细胞粘着分子CD44V6在膀胱肿瘤中的表达
作者：李文洲 陈晓春 张齐钧
单位：李文洲 陈晓春(武汉市第二医院泌尿外科 武汉，430014)；张齐钧(同济医科大学附属协和医院泌尿外科)
关键词：细胞粘着分子；膀胱肿瘤；荧光免疫测定
临床泌尿外科杂志001214 摘要 目的：探讨细胞粘着分子CD44V6在膀胱肿瘤中的作用及其临床意义。方法：利用免疫荧光法检测了28例膀胱肿瘤和5例正常膀胱移行上皮组织中CD44V6的表达情况。结果：浸润型膀胱肿瘤组织CD44V6阳性表达率为44.44%和75.00%，浅表型膀胱肿瘤阳性表达率为13.33%(P<0.05)，正常组织均阴性表达。半定量检测分析显示CD44V6的表达水平与肿瘤的分级和分期相关。结论：CD44V6的检测是一种提示肿瘤浸润和预后有实用价值的诊断指标。
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The expression of CD44V6 protein in bladder cancer
LI Wen-zhou
(Department of Urology,the Second Hospital,Wuhan ,430014)
ZHANG Qi-jun CHEN Xiao-chun
(Deparment of Urology,the Affiliated Xiehe Hospital,Tongji Medical University)
Abstract Purpose:To investigate the expression and significance of CD44V6 adhesion molecule in human bladder tumor tissue. Methods:We examined the expression of CD44V6 Protein in 28 bladder transitional cell carcinomas and 5 normal urinary transitional epithelial tissues by immunofluorescence using CD44V6 specific antiboby. Results: 7 of 13 invasive TCCs were positive staining and 2 of 15 superficial TCCs positive(P<0.05).In contrast, 5 normal tissues were negative. Semi-quantitative analyses revealed that up regulation of CD44V6 protein expression correlated with high tumor grade and stage. Conclusions:Evaluation of CD44V6 protein expression may be a useful diagnostic parameter indicating invasive processes and progress with poor prognosis.
, 百拇医药
Key words Cell adhesion molecules Bladder neoplasms Fluoroimmunoassay
细胞粘着分子CD44是一类分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，在人类正常的淋巴细胞、成纤维细胞和一部分上皮细胞上均有表达，属粘着分子中选择素家族中的一员，主要参与细胞与细胞、细胞与基质间的粘连〔1〕。近年来，人们在许多人类肿瘤细胞表面已检测到CD44的表达，并发现CD44的表达与肿瘤的发生、发展有关，尤其是近几年发现的倍受人们观注的CD44的变异拼接体V6(CD44V6)在多数人类肿瘤细胞上都有表达，其表达水平与肿瘤的生物学特性有着十分密切的联系〔2〕。甚至有人将CD44V6视为一种判断肿瘤的发生、发展及其预后的临床检测指标。为探讨CD44V6在膀胱肿瘤中的作用及其意义，我们对CD44V6在膀胱肿瘤中的表达进行了研究，现将结果报告如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标本来源
本文28例膀胱肿瘤标本均取自手术切除的新鲜组织，经常规病理切片证实为膀胱移行细胞癌。其中男25例，女3例，年龄30～78岁，平均61.4岁。病理分级按WHO标准分为G117例(G1组)，G210例(G2组)，G31例(G3组)，临床分期按UICC拟定的分期标准分为Ta-115例(Ta-1组)，T29例，T34例(T2加T3组)。此外，另取5例非肿瘤患者的膀胱组织作为正常对照组。
1.2 标本制备
将手术切除的新鲜组织迅速置于液氮中速冻，再置于-70℃低温冰箱中保存。用冷冻切片机切出5 μm切片，用丙酮固定10 min，风干，置于4℃冰箱中保存备用。
, 百拇医药
1.3 检测方法
一抗CD44V6单抗(兔)购自武汉博士德生物工程有限公司(美国Calbiochem-Novabiochem公司产品)，二抗荧光抗体(羊抗兔)为武汉生物制品研究所产品。
将风干切片用10%小牛血清封闭，加一抗置于4℃冰箱中过夜，再加二抗，用德国产Leitz荧光显微镜观察并摄片。
1.4 结果评估
定性检测：在高倍镜视野下，肿瘤细胞膜荧光着色者为阳性，未着色者为阴性，计阳性率。半定量检测：每个阳性病例等距抽样选择10个高倍镜视野，并计算阳性细胞数。按肿瘤的不同分期和分级，分别计其阳性细胞平均数值。
1.5 统计学处理
, 百拇医药 各组间阳性率的比较采用χ2检验，各组间阳性细胞均数比较采用F分析。
2 结果
2.1 定性检测结果
详见表1。
2.2 半定量检测结果
各组检测结果见表2和表3。
表1 临床分期各组间CD44V6阳性率的比较 组别
标数
阳性数
阴性数
阳性率(%)
, 百拇医药
Ta-1
15
2
13
13.33
T2
9
4
5
44.44
T3
4
3
, 百拇医药
1
75.00
合计
28
9
19
32.14
χ2检验，P<0.05表2 病理分级各组间阳性细胞数均值的比较 组别
标本
自由度(n)
均值
, 百拇医药
标准差(s)
G1
3
30
21.80
9.57
G2
5
50
29.68
11.42
G3
, http://www.100md.com 1
10
39.30
11.81
各组间比较差异有极显著性意义(P<0.01)表3 临床分期各组间阳性细胞数均值的比较 组别
标本数
自由度(n)
均值()
标准差(s)
Ta-1
2
, http://www.100md.com
20
17.70
7.429
T2
4
40
27.25
9.515
T3
3
30
36.23
11.866
, 百拇医药
各组间比较差异有极显著性意义(P<0.01)
从上述结果可以看出，浸润型膀胱肿瘤(T2和T3)的CD44V6阳性率(44.44%和75.00%)明显高于浅表型膀胱肿瘤(Ta-1)的阳性率(13.33%)，而正常对照组均为阴性表达。半定量检测分析显示CD44V6的表达水平随膀胱肿瘤病理分级和临床分期的增高而升高。
3 讨论
人类CD44编码基因位于第11号染色体短臂上。人们利用PCR技术和酵母人工染色体克隆技术研究发现CD44基因至少含有20个外显子〔3〕。含有10个固定组成型外显子的转录子称为标准型的CD44(即CD44S)，由它编码的成熟蛋白含有361个氨基酸，其分子量为80 000～90 000。含有V区(即插入区)变异拼接外显子的转录子统称为CD44V，其蛋白表达产物的分子结构多样复杂，且分子量较CD44S大，一般为140 000～160 000，少数可高达215 000〔1〕。近年来，人们研究发现在CD44拼接变异体中，以CD44V6最为多见。在人类的乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾癌等中均能检出CD44V6异常表达，并发现它与肿瘤细胞分化、肿瘤的浸润转移有关〔4〕。而且在许多体外培养的肿瘤细胞系上，人们也检测到了CD44V6表达，并发现其表达水平与肿瘤细胞的恶性程度和转移潜能呈正相关〔5，6〕。
, 百拇医药
本文研究发现，在28例膀胱移行上皮癌中，有32.14%的标本有CD44V6阳性表达。特别值得注意的是，在浸润型膀胱肿瘤中(T2和T3)，CD44V6的阳性率(44.44%和75.00%)明显高于浅表型膀胱肿瘤(Ta-1)中的阳性率(13.33%)。由此提示CD44V6的表达可能与肿瘤的恶性表型有关，恶性程度高，其阳性表达率亦高。Woodman等〔7〕亦有类似的结论。Kan等〔8〕利用Southern斑点原位杂交技术，从基因水平检测膀胱肿瘤中CD44V6的表达情况，发现CD44V6阳性表达率高达81.8%。这可能是因为他们的检测方法更为敏感、精确，也可能是因膀胱肿瘤中CD44V6在基因水平和蛋白水平的表达存在着差异的缘故。
, 百拇医药
我们在研究中还利用半定量的检测方法，比较了各病理分级和临床分期间CD44V6蛋白的阳性细胞数，发现CD44V6阳性细胞数随着肿瘤的分级和分期的增高而升高。这进一步提示CD44V6的表达水平与膀胱肿瘤的细胞分化程度、肿瘤浸润程度有关，我们推测CD44V6的表达可能是评价膀胱肿瘤恶性程度和预后的一种新的临床检测指标，对我们临床诊断、治疗及预后有一定的指导意义。
在膀胱肿瘤的早期诊断和筛选中，尿脱落细胞学检查是一项十分重要的手段。近年来，有人利用RT-PCR技术检测膀胱肿瘤患者尿脱落细胞中CD44V6基因的表达情况，发现其阳性检出率为71.5%〔9〕。我国吴忠等〔10〕也作过类似研究工作，其阳性检出率更高达90%。这些结果都明显高于尿脱落细胞学的阳性检出率(60%)。因而，他们认为这种检测方法不仅具有尿脱落细胞学的快速、简便、无创伤的优点，同时也明显提高了检出膀胱肿瘤患者的敏感性，是一种较有潜力的新的检测手段。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Haynes B F,Marilyn J T,Laura P H,et al.CD44-A molecule involved in leukocyte adherence and T-cell activation.Immunol Today,1989,10:423～426
2，Matsumura Y,Tarin D.Significane of CD44 gene products for cancer diagnosis and diease evaluation.Lancet,1992,340:1053～1055
3，Screaton G R,Bell M V,Jackson D G,et al.Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spliced exons.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:12160～12161
, 百拇医药
4，Gunthert U,Stauder R,Mayer B,et al.Are CD44 variant isoforms involved in human tumor progression?Cancer Surv,1995,24:19～42
5，Stevens J W,Palechek P L,Griebling T L,et al.Exprssion of CD44 isoforms in human prostate tumor cell lines.Prostate,1996,28:153～161
6，Gunthrt U,Hofman M,Rudy W,et al.A new variant of glycoprotein CD44 cofers metastatic potential to rat carcinoma cells.Cell,1991,65:13～18
, 百拇医药
7，Woodman A C,Sugiyama M,Yoshida K,et al.Analysis of anomalous CD44 gene expression in human breast.bladder and colon cancer and correlation of observed mRNA and protein isoforms.Am J Pathol,1996,149:1519～1521
8，Kan M,Furukawa A,Aki M,et al.Expression of CD44 splice variants in bladder cancer.Int,J Urol,1995,2:295～297
9，Takada S,Namiki M,Matsumiya K,et al.Expression of CD44 splice variants in human transitional celll carcinoma.Eur Urol,1996,29:370～372
10，吴忠，张元芳，刘定干，等.尿脱落细胞CD44基因变异表达产物对膀胱癌诊断价值的研究.中华泌尿外科杂志，1996，9：545～547
(收稿 2000-07-10), 百拇医药
单位：李文洲 陈晓春(武汉市第二医院泌尿外科 武汉，430014)；张齐钧(同济医科大学附属协和医院泌尿外科)
关键词：细胞粘着分子；膀胱肿瘤；荧光免疫测定
临床泌尿外科杂志001214 摘要 目的：探讨细胞粘着分子CD44V6在膀胱肿瘤中的作用及其临床意义。方法：利用免疫荧光法检测了28例膀胱肿瘤和5例正常膀胱移行上皮组织中CD44V6的表达情况。结果：浸润型膀胱肿瘤组织CD44V6阳性表达率为44.44%和75.00%，浅表型膀胱肿瘤阳性表达率为13.33%(P<0.05)，正常组织均阴性表达。半定量检测分析显示CD44V6的表达水平与肿瘤的分级和分期相关。结论：CD44V6的检测是一种提示肿瘤浸润和预后有实用价值的诊断指标。
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The expression of CD44V6 protein in bladder cancer
LI Wen-zhou
(Department of Urology,the Second Hospital,Wuhan ,430014)
ZHANG Qi-jun CHEN Xiao-chun
(Deparment of Urology,the Affiliated Xiehe Hospital,Tongji Medical University)
Abstract Purpose:To investigate the expression and significance of CD44V6 adhesion molecule in human bladder tumor tissue. Methods:We examined the expression of CD44V6 Protein in 28 bladder transitional cell carcinomas and 5 normal urinary transitional epithelial tissues by immunofluorescence using CD44V6 specific antiboby. Results: 7 of 13 invasive TCCs were positive staining and 2 of 15 superficial TCCs positive(P<0.05).In contrast, 5 normal tissues were negative. Semi-quantitative analyses revealed that up regulation of CD44V6 protein expression correlated with high tumor grade and stage. Conclusions:Evaluation of CD44V6 protein expression may be a useful diagnostic parameter indicating invasive processes and progress with poor prognosis.
, 百拇医药
Key words Cell adhesion molecules Bladder neoplasms Fluoroimmunoassay
细胞粘着分子CD44是一类分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，在人类正常的淋巴细胞、成纤维细胞和一部分上皮细胞上均有表达，属粘着分子中选择素家族中的一员，主要参与细胞与细胞、细胞与基质间的粘连〔1〕。近年来，人们在许多人类肿瘤细胞表面已检测到CD44的表达，并发现CD44的表达与肿瘤的发生、发展有关，尤其是近几年发现的倍受人们观注的CD44的变异拼接体V6(CD44V6)在多数人类肿瘤细胞上都有表达，其表达水平与肿瘤的生物学特性有着十分密切的联系〔2〕。甚至有人将CD44V6视为一种判断肿瘤的发生、发展及其预后的临床检测指标。为探讨CD44V6在膀胱肿瘤中的作用及其意义，我们对CD44V6在膀胱肿瘤中的表达进行了研究，现将结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 标本来源
本文28例膀胱肿瘤标本均取自手术切除的新鲜组织，经常规病理切片证实为膀胱移行细胞癌。其中男25例，女3例，年龄30～78岁，平均61.4岁。病理分级按WHO标准分为G117例(G1组)，G210例(G2组)，G31例(G3组)，临床分期按UICC拟定的分期标准分为Ta-115例(Ta-1组)，T29例，T34例(T2加T3组)。此外，另取5例非肿瘤患者的膀胱组织作为正常对照组。
1.2 标本制备
将手术切除的新鲜组织迅速置于液氮中速冻，再置于-70℃低温冰箱中保存。用冷冻切片机切出5 μm切片，用丙酮固定10 min，风干，置于4℃冰箱中保存备用。
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1.3 检测方法
一抗CD44V6单抗(兔)购自武汉博士德生物工程有限公司(美国Calbiochem-Novabiochem公司产品)，二抗荧光抗体(羊抗兔)为武汉生物制品研究所产品。
将风干切片用10%小牛血清封闭，加一抗置于4℃冰箱中过夜，再加二抗，用德国产Leitz荧光显微镜观察并摄片。
1.4 结果评估
定性检测：在高倍镜视野下，肿瘤细胞膜荧光着色者为阳性，未着色者为阴性，计阳性率。半定量检测：每个阳性病例等距抽样选择10个高倍镜视野，并计算阳性细胞数。按肿瘤的不同分期和分级，分别计其阳性细胞平均数值。
1.5 统计学处理
, 百拇医药 各组间阳性率的比较采用χ2检验，各组间阳性细胞均数比较采用F分析。
2 结果
2.1 定性检测结果
详见表1。
2.2 半定量检测结果
各组检测结果见表2和表3。
表1 临床分期各组间CD44V6阳性率的比较 组别
标数
阳性数
阴性数
阳性率(%)
, 百拇医药
Ta-1
15
2
13
13.33
T2
9
4
5
44.44
T3
4
3
, 百拇医药
1
75.00
合计
28
9
19
32.14
χ2检验，P<0.05表2 病理分级各组间阳性细胞数均值的比较 组别
标本
自由度(n)
均值
, 百拇医药
标准差(s)
G1
3
30
21.80
9.57
G2
5
50
29.68
11.42
G3
, http://www.100md.com 1
10
39.30
11.81
各组间比较差异有极显著性意义(P<0.01)表3 临床分期各组间阳性细胞数均值的比较 组别
标本数
自由度(n)
均值(
)标准差(s)
Ta-1
2
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20
17.70
7.429
T2
4
40
27.25
9.515
T3
3
30
36.23
11.866
, 百拇医药
各组间比较差异有极显著性意义(P<0.01)
从上述结果可以看出，浸润型膀胱肿瘤(T2和T3)的CD44V6阳性率(44.44%和75.00%)明显高于浅表型膀胱肿瘤(Ta-1)的阳性率(13.33%)，而正常对照组均为阴性表达。半定量检测分析显示CD44V6的表达水平随膀胱肿瘤病理分级和临床分期的增高而升高。
3 讨论
人类CD44编码基因位于第11号染色体短臂上。人们利用PCR技术和酵母人工染色体克隆技术研究发现CD44基因至少含有20个外显子〔3〕。含有10个固定组成型外显子的转录子称为标准型的CD44(即CD44S)，由它编码的成熟蛋白含有361个氨基酸，其分子量为80 000～90 000。含有V区(即插入区)变异拼接外显子的转录子统称为CD44V，其蛋白表达产物的分子结构多样复杂，且分子量较CD44S大，一般为140 000～160 000，少数可高达215 000〔1〕。近年来，人们研究发现在CD44拼接变异体中，以CD44V6最为多见。在人类的乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾癌等中均能检出CD44V6异常表达，并发现它与肿瘤细胞分化、肿瘤的浸润转移有关〔4〕。而且在许多体外培养的肿瘤细胞系上，人们也检测到了CD44V6表达，并发现其表达水平与肿瘤细胞的恶性程度和转移潜能呈正相关〔5，6〕。
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本文研究发现，在28例膀胱移行上皮癌中，有32.14%的标本有CD44V6阳性表达。特别值得注意的是，在浸润型膀胱肿瘤中(T2和T3)，CD44V6的阳性率(44.44%和75.00%)明显高于浅表型膀胱肿瘤(Ta-1)中的阳性率(13.33%)。由此提示CD44V6的表达可能与肿瘤的恶性表型有关，恶性程度高，其阳性表达率亦高。Woodman等〔7〕亦有类似的结论。Kan等〔8〕利用Southern斑点原位杂交技术，从基因水平检测膀胱肿瘤中CD44V6的表达情况，发现CD44V6阳性表达率高达81.8%。这可能是因为他们的检测方法更为敏感、精确，也可能是因膀胱肿瘤中CD44V6在基因水平和蛋白水平的表达存在着差异的缘故。
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我们在研究中还利用半定量的检测方法，比较了各病理分级和临床分期间CD44V6蛋白的阳性细胞数，发现CD44V6阳性细胞数随着肿瘤的分级和分期的增高而升高。这进一步提示CD44V6的表达水平与膀胱肿瘤的细胞分化程度、肿瘤浸润程度有关，我们推测CD44V6的表达可能是评价膀胱肿瘤恶性程度和预后的一种新的临床检测指标，对我们临床诊断、治疗及预后有一定的指导意义。
在膀胱肿瘤的早期诊断和筛选中，尿脱落细胞学检查是一项十分重要的手段。近年来，有人利用RT-PCR技术检测膀胱肿瘤患者尿脱落细胞中CD44V6基因的表达情况，发现其阳性检出率为71.5%〔9〕。我国吴忠等〔10〕也作过类似研究工作，其阳性检出率更高达90%。这些结果都明显高于尿脱落细胞学的阳性检出率(60%)。因而，他们认为这种检测方法不仅具有尿脱落细胞学的快速、简便、无创伤的优点，同时也明显提高了检出膀胱肿瘤患者的敏感性，是一种较有潜力的新的检测手段。
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参考文献
1，Haynes B F,Marilyn J T,Laura P H,et al.CD44-A molecule involved in leukocyte adherence and T-cell activation.Immunol Today,1989,10:423～426
2，Matsumura Y,Tarin D.Significane of CD44 gene products for cancer diagnosis and diease evaluation.Lancet,1992,340:1053～1055
3，Screaton G R,Bell M V,Jackson D G,et al.Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spliced exons.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:12160～12161
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4，Gunthert U,Stauder R,Mayer B,et al.Are CD44 variant isoforms involved in human tumor progression?Cancer Surv,1995,24:19～42
5，Stevens J W,Palechek P L,Griebling T L,et al.Exprssion of CD44 isoforms in human prostate tumor cell lines.Prostate,1996,28:153～161
6，Gunthrt U,Hofman M,Rudy W,et al.A new variant of glycoprotein CD44 cofers metastatic potential to rat carcinoma cells.Cell,1991,65:13～18
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7，Woodman A C,Sugiyama M,Yoshida K,et al.Analysis of anomalous CD44 gene expression in human breast.bladder and colon cancer and correlation of observed mRNA and protein isoforms.Am J Pathol,1996,149:1519～1521
8，Kan M,Furukawa A,Aki M,et al.Expression of CD44 splice variants in bladder cancer.Int,J Urol,1995,2:295～297
9，Takada S,Namiki M,Matsumiya K,et al.Expression of CD44 splice variants in human transitional celll carcinoma.Eur Urol,1996,29:370～372
10，吴忠，张元芳，刘定干，等.尿脱落细胞CD44基因变异表达产物对膀胱癌诊断价值的研究.中华泌尿外科杂志，1996，9：545～547
(收稿 2000-07-10), 百拇医药