共刺激PBLs作用肝癌细胞TCR Vβ基因表达与PTK活性*
作者：杨 红 黄树林
单位：广东药学院分子生物学研究室 广东省广州市 510224
关键词：肝肿瘤；T细胞受体Vβ基因；基因表达；蛋白质酪氨酸激酶
世界华人消化杂志990404 摘 要
目的 探讨在T细胞活化信号传递中特异性识别和杀伤肝癌抗原的T细胞受体(TCR)Vβ基因亚家族的表达特征，及与蛋白质酪氨酸激酶(PTK)活性的关系.
方法 用单克隆抗体CD28+B7.1(CD80)共刺激正常人外周血淋巴细胞(PBLs)后作用于肝癌细胞(BEL-7402)，用RT-PCR，Southern印迹、Western印迹分析TCR Vβ基因表达特征及PTK含量.
结果 TCR Vβ7基因在体外选择性扩增，d4表达水平最高，为24%，对照组为6%，相应地PTK的含量也较高，为58%，对照组为11%.
, http://www.100md.com
结论 Vβ7基因特异性识别肝癌抗原，并介导PTK信号转导途径的激活.
中国图书资料分类号 R735.7
TCR Vβ gene expression and PTK activity of co-stimulated PBLs action on hepatoma cells*
YANG Hong and HUANG Shu-Lin
Department of Molecular Biology, Guangdong Pharmacy College, Guangzhou 510224, Guangdong Province, China
Subject headings liver neoplasms; T cell receptor Vβ gene; gene expression; protein tyrosine kinase
, 百拇医药
Abstract
AIM To study the T cell receptor (TCR) and Vβ genes subfamilies expression characters in recognizing and killing hepatoma antigen and its relationship to activity of protein tyrosine kinase (PTK).
METHODS After monoclonal antibody CD28+CD80(B7.1) co-stimulated healthy human peripheral blood lymphocytes (PBLs), and acted on hepatoma cell (BEL-7402), TCR Vβ7 gene expression characters and PTK activity were analyzed with PT-PCR, Southern-blot and Western-blot.
, 百拇医药
RESULTS TCR Vβ7 gene was amplified selectively, the expression level was the highest (24%), at day 4 in experimental group, but in the control group, 6%. The PTK was 58% in experimental group, but in the control group, 11%.
CONCLUSION Vβ7 gene is special in recognizing hepatoma antigen, inducing the activation of PTK signal translation.
0 引言
T细胞受体(TCR)是参与特异性免疫的重要分子，在T淋巴细胞活化过程中识别和结合配体. 研究发现正常个体在抗原刺激下，外周血淋巴细胞(PBLs) TCR Vβ基因随抗原类型不同或疾病的不同临床阶段呈选择性扩增[1]. TCR-CD3复合体接受抗原或相应mAb刺激后，可导致多个与之相关的蛋白质酪氨酸激酶(PTK)的活化，并通过一些PTK的底物来介导细胞内的效应，调控核内基因转录，导致T细胞活化增殖，发挥效应功能. 大量实验证实，抗原(Ag)与TCR的结合仅仅是免疫应答的开始，只有当抗原递呈细胞(APC)表达B7分子，作用于T细胞表面的CD28受体作为第二刺激信号，T细胞才被激活，分裂增殖. 在生理状态下，未经刺激的APC表面不表达B7.1分子或表达水平极低不能引起有效的抗肿瘤免疫应答，CD28与B7.1的相互作用提供了T细胞活化所必需的主要共刺激信号[2]. 为更好地增强APC呈递能力和提供充足的共刺激信号，我们用CD28+B7.1(CD80)共激活PBLs后作用肝癌细胞(BEL-7402)，研究探讨TCR Vβ亚家族基因的选择性表达与PTK变化的关系，为肿瘤基因治疗提供新的线索和实验依据.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 单克隆抗体(mAb)CD28和CD80干粉购自Immunotech公司. Taq DNA聚合酶，AMV逆转录酶、RNAsin，dNTPs，DTT购自Promaga公司，DEPC，RPMI 1640购自Sigma公司，PTK-mAbPY20购自INC，硝酸纤维素膜购自Whatman，蛋白质标准购自Promaga，其他试剂为国产AR试剂. 基因扩增仪Gene E(英国)，CO2培养箱BNA-311(日本)，凝胶成象扫描仪Gel Doc-1000(Bio-Rad).
1.2 方法 健康成年人全血购自市中心血站. 100mL血用Ficoll密度梯度离心分离单核细胞，用RPMI 1640培养(含100mL/L灭活小牛血清)，每管10mL，分别加入维持量IL-2 (20kU/L)，CD28+80(各为0.4mg/L，在37℃，50mL/L CO2孵箱中培养1，2，3，4，5d共5个时间段组. 肝癌细胞系(BEL-7402)由中山医科大学肿瘤所赠. 用2.5g/L胰蛋白酶消化，加2mL 1640液吹散细胞，再加入含100mL/L小牛血清的1640液，共10mL. 在37℃，50mL/L CO2孵箱中培养，直至形成单层细胞，倾出培养液，加入抗体诱导的不同时间段组淋巴细胞培养1d，对照组不作用肝癌细胞，收获细胞，-70℃保存备用. RNA提取参见Chemczynski方法[3]. 引物设计参见文献[4，5]，序列见文献[12]. cDNA合成，RT-PCR检测TCR Vβ基因参见文献[6]. 探针标记与Southern杂交化学发光X-光片显影(Lumi-phos530)见文献[7]. Southern杂交后的X-胶片用凝胶成象扫描仪进行处理，TCR Vβ所形成的一条密度带被转化为数字，用NIH-图象分析软件(1.57版本)在计算机上处理[5]，用公式:(Vβ的密度)×100/(Vβ1-22)的累积密度，计算TCR Vβ的相关频率[8]. 细胞悬于裂解液中(50mmol/L Tris-HCl pH 7.5，含150mmol/L NaCl， 1g/L SDS， 100mg/L PMSF，10g/L Triton-X100, 1mg/L aprotinin, 2mmol/L EDTA， 50mmol/L巯基乙醇，1mmol/L Na2VO4，1μmol/L NaF， 2mmol/L DTT， 100mL/L甘油)，冰浴中超声破膜，离心10000g 1h，得上清液，经常规SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(胶浓度100mL/L)分离后，转移至NC膜上，NC膜用含30g/L BAS， 5g/L Tween20的封闭液孵化3h，洗膜，用PTK-mAb (Py20)按1∶1000孵化过夜，充分洗膜，按1∶2000加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，孵化2h，漂洗，加底物显色，图谱扫描定量.
, 百拇医药
2 结果
TCR Vβ7亚家族基因片段呈选择性优势扩增(图1，箭头所示). 光密度扫描结果显示，d1～d3 Vβ7基因表达水平有所升高，d4～d5表达水平显著升高，为24%(图2). Mr 70000的蛋白质在d1～d3含量变化不明显，d4含量明显升高(图3). PTK免疫印迹图谱经扫描定量分析，d4～d5 PTK含量最高，为58%，对照组为11%(图4).
图1A CD28+80共刺激PBLs后TCR Vβ基因PCR扩增产物电泳分析.
图1B CD28+80共刺激PBLs作用肝癌细胞后TCR Vβ基因PCR扩增产物电泳分析.
, 百拇医药
图2 CD28+80协同刺激PBLs及作用肝癌细胞后TCR Vβ7基因表达水平.
图3 PTK的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱.
图4 Western Blotting检测PTK表达.
3 讨论
T细胞活化过程的PTK，主要包括淋巴细胞特异的Src家族成员P59lck，P59fyn及T细胞特异的Syk家族成员ZAP-70[9]. T细胞被激活时除其表面抗原特异性受体感受抗原多肽的刺激之外，另一些受体也必须感受并传递一个附加刺激的受体即CD28，CD28传递的信息可防止T细胞特异性抗原诱发的耐受，同时可以使激活的T细胞内各种细胞因子mRNA(如IL-2mRNA)的稳定性增加. B7.1可使APC表面B7.1分子表达增多，CD28与B7.1的相互作用产生的共刺激信号加强抗原呈递能力，是T细胞应答产生CTL的诱导相中所必需的，是典型的共刺激途径. 本研究通过用CD28+B7.1(CD80)共刺激健康人PBLs后作用于肝癌细胞，结果显示共刺激1d～3d实验组TCR Vβ7表达水平有所增高，d4增高最明显，而其他Vβ亚家族基因的表达水平无明显改变，但有个体差异，与T细胞信号转导途径激活密切相关的PTK的含量在1d～3d时间段组无明显改变，而在4d～5d时间段组PTK的含量显著增加，说明TCR-CD3复合体与抗原或相应mAb结合时，Vβ7特异性识别肿瘤抗原而呈优势扩增，CD3向细胞内传递信号，介导PTK的活化，PTK参与的信号传递途径使细胞内的一种称为CD28RC的转录因子即DNA结合蛋白活化，调控核内基因的表达. 有报道，PTK的缺失可导致T细胞的发育与功能障碍，引起严重的免疫缺陷[10]. 由此可见，CD28+B7.1的共刺激作用，可诱导TCR Vβ基因的特异性优势扩增，介导与调控T细胞增殖、活化信号转导途径密切相关的PTK活性显著升高，有效地激活T细胞的杀伤效应，为进一步研究肿瘤免疫与基因治疗奠定基础.
, 百拇医药
作者简介：杨红，女，1965-06-12生，广东省湛江市人，汉族. 1987年四川大学本科毕业，生物化学讲师，主要从事TCR Vβ基因表达及信号转导方面的研究，发表论文5篇.
*国家自然科学基金课题，No.396400005和广东省科教兴医“五个一”工程重点课题，粤卫科[1996]20号资助.
通讯作者 杨红，510224，广东省广州市，广东药学院分子生物学研究室.
*Supported by the National Natural Science Foundation of China, No.396400005
Correspondence to:YANG Hong, Department of Molecular Biology, Guangdong Pharmacy College, Guangzhou 510224, Guangdong Province, China
, 百拇医药
Tel. +86.20.84429040 Ext.440
4 参考文献
[1] 傅体辉. T细胞识别肿瘤的分子机制. 国外医学免疫学分册，1995；1：23
[2] 黄树林，罗利琼，肖兰凤. McAb共刺激PBLs介导肝癌细胞凋亡. 中国免疫学杂志，1998；14：154
[3] Ilona kariv, Alemseged Truneh, Raymond W Sweet. Analysis of the site of interaction of CD28 with its counter-receptors CD80 and CD86 and correlation with founction. J Immunol, 1996;157:29
, 百拇医药
[4] Chomczynskis P, Nicoletta S. Single-step method of RNA isolation by acid guannidinium thiocganate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987;162:156
[5] Dunn DA, Anne SG, Swarnalatha S. T-cell receptor Vβ expression in normal human skin. Proc Natl Acad Sci USA, 1993;90:1267
[6] Hideyuki I, Noriyuki S, Akihiro M. Analysis of T-cell receptor Vβ region gene usage of cytotoxic T-lymphocytes and tumor-infiltrating lymphocytes derivid from human autologous gastric sigmer ring cell carcinomas. Cancer Res, 1993;53:3078
, 百拇医药
[7] 黄树林，陈耕夫，杨红. 不同条件和状态HSV感染人外周血淋巴细胞的Vβ受体表达特点. 中国免疫学杂志，1996；12(增刊)：137
[8] Mamheim B. Principle of nucleic acid labeling and detection with the genius system. Genius System User;s Guide, 1994:22,44,66
[9] 刘彬彬，叶胜龙. T细胞信号传导途径的改变与肿瘤免疫的关系. 中国肿瘤生物治疗杂志，1998；5：54-57
[10] Zier K, Gansbacher B, Salvadori S. Preventing abnormalities in signal trasduction of T cell in cancer: the promise of cytokine gene therapy. Immunol Today, 1996;17:39
收稿日期 1998-11-19, 百拇医药
单位：广东药学院分子生物学研究室 广东省广州市 510224
关键词：肝肿瘤；T细胞受体Vβ基因；基因表达；蛋白质酪氨酸激酶
世界华人消化杂志990404 摘 要
目的 探讨在T细胞活化信号传递中特异性识别和杀伤肝癌抗原的T细胞受体(TCR)Vβ基因亚家族的表达特征，及与蛋白质酪氨酸激酶(PTK)活性的关系.
方法 用单克隆抗体CD28+B7.1(CD80)共刺激正常人外周血淋巴细胞(PBLs)后作用于肝癌细胞(BEL-7402)，用RT-PCR，Southern印迹、Western印迹分析TCR Vβ基因表达特征及PTK含量.
结果 TCR Vβ7基因在体外选择性扩增，d4表达水平最高，为24%，对照组为6%，相应地PTK的含量也较高，为58%，对照组为11%.
, http://www.100md.com
结论 Vβ7基因特异性识别肝癌抗原，并介导PTK信号转导途径的激活.
中国图书资料分类号 R735.7
TCR Vβ gene expression and PTK activity of co-stimulated PBLs action on hepatoma cells*
YANG Hong and HUANG Shu-Lin
Department of Molecular Biology, Guangdong Pharmacy College, Guangzhou 510224, Guangdong Province, China
Subject headings liver neoplasms; T cell receptor Vβ gene; gene expression; protein tyrosine kinase
, 百拇医药
Abstract
AIM To study the T cell receptor (TCR) and Vβ genes subfamilies expression characters in recognizing and killing hepatoma antigen and its relationship to activity of protein tyrosine kinase (PTK).
METHODS After monoclonal antibody CD28+CD80(B7.1) co-stimulated healthy human peripheral blood lymphocytes (PBLs), and acted on hepatoma cell (BEL-7402), TCR Vβ7 gene expression characters and PTK activity were analyzed with PT-PCR, Southern-blot and Western-blot.
, 百拇医药
RESULTS TCR Vβ7 gene was amplified selectively, the expression level was the highest (24%), at day 4 in experimental group, but in the control group, 6%. The PTK was 58% in experimental group, but in the control group, 11%.
CONCLUSION Vβ7 gene is special in recognizing hepatoma antigen, inducing the activation of PTK signal translation.
0 引言
T细胞受体(TCR)是参与特异性免疫的重要分子，在T淋巴细胞活化过程中识别和结合配体. 研究发现正常个体在抗原刺激下，外周血淋巴细胞(PBLs) TCR Vβ基因随抗原类型不同或疾病的不同临床阶段呈选择性扩增[1]. TCR-CD3复合体接受抗原或相应mAb刺激后，可导致多个与之相关的蛋白质酪氨酸激酶(PTK)的活化，并通过一些PTK的底物来介导细胞内的效应，调控核内基因转录，导致T细胞活化增殖，发挥效应功能. 大量实验证实，抗原(Ag)与TCR的结合仅仅是免疫应答的开始，只有当抗原递呈细胞(APC)表达B7分子，作用于T细胞表面的CD28受体作为第二刺激信号，T细胞才被激活，分裂增殖. 在生理状态下，未经刺激的APC表面不表达B7.1分子或表达水平极低不能引起有效的抗肿瘤免疫应答，CD28与B7.1的相互作用提供了T细胞活化所必需的主要共刺激信号[2]. 为更好地增强APC呈递能力和提供充足的共刺激信号，我们用CD28+B7.1(CD80)共激活PBLs后作用肝癌细胞(BEL-7402)，研究探讨TCR Vβ亚家族基因的选择性表达与PTK变化的关系，为肿瘤基因治疗提供新的线索和实验依据.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 单克隆抗体(mAb)CD28和CD80干粉购自Immunotech公司. Taq DNA聚合酶，AMV逆转录酶、RNAsin，dNTPs，DTT购自Promaga公司，DEPC，RPMI 1640购自Sigma公司，PTK-mAbPY20购自INC，硝酸纤维素膜购自Whatman，蛋白质标准购自Promaga，其他试剂为国产AR试剂. 基因扩增仪Gene E(英国)，CO2培养箱BNA-311(日本)，凝胶成象扫描仪Gel Doc-1000(Bio-Rad).
1.2 方法 健康成年人全血购自市中心血站. 100mL血用Ficoll密度梯度离心分离单核细胞，用RPMI 1640培养(含100mL/L灭活小牛血清)，每管10mL，分别加入维持量IL-2 (20kU/L)，CD28+80(各为0.4mg/L，在37℃，50mL/L CO2孵箱中培养1，2，3，4，5d共5个时间段组. 肝癌细胞系(BEL-7402)由中山医科大学肿瘤所赠. 用2.5g/L胰蛋白酶消化，加2mL 1640液吹散细胞，再加入含100mL/L小牛血清的1640液，共10mL. 在37℃，50mL/L CO2孵箱中培养，直至形成单层细胞，倾出培养液，加入抗体诱导的不同时间段组淋巴细胞培养1d，对照组不作用肝癌细胞，收获细胞，-70℃保存备用. RNA提取参见Chemczynski方法[3]. 引物设计参见文献[4，5]，序列见文献[12]. cDNA合成，RT-PCR检测TCR Vβ基因参见文献[6]. 探针标记与Southern杂交化学发光X-光片显影(Lumi-phos530)见文献[7]. Southern杂交后的X-胶片用凝胶成象扫描仪进行处理，TCR Vβ所形成的一条密度带被转化为数字，用NIH-图象分析软件(1.57版本)在计算机上处理[5]，用公式:(Vβ的密度)×100/(Vβ1-22)的累积密度，计算TCR Vβ的相关频率[8]. 细胞悬于裂解液中(50mmol/L Tris-HCl pH 7.5，含150mmol/L NaCl， 1g/L SDS， 100mg/L PMSF，10g/L Triton-X100, 1mg/L aprotinin, 2mmol/L EDTA， 50mmol/L巯基乙醇，1mmol/L Na2VO4，1μmol/L NaF， 2mmol/L DTT， 100mL/L甘油)，冰浴中超声破膜，离心10000g 1h，得上清液，经常规SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(胶浓度100mL/L)分离后，转移至NC膜上，NC膜用含30g/L BAS， 5g/L Tween20的封闭液孵化3h，洗膜，用PTK-mAb (Py20)按1∶1000孵化过夜，充分洗膜，按1∶2000加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，孵化2h，漂洗，加底物显色，图谱扫描定量.
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2 结果
TCR Vβ7亚家族基因片段呈选择性优势扩增(图1，箭头所示). 光密度扫描结果显示，d1～d3 Vβ7基因表达水平有所升高，d4～d5表达水平显著升高，为24%(图2). Mr 70000的蛋白质在d1～d3含量变化不明显，d4含量明显升高(图3). PTK免疫印迹图谱经扫描定量分析，d4～d5 PTK含量最高，为58%，对照组为11%(图4).
图1A CD28+80共刺激PBLs后TCR Vβ基因PCR扩增产物电泳分析.
图1B CD28+80共刺激PBLs作用肝癌细胞后TCR Vβ基因PCR扩增产物电泳分析.
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图2 CD28+80协同刺激PBLs及作用肝癌细胞后TCR Vβ7基因表达水平.
图3 PTK的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱.
图4 Western Blotting检测PTK表达.
3 讨论
T细胞活化过程的PTK，主要包括淋巴细胞特异的Src家族成员P59lck，P59fyn及T细胞特异的Syk家族成员ZAP-70[9]. T细胞被激活时除其表面抗原特异性受体感受抗原多肽的刺激之外，另一些受体也必须感受并传递一个附加刺激的受体即CD28，CD28传递的信息可防止T细胞特异性抗原诱发的耐受，同时可以使激活的T细胞内各种细胞因子mRNA(如IL-2mRNA)的稳定性增加. B7.1可使APC表面B7.1分子表达增多，CD28与B7.1的相互作用产生的共刺激信号加强抗原呈递能力，是T细胞应答产生CTL的诱导相中所必需的，是典型的共刺激途径. 本研究通过用CD28+B7.1(CD80)共刺激健康人PBLs后作用于肝癌细胞，结果显示共刺激1d～3d实验组TCR Vβ7表达水平有所增高，d4增高最明显，而其他Vβ亚家族基因的表达水平无明显改变，但有个体差异，与T细胞信号转导途径激活密切相关的PTK的含量在1d～3d时间段组无明显改变，而在4d～5d时间段组PTK的含量显著增加，说明TCR-CD3复合体与抗原或相应mAb结合时，Vβ7特异性识别肿瘤抗原而呈优势扩增，CD3向细胞内传递信号，介导PTK的活化，PTK参与的信号传递途径使细胞内的一种称为CD28RC的转录因子即DNA结合蛋白活化，调控核内基因的表达. 有报道，PTK的缺失可导致T细胞的发育与功能障碍，引起严重的免疫缺陷[10]. 由此可见，CD28+B7.1的共刺激作用，可诱导TCR Vβ基因的特异性优势扩增，介导与调控T细胞增殖、活化信号转导途径密切相关的PTK活性显著升高，有效地激活T细胞的杀伤效应，为进一步研究肿瘤免疫与基因治疗奠定基础.
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作者简介：杨红，女，1965-06-12生，广东省湛江市人，汉族. 1987年四川大学本科毕业，生物化学讲师，主要从事TCR Vβ基因表达及信号转导方面的研究，发表论文5篇.
*国家自然科学基金课题，No.396400005和广东省科教兴医“五个一”工程重点课题，粤卫科[1996]20号资助.
通讯作者 杨红，510224，广东省广州市，广东药学院分子生物学研究室.
*Supported by the National Natural Science Foundation of China, No.396400005
Correspondence to:YANG Hong, Department of Molecular Biology, Guangdong Pharmacy College, Guangzhou 510224, Guangdong Province, China
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Tel. +86.20.84429040 Ext.440
4 参考文献
[1] 傅体辉. T细胞识别肿瘤的分子机制. 国外医学免疫学分册，1995；1：23
[2] 黄树林，罗利琼，肖兰凤. McAb共刺激PBLs介导肝癌细胞凋亡. 中国免疫学杂志，1998；14：154
[3] Ilona kariv, Alemseged Truneh, Raymond W Sweet. Analysis of the site of interaction of CD28 with its counter-receptors CD80 and CD86 and correlation with founction. J Immunol, 1996;157:29
, 百拇医药
[4] Chomczynskis P, Nicoletta S. Single-step method of RNA isolation by acid guannidinium thiocganate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987;162:156
[5] Dunn DA, Anne SG, Swarnalatha S. T-cell receptor Vβ expression in normal human skin. Proc Natl Acad Sci USA, 1993;90:1267
[6] Hideyuki I, Noriyuki S, Akihiro M. Analysis of T-cell receptor Vβ region gene usage of cytotoxic T-lymphocytes and tumor-infiltrating lymphocytes derivid from human autologous gastric sigmer ring cell carcinomas. Cancer Res, 1993;53:3078
, 百拇医药
[7] 黄树林，陈耕夫，杨红. 不同条件和状态HSV感染人外周血淋巴细胞的Vβ受体表达特点. 中国免疫学杂志，1996；12(增刊)：137
[8] Mamheim B. Principle of nucleic acid labeling and detection with the genius system. Genius System User;s Guide, 1994:22,44,66
[9] 刘彬彬，叶胜龙. T细胞信号传导途径的改变与肿瘤免疫的关系. 中国肿瘤生物治疗杂志，1998；5：54-57
[10] Zier K, Gansbacher B, Salvadori S. Preventing abnormalities in signal trasduction of T cell in cancer: the promise of cytokine gene therapy. Immunol Today, 1996;17:39
收稿日期 1998-11-19, 百拇医药