乙醇溶液及10 %多聚赖氨酸(polylysine，PLYS)包埋。这样得到4种类型支架：(1)CHIT加PLA；(2)CHIT加PLA加LEC；(3)CHIT加PLA加PLYS；(4)CHIT加PLA加LEC加PLYS。支架消毒采用75 %酒精浸泡及紫外线照射。
, 百拇医药
2.软骨细胞悬液制备：取新西兰大白兔耳廓软骨(兔大小、雌雄不限)。所取软骨剥去软骨膜，剪成0.1 cm×0.1 cm大小的碎片，以磷酸盐缓冲盐水(PBS，含青霉素200 U/ml,链霉素200 μg/ml)冲洗两遍，以去除残留于软骨表面的血迹。将软骨碎片置入50 ml离心管中，加两倍于软骨体积的Ⅱ型胶原酶(Sigma公司，2 mg/ml)在恒温振荡器内消化。12～18小时后软骨碎片完全溶解，细胞从基质中全部释放出来。经过滤、漂洗、计数制成每毫升含5×107个细胞的悬液。
3.培养液：用F-12培养基加入10 %的小牛血清及青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml。
4.细胞的接种及培养：将上述4种支架分别裁剪成1.5 cm×2.0 cm大小，每个支架中加入细胞悬液250 μl，然后将4种细胞支架复合物分别置入60 mm培养皿中，放入37℃ 5%二氧化碳培养箱中。4小时后加入F-12培养液5 ml，抗坏血酸50 μg/ml、人转化生长因子-b1(TFGF-b1，Mega Gene公司)10
, 百拇医药
ng/ml、人碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF，Mega Gene公司)2 ng/ml。培养液每3天更换1次。定期在倒置显微镜下观察细胞与支架的吸附、生长繁殖及基质产生情况，并取标本做扫描电镜检测。
结果
1.支架亲水性观察：支架2、4亲水性较支架1、3亲水性好，表现为前两者加入细胞悬液后悬液迅速均匀地扩散到支架内。两者加入细胞悬液后悬液先呈球型附在支架表面，然后缓慢地扩散到支架内。
2.支架对细胞吸附力的观察：支架3、4对细胞吸附力优于支架1、2，表现为前两者细胞单个或呈团状吸附在支架纤维表面，晃动培养皿细胞团无漂动(图1，2)，后两者细胞散落在支架纤维之间或较少吸附在支架纤维表面，晃动培养皿细胞团漂浮不定。
3.细胞在支架上的繁殖及基质产生情况的观察：随着培养时间延长，支架1的纤维表面可见较多死亡的细胞碎屑，无基质产生；支架2增殖细胞分布于支架纤维之间，无基质产生；支架3、4增殖细胞分布于支架纤维之间或表面，光镜下见支架纤维间有呈蜘蛛网样的基质产生(图1)，扫描电镜见细胞分泌的基质呈伪足样缠绕在支架表面(图2)。
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图1 支架3、4与软骨细胞培养，细胞分布于支架纤维之间或吸附在支架纤维表面，有呈蜘蛛网样分布的基质产生(倒置显微镜，×100)
图2 支架3、4与软骨细胞培养，细胞吸附在支架纤维表面，细胞分泌的基质呈伪足样缠绕在支架纤维表面(扫描电镜，×700)
讨论
1.目前组织工程技术中细胞培养支架的研究现状：细胞培养支架的选择是组织工程研究的焦点之一，其除具有良好的生物相容性和生物可降解性外，还需具有亲水性和良好的细胞吸附性[1]。聚羟基乙酸(PGA)是目前组织工程领域应用最广泛的细胞培养支架，但其来源主要靠进口，价格昂贵。我们试图寻找一种可以代替PGA的、来源广泛的国产的细胞培养支架。
2.几丁质作为组织工程技术中细胞培养支架的可行性：几丁质作为一种新型生物材料在医学领域得到广泛应用。它是一种动物多糖，实验证明其具有良好的生物相容性和生物可降解性。另外还无毒性、无刺激性、无免疫原性、无热原反应、不溶血、无致突变及致死性突变效应[4]。几丁质这些特性说明其作为组织工程技术中细胞培养支架是可行的。
, 百拇医药
3.几丁质作为细胞培养支架的可行性：支架1与软骨细胞培养一段时间后，细胞大部分死亡，说明单纯几丁质对细胞生长有抑制作用，聚乳酸包埋只是使几丁质纤维粘在一起，使支架保持一定的形状[5]。支架2加入细胞悬液后悬液迅速均匀地扩散到支架内，说明卵磷脂的包埋增强了几丁质支架的亲水性，但并没有改变对细胞的吸附力。支架3与软骨细胞培养后细胞大部分吸附在支架纤维表面，随着培养时间的延长，基质产生较多，说明多聚赖氨酸除了增强支架对细胞的吸附力外，还有促进细胞功能的作用[6]。支架4同时以卵磷脂和多聚赖氨酸包埋后，除具有良好的亲水性外，对细胞也具有较好的吸附力，且细胞基质产生旺盛，是一种较理想的支架。
单纯几丁质对软骨细胞生长有抑制作用；卵磷脂及多聚赖氨酸包埋的几丁质亲水性好，对软骨细胞吸附力强，且可促进软骨细胞发挥正常功能，有着作为组织工程技术中细胞培养支架的应用前景。
参考文献
, 百拇医药
1Vacanti CA,Upton J.Tissue-engineered morphogenesis of cartilage and bone by means of cell transplantation using synthetic biodegradble polymer matrices.Clin Plas Surg,1994,21:445-462.
2Vacanti CA,Langer R,Schloo B,et al.Synthetic polymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilage formation.Plast Reconstr Surg,1991,88:753-761.
3Okamoto Y,Minami S,Matsuhashi A,et al.Application of polymeric N-acetyl-D-glucosamine(chitin) to veterinary practice.J Vet Med Sci,1993,55:734-737.
, 百拇医药
4侯春林,卢建熙,包聚良,等.几丁质生物学特性研究.中国修复重建外科杂志,1993,7:115-117.
5Kim WS,Vacanti JP,Cimer L,et al.Cartilage engineered in predetermined shapes employing cell transplantation on synthetic biodegradable polymers.Plast Reconstr Surg,1994,94:233-240.
6Bujia J,Sittinger M,Minuth WW,et al.Engineering of cartilage tissue using bioresorbable polymer fleeces and perfusion cultue. Acta Otolarygol Stockh,1995,115:307-313.
本研究为上海市领先学科资助课题, http://www.100md.com
单位：200011 上海第二医科大学附属第九人民医院整形外科(刘彦春、王炜)；上海第二医科大学组织工程研究中心(曹谊林、商庆新)；复旦大学高分子科学系(钟伟)
关键词：细胞支架；细胞，培养的；软骨；体外研究
中华外科杂志/980816 【摘要】 目的 探讨几丁质作为组织工程技术中细胞培养支架的可行性。 方法 采用聚乳酸、卵磷脂及多聚赖氨酸分别或共同包埋几丁质与软骨细胞体外培养，观察其亲水性的改变、对细胞吸附力和细胞功能的影响。 结果 以聚乳酸包埋的几丁质对细胞的生长有抑制作用；以卵磷脂包埋的几丁质亲水性增强；以多聚赖氨酸包埋的几丁质对细胞吸附力增强；以卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋的几丁质具有良好的亲水性和对细胞吸附力，并可使细胞更好地发挥功能。 结论 聚乳酸、卵磷脂及多聚赖氨酸共同包埋几丁质具有作为组织工程技术中细胞培养支架的应用前景。
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Culture of chondrocytes seeded onto chitin scaffoldings coating with different materials: experimental study Liu Yanchun,Wang Wei,Cao Yilin,et al. Department of Plastic Surgery, Shanghai Ninth Hospital, Shanghai Second Medical University,Shanghai 200011.
【Abstract】 Objective To find the possibility of chitin used as scaffolds in tissue engineering.Method Chondrocytes were cultured when they were seeded onto chitin meshcoated with polylactic acid (PLA) lecithin (LEC) and poly-l-lysine(PLYS).With light microscope and scanning electron microscope, the scaffolds in hydrophilia and adsorptivity to chondrocytes and the function of the cells were observed. Result LEC can change the hydrophilia of scaffolds. PLYS can strengthen the adsorptivity of the scaffolds. and promote the matrices production of chondrocytes. Conclusion The chitin coated with LEC and PLYS can be used as scaffolds in tissue engineering.
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【Key words】 Cytoskeleton Cells,cultured Cartilage In vitro
组织工程技术中细胞培养支架的选择是研究的焦点之一。以聚乳酸包埋的聚羟基乙酸无纺网是组织工程技术中应用较为广泛的支架[1]，但其来源主要靠进口，价格昂贵，且需特殊物质的包埋。用其它材料作为组织工程技术中细胞培养支架也有报道[2]，但都有各自的缺点。几丁质在医学领域已有广泛应用[3]，但作为组织工程技术中细胞培养支架尚未见报道。我们采用聚乳酸、卵磷脂及多聚赖氨酸分别和共同包埋几丁质，观察其亲水性的改变及对细胞吸附力和细胞功能的影响，以探索几丁质作为组织工程技术中细胞培养支架的可行性。
材料与方法
1.几丁质(chitin，CHIT)支架预制：将直径15 μm纤维，间隔150～200 μm，厚度100 μm的几丁质无纺网(复旦大学提供)以2 %的聚乳酸(polylactic acid，PLA)二氯甲烷溶液包埋，再分别以1 %的卵磷脂(lecithin，LEC)无水乙醇溶液及10 %多聚赖氨酸(polylysine，PLYS)包埋。这样得到4种类型支架：(1)CHIT加PLA；(2)CHIT加PLA加LEC；(3)CHIT加PLA加PLYS；(4)CHIT加PLA加LEC加PLYS。支架消毒采用75 %酒精浸泡及紫外线照射。
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2.软骨细胞悬液制备：取新西兰大白兔耳廓软骨(兔大小、雌雄不限)。所取软骨剥去软骨膜，剪成0.1 cm×0.1 cm大小的碎片，以磷酸盐缓冲盐水(PBS，含青霉素200 U/ml,链霉素200 μg/ml)冲洗两遍，以去除残留于软骨表面的血迹。将软骨碎片置入50 ml离心管中，加两倍于软骨体积的Ⅱ型胶原酶(Sigma公司，2 mg/ml)在恒温振荡器内消化。12～18小时后软骨碎片完全溶解，细胞从基质中全部释放出来。经过滤、漂洗、计数制成每毫升含5×107个细胞的悬液。
3.培养液：用F-12培养基加入10 %的小牛血清及青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml。
4.细胞的接种及培养：将上述4种支架分别裁剪成1.5 cm×2.0 cm大小，每个支架中加入细胞悬液250 μl，然后将4种细胞支架复合物分别置入60 mm培养皿中，放入37℃ 5%二氧化碳培养箱中。4小时后加入F-12培养液5 ml，抗坏血酸50 μg/ml、人转化生长因子-b1(TFGF-b1，Mega Gene公司)10
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ng/ml、人碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF，Mega Gene公司)2 ng/ml。培养液每3天更换1次。定期在倒置显微镜下观察细胞与支架的吸附、生长繁殖及基质产生情况，并取标本做扫描电镜检测。
结果
1.支架亲水性观察：支架2、4亲水性较支架1、3亲水性好，表现为前两者加入细胞悬液后悬液迅速均匀地扩散到支架内。两者加入细胞悬液后悬液先呈球型附在支架表面，然后缓慢地扩散到支架内。
2.支架对细胞吸附力的观察：支架3、4对细胞吸附力优于支架1、2，表现为前两者细胞单个或呈团状吸附在支架纤维表面，晃动培养皿细胞团无漂动(图1，2)，后两者细胞散落在支架纤维之间或较少吸附在支架纤维表面，晃动培养皿细胞团漂浮不定。
3.细胞在支架上的繁殖及基质产生情况的观察：随着培养时间延长，支架1的纤维表面可见较多死亡的细胞碎屑，无基质产生；支架2增殖细胞分布于支架纤维之间，无基质产生；支架3、4增殖细胞分布于支架纤维之间或表面，光镜下见支架纤维间有呈蜘蛛网样的基质产生(图1)，扫描电镜见细胞分泌的基质呈伪足样缠绕在支架表面(图2)。
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图1 支架3、4与软骨细胞培养，细胞分布于支架纤维之间或吸附在支架纤维表面，有呈蜘蛛网样分布的基质产生(倒置显微镜，×100)
图2 支架3、4与软骨细胞培养，细胞吸附在支架纤维表面，细胞分泌的基质呈伪足样缠绕在支架纤维表面(扫描电镜，×700)
讨论
1.目前组织工程技术中细胞培养支架的研究现状：细胞培养支架的选择是组织工程研究的焦点之一，其除具有良好的生物相容性和生物可降解性外，还需具有亲水性和良好的细胞吸附性[1]。聚羟基乙酸(PGA)是目前组织工程领域应用最广泛的细胞培养支架，但其来源主要靠进口，价格昂贵。我们试图寻找一种可以代替PGA的、来源广泛的国产的细胞培养支架。
2.几丁质作为组织工程技术中细胞培养支架的可行性：几丁质作为一种新型生物材料在医学领域得到广泛应用。它是一种动物多糖，实验证明其具有良好的生物相容性和生物可降解性。另外还无毒性、无刺激性、无免疫原性、无热原反应、不溶血、无致突变及致死性突变效应[4]。几丁质这些特性说明其作为组织工程技术中细胞培养支架是可行的。
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3.几丁质作为细胞培养支架的可行性：支架1与软骨细胞培养一段时间后，细胞大部分死亡，说明单纯几丁质对细胞生长有抑制作用，聚乳酸包埋只是使几丁质纤维粘在一起，使支架保持一定的形状[5]。支架2加入细胞悬液后悬液迅速均匀地扩散到支架内，说明卵磷脂的包埋增强了几丁质支架的亲水性，但并没有改变对细胞的吸附力。支架3与软骨细胞培养后细胞大部分吸附在支架纤维表面，随着培养时间的延长，基质产生较多，说明多聚赖氨酸除了增强支架对细胞的吸附力外，还有促进细胞功能的作用[6]。支架4同时以卵磷脂和多聚赖氨酸包埋后，除具有良好的亲水性外，对细胞也具有较好的吸附力，且细胞基质产生旺盛，是一种较理想的支架。
单纯几丁质对软骨细胞生长有抑制作用；卵磷脂及多聚赖氨酸包埋的几丁质亲水性好，对软骨细胞吸附力强，且可促进软骨细胞发挥正常功能，有着作为组织工程技术中细胞培养支架的应用前景。
参考文献
, 百拇医药
1Vacanti CA,Upton J.Tissue-engineered morphogenesis of cartilage and bone by means of cell transplantation using synthetic biodegradble polymer matrices.Clin Plas Surg,1994,21:445-462.
2Vacanti CA,Langer R,Schloo B,et al.Synthetic polymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilage formation.Plast Reconstr Surg,1991,88:753-761.
3Okamoto Y,Minami S,Matsuhashi A,et al.Application of polymeric N-acetyl-D-glucosamine(chitin) to veterinary practice.J Vet Med Sci,1993,55:734-737.
, 百拇医药
4侯春林,卢建熙,包聚良,等.几丁质生物学特性研究.中国修复重建外科杂志,1993,7:115-117.
5Kim WS,Vacanti JP,Cimer L,et al.Cartilage engineered in predetermined shapes employing cell transplantation on synthetic biodegradable polymers.Plast Reconstr Surg,1994,94:233-240.
6Bujia J,Sittinger M,Minuth WW,et al.Engineering of cartilage tissue using bioresorbable polymer fleeces and perfusion cultue. Acta Otolarygol Stockh,1995,115:307-313.
本研究为上海市领先学科资助课题, http://www.100md.com