肺表面活性物质结合蛋白AcDNA克隆及序列分析
作者：姬毅 封志纯 黄建生 任大明
单位：姬毅(510282 广州，第一军医大学珠江医院儿科)；封志纯(510282 广州，第一军医大学珠江医院儿科)；黄建生(上海复旦大学遗传所)；任大明(上海复旦大学遗传所)
关键词：肺表面活性剂；蛋白脂质类；DNA；互补；序列分析
中华儿科杂志000308 【摘要】 目的 获得中国人的肺表面活性物质结合蛋白A(SP-A) 6A cDNA 基因克隆，并进行序列分析，为进一步研究中国人SP-A基因型特点提供方法和资料，同时也为SP-A基因表达调控。方法以正常人肺组织mRNA为模板，采用逆转录反应(RT)-PCR、巢式-PCR及基因克隆技术，获得pUC19/SP-A 6A克隆，并测序证实。结果 从正常中国人肺组织中提取到完整mRNA，经RT-PCR、巢式-PCR扩增，得到约840 bp目的片段，分别用BamH I、Hind III 和Pst I酶切，酶切片段与分析结果一致，分别为138、275、416、388和417 bp。将840 bp目的片段与测序载体连接，测序结果显示，与已发表的SP-A 6A 序列相比，有若干个碱基不同，随机重复2个克隆，证实位于第19、62、133位密码子的改变是稳定存在的。结论 证实获得的中国人SP-A基因克隆为6 A3 型。
, 百拇医药
Cloning and sequencing analysis of Chinese pulmonary surfactant protein A cDNA
JI Yi
(Department of Pediatrics, Zhujiang Hospital, The First Military Medical University, Guangzhou 510282 ,China)
FENG Zhichun, HUANG Jiansheng
【Abstract】 Objective To obtain and sequence Chinese cDNA clone of pulmonary surfactant protein A (SP-A) in order to further study SP-A gene structure, expression regulation and genetic engineering in Chinese. Methods The mRNA from normal lungs was used as template. By using the techniques of RT-PCR, nest-PCR and cloning, the pUC 19/SP-A 6 A clone was established and sequenced. Results The high quality mRNA was extracted from the normal Chinese lung tissues and a 840 bp fragment was obtained by RT-PCR and nest-PCR. With BamHI, HindIII and PstI, fragments of 138 bp, 275 bp, 416 bp, 388 bp and 417 bp cDNA were obtained, which are similar to PCGENE. The 840 bp cDNA was linked with pUC 19 and sequenced. Compared with the published SP-A 6A sequences, there were several bases changed, 2 clones repeated. The changes at codon 19,62 and 133 were stable. Conclusion It was approved SP-A clone in Chinese was 6A3 subtype.
, 百拇医药
【Key words】 Pulmonary surfactants; Proteolipids; DNA, complementary; Sequence analysis
呼吸窘迫综合征(RDS)是一种严重危害人民健康的疾病，其主要原因是由于肺表面活性物质(pulmonary surfactant, PS)原发性或继发性减少，与一定的遗传背景有关[1，2]。PS替代治疗是唯一有效的治疗措施，人工合成磷脂与肺表面活性物质结合蛋白(SP)基因工程产物混合使用将是最有前途的配方[3]。因此，研究SP基因结构不仅是了解RDS发生、发展的需要，更是发展SP基因工程生产，广泛开展PS替代治疗的需要。
材料和方法
一、主要实验材料、试剂、溶液和仪器
1.材料:(1) 正常人肺组织:上海第二军医大学附属长征医院胸外科提供。(2) 引物:根据已知SP-A序列和PCR引物要求，设计引物一对。上游引物Primer(+)位于59～81 位碱基，并在5′端引入EcoR I酶切位点；下游引物Primer(-)1位于889～ 910位碱基；同时根据国外文献，选用SP-A 6 A特异性引物一条Primer(-)2，位于864～888位碱基，并在5′端引入Sal I酶切位点。引物均由上海Sangon 生物工程公司合成。(3) pUC 19质粒 、DH 5α菌种由本实验室保存。
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2.试剂: AMV 逆转录酶、Taq 酶、 PCR 分子量标记、Sal I、 EcoR I、T4 DNA 连接酶、RNA酶抑制剂等试剂分别购自美国Promega公司、Sigma公司、德国Boehringer mannheim公司和华美生化试剂公司。
3.溶液：硫氰酸胍匀浆缓冲液购自上海华舜生物工程公司。
4.仪器：50 ml/10 ml高速冷冻离心机(日本HITACH)、1.5 ml/0.5 ml高速冷冻离心机(德国 Heraeus)、2400 PCR仪(美国PE公司)、微量进样器(法国Gilson)、凝胶成像系统(美国Pharmesia)、摇床(美国New bruswick公司)。
二、实验方法
1.RNA抽提:用异硫氰胍一步法快速抽提总RNA，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，加pH 5.0 醋酸钠至0.25 mol/L，2.5倍体积乙醇，-70℃保存。
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2.逆转录反应(RT)：5 μg总RNA，5×RT缓冲液5.0 μl，primer(-)1 25 pmol, 2.5 mmol/L脱氧核苷三磷酸3.0 μl, 0.1 mol/L 二硫苏糖醇 1.0 μl，50 U RNA酶抑制剂，加双蒸水至25 μl，50℃，5 min;加40 U AMV逆转录酶，42℃，60 min，95℃，6 min。
3.PCR反应：逆转录产物3.0 μl，10×PCR缓冲液5.0 μl，下游引物primer(-)1、上游引物primer(+)各25 pmol/L，2.5 mmol/L脱氧核苷三磷酸5.0 μl,50 mmol/L MgCl2 1.0 μl, 94℃，5 min，于冰中加Taq聚合酶 1 U，95℃，30 s，66℃，45 s，72℃，60 s，共30个循环，72℃，7 min，回收PCR产物。
4.巢式-PCR:以PCR产物为模板，以primer(-)2、primer(+)为引物，再次PCR反应，回收巢式-PCR产物，用Hind III、BamH I及Pst I酶切鉴定。37℃，30 min，2.5%琼脂糖电泳初步鉴定目的片段。
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5.酶切、连接、转化：EcoR I、Sa lI酶切回收的巢式-PCR产物产物及pUC 19载体，37℃，5 h，酶切完全的PCR产物和pUC 19 ，回收目的片段。16℃连接过夜，65℃，5 min失活连接酶。用冰冻CaCl2制备新鲜感受态细胞，连接液转化100 μl 大肠杆菌DH 5α感受态细胞。挑选白色菌落并鉴定之。
6.转化子的鉴定：(1)用EcoR I、Sa lI双酶切法鉴定转化子。(2)DNA序列测定：按常规提取已鉴定的质粒，经纯化，用PE 377自动测序仪测序。
结果
一、RNA抽提
抽提的RNA在1%琼脂糖甲醛凝胶上于80 V，电泳2 h，电泳图谱见图1。
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1～4为提纯的mRNA
图1 电泳2 h 的图谱
二、巢式PCR产物酶切鉴定
RT-PCR产物条带具有希望大小的分子量(840 bp)，但除少量引物二聚体外，有明显杂带，且产量不高。Glassmilk回收目的产物，再进行巢式-PCR，可获得一明亮、单一的条带，约840 bp，分别用BamH I、Hind III和Pst I酶切。酶切片段与PCGENE分析结果一致:BamH I、Hind III酶切片段为138 bp、275 bp和416 bp；Pst I 酶切片段为388 bp和417 bp，电泳图谱见图2。
1 为λHind III/EcoR I 分子量标记
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2 为RT-PCR产物
3 为Nest-PCR产物
4 为BamH I/Hind III酶切PCR产物
5 为Pst I酶切PCR产物
图2 Nest-PCR产物酶切鉴定图谱
三、转化子的鉴定
1.EcoR I/ Sal I双酶切鉴定：挑取白色转化菌落接种入LB培养液(含氨苄青霉素)中， 37℃培养过夜。快速抽提DNA，用EcoR I/ Sa lI双酶切，得到一条840 bp片段(图3)，证明所得到的转化子已经正确地插入了目的片段。
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1 为λEcoR I/Hind III分子量标记
2 为pUC19 vector；
3 为 pUC19 /SP-A 6A转化子；
4 为pUC19 EcoR I、Sa lI双酶切；
5 为转化子EcoR I、Sa lI双酶切；
图3 转化子双酶切定图谱
2.SP-A 6A克隆测序结果：测序结果显示，与已发表的SP-A 6A 序列相比[4]，有若干碱基不同，重复2个克隆，证实位于第19、62、133位密码子改变是稳定存在的。
讨论
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PS是维持肺泡扩张，保持呼吸系统正常功能的重要物质，由肺泡II型细胞分泌，是一种复杂的脂蛋白混合物，含脂类90%，蛋白约5%～10%。迄今已发现了4种SP。其中SP-A分子量最大，含量最丰富，结构和功能最复杂。SP-A是一种亲水糖蛋白，单体分子量大约32 000。人SP-A肽链有2型(SP-A I、SP-A II)，两者同源性达96%。2条SP-A I和1条SP-A II肽链互相缠绕形成3股螺旋结构；6个3股螺旋结构亚基通过共价键连接在一起，形成一个分子量约为700 000的大分子，呈花束样。在肺泡表面，SP-A多以这种18多聚体的形式存在。尽管已有研究表明SP-A并不能像SP-B、SP-C那样直接增加磷脂的表面活性，但对于维持PS活性前体-管髓体的正常结构却是不可缺少的[5，6]。 此外，SP-A还与SP的代谢有关。近年来，越来越多的研究发现了SP-A在局部免疫系统中的作用[7]，开辟了SP-A一个崭新的研究领域。
随着分子生物学技术的飞速发展，关于SP-A基因结构的研究获得了令人注目的结果，不仅更深入地阐明了RDS的发生、发展机制，而且为SP-A基因调控的研究、基因工程生产打下了良好的基础。
, http://www.100md.com
本实验以正常人肺组织为材料提取总mRNA，采用RT-PCR技术获得SP-A cDNA克隆。与已发表的序列比较，有几个碱基不同。重复2个克隆，发现第19、62、133位，分别为GCG→GTG、CCG→CCA、ACG→ACA，密码子变化稳定，说明这些碱基的变化不是由PCR过程中碱基错配引起，而是因为原始模板的不同。根据已发表文献，可以知道获得的SP-AcDNA克隆基因型为6A3[8，9]。另外,各个克隆又有一些单一的碱基变化，产生该变化的原因有：(1) PCR过程中碱基错配，可通过选用高保证TaQ酶、降低引物和脱氧核苷三磷酸浓度、提高退火温度等方法减少错配。但PCR错配率一般小于1/1 000，不足以解释本实验结果中碱基的变化。(2) 根据已发表的文献和测序结果中稳定的碱基变化，推测本次实验获得一个SP-A 6A3克隆，但不应同时有其他碱基的变化。是否中国人SP-A基因存在新的亚型，还需进一步证实。中国人SP-A基因获得为进一步研究SP-A基因结构、基因调控和基因表达提供了基础。
, http://www.100md.com 基金项目：广东省自然科学基金项目资助 (950558)
参考文献
1，Hafez M, El-Sallab SH, Khashaba M, et al. Evidence of HLA-linked susceptibility genes in respiratory distress syndrome. Dis Mark,1989，7:201-208.
2，Nagourney BA, Usher RH, Kramer MS. Is there a familial tendency in the etiology of respiratory distress syndrome. Pediatr Res, 1990,27:1288.
3，丁自强.成人呼吸窘迫综合征和肺表面活性物质替代治疗.生理科学进展，1992，23：141.
, http://www.100md.com
4，Floros J, Steninbrink R, Fritsch E, et al. Isolation and characterization of cDNA clones for the 35kDa pulmonary surfactant-associated protein. J Biol Chem, 1986,261:9029-9033.
5，陈政良.SP-A的分子生物学.国外医学分子生物学分册, 1997,19:241.
6，陶少华.人肺表面活性物质结合蛋白A的研究现状.国外医学妇幼保健分册，1997，8：117.
7，Manz KH, Plattner H, Schlepper SJ. Lung surfactant protein enhances serum-indepent phagocytosis of bacteria by alveolar macrophages. Eur J Cell Biol,1992,57:95-100.
, 百拇医药
8，Floros J, Rishi A, Veletza SV, et al. Concerted and independent genetic events in the 3′ untranslated region of the human surfactant protein genes. Am J Hum Genet, 1993,53:A 683.
9，Karich AM, Floros J. 5′splicing and allelic variants of the human Pulmonary surfactant-protein A genes. Am J Respir Cell Mol Biol, 1995,12:77-88.
(收稿日期：1999-03-24), http://www.100md.com
单位：姬毅(510282 广州，第一军医大学珠江医院儿科)；封志纯(510282 广州，第一军医大学珠江医院儿科)；黄建生(上海复旦大学遗传所)；任大明(上海复旦大学遗传所)
关键词：肺表面活性剂；蛋白脂质类；DNA；互补；序列分析
中华儿科杂志000308 【摘要】 目的 获得中国人的肺表面活性物质结合蛋白A(SP-A) 6A cDNA 基因克隆，并进行序列分析，为进一步研究中国人SP-A基因型特点提供方法和资料，同时也为SP-A基因表达调控。方法以正常人肺组织mRNA为模板，采用逆转录反应(RT)-PCR、巢式-PCR及基因克隆技术，获得pUC19/SP-A 6A克隆，并测序证实。结果 从正常中国人肺组织中提取到完整mRNA，经RT-PCR、巢式-PCR扩增，得到约840 bp目的片段，分别用BamH I、Hind III 和Pst I酶切，酶切片段与分析结果一致，分别为138、275、416、388和417 bp。将840 bp目的片段与测序载体连接，测序结果显示，与已发表的SP-A 6A 序列相比，有若干个碱基不同，随机重复2个克隆，证实位于第19、62、133位密码子的改变是稳定存在的。结论 证实获得的中国人SP-A基因克隆为6 A3 型。
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Cloning and sequencing analysis of Chinese pulmonary surfactant protein A cDNA
JI Yi
(Department of Pediatrics, Zhujiang Hospital, The First Military Medical University, Guangzhou 510282 ,China)
FENG Zhichun, HUANG Jiansheng
【Abstract】 Objective To obtain and sequence Chinese cDNA clone of pulmonary surfactant protein A (SP-A) in order to further study SP-A gene structure, expression regulation and genetic engineering in Chinese. Methods The mRNA from normal lungs was used as template. By using the techniques of RT-PCR, nest-PCR and cloning, the pUC 19/SP-A 6 A clone was established and sequenced. Results The high quality mRNA was extracted from the normal Chinese lung tissues and a 840 bp fragment was obtained by RT-PCR and nest-PCR. With BamHI, HindIII and PstI, fragments of 138 bp, 275 bp, 416 bp, 388 bp and 417 bp cDNA were obtained, which are similar to PCGENE. The 840 bp cDNA was linked with pUC 19 and sequenced. Compared with the published SP-A 6A sequences, there were several bases changed, 2 clones repeated. The changes at codon 19,62 and 133 were stable. Conclusion It was approved SP-A clone in Chinese was 6A3 subtype.
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【Key words】 Pulmonary surfactants; Proteolipids; DNA, complementary; Sequence analysis
呼吸窘迫综合征(RDS)是一种严重危害人民健康的疾病，其主要原因是由于肺表面活性物质(pulmonary surfactant, PS)原发性或继发性减少，与一定的遗传背景有关[1，2]。PS替代治疗是唯一有效的治疗措施，人工合成磷脂与肺表面活性物质结合蛋白(SP)基因工程产物混合使用将是最有前途的配方[3]。因此，研究SP基因结构不仅是了解RDS发生、发展的需要，更是发展SP基因工程生产，广泛开展PS替代治疗的需要。
材料和方法
一、主要实验材料、试剂、溶液和仪器
1.材料:(1) 正常人肺组织:上海第二军医大学附属长征医院胸外科提供。(2) 引物:根据已知SP-A序列和PCR引物要求，设计引物一对。上游引物Primer(+)位于59～81 位碱基，并在5′端引入EcoR I酶切位点；下游引物Primer(-)1位于889～ 910位碱基；同时根据国外文献，选用SP-A 6 A特异性引物一条Primer(-)2，位于864～888位碱基，并在5′端引入Sal I酶切位点。引物均由上海Sangon 生物工程公司合成。(3) pUC 19质粒 、DH 5α菌种由本实验室保存。
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2.试剂: AMV 逆转录酶、Taq 酶、 PCR 分子量标记、Sal I、 EcoR I、T4 DNA 连接酶、RNA酶抑制剂等试剂分别购自美国Promega公司、Sigma公司、德国Boehringer mannheim公司和华美生化试剂公司。
3.溶液：硫氰酸胍匀浆缓冲液购自上海华舜生物工程公司。
4.仪器：50 ml/10 ml高速冷冻离心机(日本HITACH)、1.5 ml/0.5 ml高速冷冻离心机(德国 Heraeus)、2400 PCR仪(美国PE公司)、微量进样器(法国Gilson)、凝胶成像系统(美国Pharmesia)、摇床(美国New bruswick公司)。
二、实验方法
1.RNA抽提:用异硫氰胍一步法快速抽提总RNA，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，加pH 5.0 醋酸钠至0.25 mol/L，2.5倍体积乙醇，-70℃保存。
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2.逆转录反应(RT)：5 μg总RNA，5×RT缓冲液5.0 μl，primer(-)1 25 pmol, 2.5 mmol/L脱氧核苷三磷酸3.0 μl, 0.1 mol/L 二硫苏糖醇 1.0 μl，50 U RNA酶抑制剂，加双蒸水至25 μl，50℃，5 min;加40 U AMV逆转录酶，42℃，60 min，95℃，6 min。
3.PCR反应：逆转录产物3.0 μl，10×PCR缓冲液5.0 μl，下游引物primer(-)1、上游引物primer(+)各25 pmol/L，2.5 mmol/L脱氧核苷三磷酸5.0 μl,50 mmol/L MgCl2 1.0 μl, 94℃，5 min，于冰中加Taq聚合酶 1 U，95℃，30 s，66℃，45 s，72℃，60 s，共30个循环，72℃，7 min，回收PCR产物。
4.巢式-PCR:以PCR产物为模板，以primer(-)2、primer(+)为引物，再次PCR反应，回收巢式-PCR产物，用Hind III、BamH I及Pst I酶切鉴定。37℃，30 min，2.5%琼脂糖电泳初步鉴定目的片段。
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5.酶切、连接、转化：EcoR I、Sa lI酶切回收的巢式-PCR产物产物及pUC 19载体，37℃，5 h，酶切完全的PCR产物和pUC 19 ，回收目的片段。16℃连接过夜，65℃，5 min失活连接酶。用冰冻CaCl2制备新鲜感受态细胞，连接液转化100 μl 大肠杆菌DH 5α感受态细胞。挑选白色菌落并鉴定之。
6.转化子的鉴定：(1)用EcoR I、Sa lI双酶切法鉴定转化子。(2)DNA序列测定：按常规提取已鉴定的质粒，经纯化，用PE 377自动测序仪测序。
结果
一、RNA抽提
抽提的RNA在1%琼脂糖甲醛凝胶上于80 V，电泳2 h，电泳图谱见图1。
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1～4为提纯的mRNA
图1 电泳2 h 的图谱
二、巢式PCR产物酶切鉴定
RT-PCR产物条带具有希望大小的分子量(840 bp)，但除少量引物二聚体外，有明显杂带，且产量不高。Glassmilk回收目的产物，再进行巢式-PCR，可获得一明亮、单一的条带，约840 bp，分别用BamH I、Hind III和Pst I酶切。酶切片段与PCGENE分析结果一致:BamH I、Hind III酶切片段为138 bp、275 bp和416 bp；Pst I 酶切片段为388 bp和417 bp，电泳图谱见图2。
1 为λHind III/EcoR I 分子量标记
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2 为RT-PCR产物
3 为Nest-PCR产物
4 为BamH I/Hind III酶切PCR产物
5 为Pst I酶切PCR产物
图2 Nest-PCR产物酶切鉴定图谱
三、转化子的鉴定
1.EcoR I/ Sal I双酶切鉴定：挑取白色转化菌落接种入LB培养液(含氨苄青霉素)中， 37℃培养过夜。快速抽提DNA，用EcoR I/ Sa lI双酶切，得到一条840 bp片段(图3)，证明所得到的转化子已经正确地插入了目的片段。
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1 为λEcoR I/Hind III分子量标记
2 为pUC19 vector；
3 为 pUC19 /SP-A 6A转化子；
4 为pUC19 EcoR I、Sa lI双酶切；
5 为转化子EcoR I、Sa lI双酶切；
图3 转化子双酶切定图谱
2.SP-A 6A克隆测序结果：测序结果显示，与已发表的SP-A 6A 序列相比[4]，有若干碱基不同，重复2个克隆，证实位于第19、62、133位密码子改变是稳定存在的。
讨论
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PS是维持肺泡扩张，保持呼吸系统正常功能的重要物质，由肺泡II型细胞分泌，是一种复杂的脂蛋白混合物，含脂类90%，蛋白约5%～10%。迄今已发现了4种SP。其中SP-A分子量最大，含量最丰富，结构和功能最复杂。SP-A是一种亲水糖蛋白，单体分子量大约32 000。人SP-A肽链有2型(SP-A I、SP-A II)，两者同源性达96%。2条SP-A I和1条SP-A II肽链互相缠绕形成3股螺旋结构；6个3股螺旋结构亚基通过共价键连接在一起，形成一个分子量约为700 000的大分子，呈花束样。在肺泡表面，SP-A多以这种18多聚体的形式存在。尽管已有研究表明SP-A并不能像SP-B、SP-C那样直接增加磷脂的表面活性，但对于维持PS活性前体-管髓体的正常结构却是不可缺少的[5，6]。 此外，SP-A还与SP的代谢有关。近年来，越来越多的研究发现了SP-A在局部免疫系统中的作用[7]，开辟了SP-A一个崭新的研究领域。
随着分子生物学技术的飞速发展，关于SP-A基因结构的研究获得了令人注目的结果，不仅更深入地阐明了RDS的发生、发展机制，而且为SP-A基因调控的研究、基因工程生产打下了良好的基础。
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本实验以正常人肺组织为材料提取总mRNA，采用RT-PCR技术获得SP-A cDNA克隆。与已发表的序列比较，有几个碱基不同。重复2个克隆，发现第19、62、133位，分别为GCG→GTG、CCG→CCA、ACG→ACA，密码子变化稳定，说明这些碱基的变化不是由PCR过程中碱基错配引起，而是因为原始模板的不同。根据已发表文献，可以知道获得的SP-AcDNA克隆基因型为6A3[8，9]。另外,各个克隆又有一些单一的碱基变化，产生该变化的原因有：(1) PCR过程中碱基错配，可通过选用高保证TaQ酶、降低引物和脱氧核苷三磷酸浓度、提高退火温度等方法减少错配。但PCR错配率一般小于1/1 000，不足以解释本实验结果中碱基的变化。(2) 根据已发表的文献和测序结果中稳定的碱基变化，推测本次实验获得一个SP-A 6A3克隆，但不应同时有其他碱基的变化。是否中国人SP-A基因存在新的亚型，还需进一步证实。中国人SP-A基因获得为进一步研究SP-A基因结构、基因调控和基因表达提供了基础。
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参考文献
1，Hafez M, El-Sallab SH, Khashaba M, et al. Evidence of HLA-linked susceptibility genes in respiratory distress syndrome. Dis Mark,1989，7:201-208.
2，Nagourney BA, Usher RH, Kramer MS. Is there a familial tendency in the etiology of respiratory distress syndrome. Pediatr Res, 1990,27:1288.
3，丁自强.成人呼吸窘迫综合征和肺表面活性物质替代治疗.生理科学进展，1992，23：141.
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4，Floros J, Steninbrink R, Fritsch E, et al. Isolation and characterization of cDNA clones for the 35kDa pulmonary surfactant-associated protein. J Biol Chem, 1986,261:9029-9033.
5，陈政良.SP-A的分子生物学.国外医学分子生物学分册, 1997,19:241.
6，陶少华.人肺表面活性物质结合蛋白A的研究现状.国外医学妇幼保健分册，1997，8：117.
7，Manz KH, Plattner H, Schlepper SJ. Lung surfactant protein enhances serum-indepent phagocytosis of bacteria by alveolar macrophages. Eur J Cell Biol,1992,57:95-100.
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8，Floros J, Rishi A, Veletza SV, et al. Concerted and independent genetic events in the 3′ untranslated region of the human surfactant protein genes. Am J Hum Genet, 1993,53:A 683.
9，Karich AM, Floros J. 5′splicing and allelic variants of the human Pulmonary surfactant-protein A genes. Am J Respir Cell Mol Biol, 1995,12:77-88.
(收稿日期：1999-03-24), http://www.100md.com