抗人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体重链可变区基因的克隆和序列分析
作者：杨西川 郑光勇 王大章 程 云 李伯安 李 静 房思炼
单位：王大章,郑光勇,房思炼 610041 华西医科大学口腔医学院颌面外科学教研室；(杨西川现在重庆第三军医大学大坪医院颌面整形外科工作),(程 云,李伯安,李 静)北京302医院免疫室
关键词：VEGF ；MAB；可变区基因；测序
华西口腔医学杂志990118 摘要 目的:克隆并分析人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体重链可变区基因。方法:从分泌抗人VEGF单抗的杂交瘤细胞株(Ell)中提取总RNA,利用逆转录-PCR方法,克隆抗人VEGF单克隆抗体(MAB)重链可变区基因(VH),将其重组入pEGMR-T Vector测序载体测序。结果:VH基因序列全长369个碱基对,编码123个氨基酸,通过国际联机检索及Kabat库扫描证实,该VH基因符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,同源性最高达87%。结论:VH基因全长369 bp,根据Kabat分类,归属小鼠重链可变区基因第Ⅱ(A)亚组,由VH-D-JH4重排产生。
, 百拇医药
Cloning and Sequence Characterization of Heavy Chain Variable Region Gene
from Hybridoma Cells Secreting MAB Against VEGF
Yang Xichuan,Zheng Guangyong, Wang Dazhang, et al
Department of Oral and Maxillofacial Surgery,College of Stomatology, West China University of Medical Sciences
Cheng Yun, Li Boan, Li Jing
Department of Immunology, 302 Hospital, Beijing
, 百拇医药
Abstract Objective:To clone the variable rigion of heavy chain (VH) gene from hybridoma secreting monoclonal antibody against human vasoendothelial growth factor (VEGF) for construction of recombinant antibody (scFv).Methods: One step method was used to extract total RNA and degeneration primer was used to amplify the cDNAs by retropolymerase chain reaction (RT-PCR), then the products were inserted to T-vector and its sequence was analysed.Results: The VH gene contained 369 base pairs encoding 123 amine acid resides. Analysis of the nucleotide sequence of the light chain variable region revealed that the VH sequence
, 百拇医药
was 87% identical to the sequence present in mouse Ig VH region.Conclusion: The VH gene was 369bp.According to Kabat classfication, the VH gene belonging to mouse kappa light chains subgroup Ⅱ(A),resulting
from VH-D-JH4 rearrangment.
Key words: vasoendothelial growth factor monoclonal antibody variable rigion of heavy chain sequence
血管内皮生长因子是1989年Ferrara[1]从牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中首先纯化出来,命名为(vasoendothelial growth factor, VEGF),经测序及基因分析,发现与血管通透因子(vascular permeability factor, VPF)是同一基因家族的同系物。目前已知VEGF能特异作用于内皮细胞,也是作用最强的血管通透剂,能引起血管渗透性增加,促使纤维蛋白沉积于细胞外基质,促进新生血管形成。近年来,已确认VEGF是肿瘤组织血管生成的主要调节因子,常见的恶性实体肿瘤均有VEGF的过量表达。VEGF促进肿瘤生长已得到许多实验[2]的证实。抗VEGF单抗能抑制肿瘤生长及转移瘤的发生[3,4]。但由于鼠源单抗在人体内易诱发人抗鼠抗体(HAMA)免疫反应而应用受限。基因工程技术对抗体的改造(即重组抗体及抗体人源化)可降低其免疫源性,工程抗体也因此成为国内外研究热点。单链抗体(scFv)以其分子小,穿透力强,免疫源性低,易于大量生产等优点,得到了较为广泛的应用。本课题在建立抗-VEGF MAB杂交瘤细胞株,并实验证实其抗人VEGF单克隆抗体(MAB)有生物学活性的基础上,拟克隆抗体可变区基因,构建scFv基因并表达。本文报道重链可变区基因(VH)克隆测序结果。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 工具酶及试剂
鸟类成髓细胞血症病毒(AMV)逆转录酶、PCR纯化试剂盒、pEGMR-T Vector(测序载体)及序列分析试剂盒均为Promega公司产品,其余试剂为分析片(AR)和分子生物学纯。
1.2 细胞总RNA提取
抗人VEGF杂交瘤细胞株的建立见参考文献[5],按参考文献[6]稍加改良。收获约6×107杂交瘤细胞,离心后用裂解液裂解细胞团块,离心后上清用酚/氯仿抽提,无水乙醇沉淀。
1.3 逆转录-PCR
根据Kabat库[7],5'-端引物设计为互补于FR1区,5'端为简并引物,序列为:5'-GGGAATTCATGGAGGTG(CA)AGCT(GT)C(AT)GGAGTC-3'。3'-端互补于重链JH区,因小鼠JH区有4类,故合成4条引物,序列分别为:JH1:5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC-
, 百拇医药
3',JH2:5'-TGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCC,JH3:5'-TGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-
3',JH4:5'-TGAGGAGAC-GGTGACTGAGGTTCC-3'。以10μl RNA为模板,分别以JH1-JH4为引物,在AMV逆转录酶催化下合成cDNA,以cDNA为模板,在30μl:反应体系中,加入5'端可变区引物,在GeneAmp PCR System(Perlin Elmer公司产品)上进行扩增,参数设为:94℃变性60分,55℃退火60分,72℃延伸60分,30次循环。PCR产物用1.5%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收。
1.4 重链可变区基因的克隆及序列测定
将琼脂糖凝胶电泳回收的PCR产物纯化(Qiagen,gel extraction kit)后,克隆在末端T突出的pEGMR-T Vector中,转化感受态细菌CM1601,挑选阳性克隆,抽提质粒DNA,T7及SP6通用引物双向测序。
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2 结 果
2.1 RT-PCR扩增产物的鉴定
用RT-PCR扩增抗VEGF单抗重链可变区基因,仅JH4获得特异扩增,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1),可观察到清晰的条带,大小在370 bp左右,与引物设计结果吻合。
图1 VH凝胶电泳结果
M：标准分子量参照
VH：扩增片段
2.2 重链可变区的克隆及序列分析
PCR产物经纯化后,克隆进T-Vector载体,用通用引物在310 A全自动DNA序列分析仪(ABI)公司上测序结果表明,该重链可变区基因的长度为369 bp,编码123个氨基酸(图2)。
, 百拇医药
图2 抗VEGF单克隆抗体重链可变区核苷酸及其氨基酸推导序列(划线处为CDRs)
3 讨 论
本研究已建立的抗人VEGF单克隆抗体用于临床检测VEGF的表达已取得良好效果[8],并初步证实有体内抑瘤活性,显示了作为生物导向药物的潜力。为了减少鼠源单抗对人的免疫源性,本研究拟对鼠源性单抗进行基因工程改造,构建单链抗体(scFv)。之前作者报道了轻链可变区的克隆和测序[9]。一般认为[10],抗体VH区在参与抗原结合过程中,起着较轻链更重要的作用。重链可变区(VH)的成功克隆和测序,为构建scFv创造了条件。
最初本研究用于克隆VH的引物为针对引导序列和恒定区的一对引物,经摸索聚合酶链反应(PCR)各种条件,均未获得成功,遂改为针对骨架区FR1(5'-端)及J区(3'-端)的引物(因小鼠有4个J基因段,故设计了4条引物(JH1,JH2,JH3,JH4),仅JH4克隆出特异基因片段。由于可变区上游没有保守序列,5'端引物通常均设计为简并引物,但3'端引物不允许为简并引物。尽管聚合酶可以耐受引物与模板非绝对互补,但3'端引物与模板的完全互补是克隆成功的关键,因为DNA合成的起始点在3'端。前述失败的原因很可能系针对恒定区的引物与模板不完全互补所致,与PCR的反应条件关系不大。本研究克隆的重链可变区基因序列与Kabat库联机检索证明,该VH基因符合小鼠免疫球蛋白重链可变区基因特征,同源性高达87%,归属小鼠可变区基因第Ⅱ(A)亚组,由VH-D-JH4重排产生。
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抗人VEGF单抗轻、重链可变区经一条人工合成多肽连接,使之成为既保持抗原抗体结合区的完整结构,又不发生解离的小分子抗体(即scFv),可有效地减弱原亲本抗体的免疫源性。最近,作者已构建并表达了抗人VEGF单链抗体,初步证实该单链抗体保持有原亲本抗体的结合活性及特异性,为今后有效的临床应用奠定了良好基础。
本课题为国家自然科学基金资助项目(编号 395707687)
参考文献
1 Ferrara N, Henzel WJ. Pituitary follicular cells secret a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun, 1989, 161(2):851～858
, 百拇医药
2 Claffey KP, Robinson GS. Regulation of VEGF/VPF expression in tumor cells: consequences for tumor growth and metastasis. Cancer Metastasis Rev, 1996, 15(2):165～176
3 Kim KJ, Li B, Winer J. Inhibition of vascular endothelial growth factor induced angiogenesis suppress tumor growth in vivo. Nature, 1993, 362(6423):841～844
4 Asano M, Suzuki H, Kondo S. Isolation and characterization of neutralizing monoclonal antibodies to human vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor 121 (VEGF/VPF121). Hybridoma, 1995, 14(5):475～480
, 百拇医药
5 杨西川,王大章,李 虹,等.抗人血管内皮生长因子合成肽杂交瘤细胞株的建立.细胞与分子免疫学杂志,1998,14(3):220～221
6 Kabat EA, Clark M, Waldmann H. Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th ed, Washington DC: US Department of Health and Human Service, 1991: 1～222
7 Boom R, Sol CJA, Salimans MMM, et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol, 1990, 28(3):495
8 王大章,杨西川,何志秀,等.血管内皮生长因子在颊癌中的表达与分布.中华医学杂志,1998,78(11):845
9 杨西川,王大章,郑光勇,等.抗人血管内皮生长因子单克隆抗体轻链可变区基因的克隆和序列分析.华西口腔医学杂志,1998,16(3):195～197
10 Padlan EA. Anatomy of the antibody molecule. Mole Immumology, 1994, 31(3):169～217
(1998-09-04收稿), http://www.100md.com
单位：王大章,郑光勇,房思炼 610041 华西医科大学口腔医学院颌面外科学教研室；(杨西川现在重庆第三军医大学大坪医院颌面整形外科工作),(程 云,李伯安,李 静)北京302医院免疫室
关键词：VEGF ；MAB；可变区基因；测序
华西口腔医学杂志990118 摘要 目的:克隆并分析人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体重链可变区基因。方法:从分泌抗人VEGF单抗的杂交瘤细胞株(Ell)中提取总RNA,利用逆转录-PCR方法,克隆抗人VEGF单克隆抗体(MAB)重链可变区基因(VH),将其重组入pEGMR-T Vector测序载体测序。结果:VH基因序列全长369个碱基对,编码123个氨基酸,通过国际联机检索及Kabat库扫描证实,该VH基因符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,同源性最高达87%。结论:VH基因全长369 bp,根据Kabat分类,归属小鼠重链可变区基因第Ⅱ(A)亚组,由VH-D-JH4重排产生。
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Cloning and Sequence Characterization of Heavy Chain Variable Region Gene
from Hybridoma Cells Secreting MAB Against VEGF
Yang Xichuan,Zheng Guangyong, Wang Dazhang, et al
Department of Oral and Maxillofacial Surgery,College of Stomatology, West China University of Medical Sciences
Cheng Yun, Li Boan, Li Jing
Department of Immunology, 302 Hospital, Beijing
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Abstract Objective:To clone the variable rigion of heavy chain (VH) gene from hybridoma secreting monoclonal antibody against human vasoendothelial growth factor (VEGF) for construction of recombinant antibody (scFv).Methods: One step method was used to extract total RNA and degeneration primer was used to amplify the cDNAs by retropolymerase chain reaction (RT-PCR), then the products were inserted to T-vector and its sequence was analysed.Results: The VH gene contained 369 base pairs encoding 123 amine acid resides. Analysis of the nucleotide sequence of the light chain variable region revealed that the VH sequence
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was 87% identical to the sequence present in mouse Ig VH region.Conclusion: The VH gene was 369bp.According to Kabat classfication, the VH gene belonging to mouse kappa light chains subgroup Ⅱ(A),resulting
from VH-D-JH4 rearrangment.
Key words: vasoendothelial growth factor monoclonal antibody variable rigion of heavy chain sequence
血管内皮生长因子是1989年Ferrara[1]从牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中首先纯化出来,命名为(vasoendothelial growth factor, VEGF),经测序及基因分析,发现与血管通透因子(vascular permeability factor, VPF)是同一基因家族的同系物。目前已知VEGF能特异作用于内皮细胞,也是作用最强的血管通透剂,能引起血管渗透性增加,促使纤维蛋白沉积于细胞外基质,促进新生血管形成。近年来,已确认VEGF是肿瘤组织血管生成的主要调节因子,常见的恶性实体肿瘤均有VEGF的过量表达。VEGF促进肿瘤生长已得到许多实验[2]的证实。抗VEGF单抗能抑制肿瘤生长及转移瘤的发生[3,4]。但由于鼠源单抗在人体内易诱发人抗鼠抗体(HAMA)免疫反应而应用受限。基因工程技术对抗体的改造(即重组抗体及抗体人源化)可降低其免疫源性,工程抗体也因此成为国内外研究热点。单链抗体(scFv)以其分子小,穿透力强,免疫源性低,易于大量生产等优点,得到了较为广泛的应用。本课题在建立抗-VEGF MAB杂交瘤细胞株,并实验证实其抗人VEGF单克隆抗体(MAB)有生物学活性的基础上,拟克隆抗体可变区基因,构建scFv基因并表达。本文报道重链可变区基因(VH)克隆测序结果。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 工具酶及试剂
鸟类成髓细胞血症病毒(AMV)逆转录酶、PCR纯化试剂盒、pEGMR-T Vector(测序载体)及序列分析试剂盒均为Promega公司产品,其余试剂为分析片(AR)和分子生物学纯。
1.2 细胞总RNA提取
抗人VEGF杂交瘤细胞株的建立见参考文献[5],按参考文献[6]稍加改良。收获约6×107杂交瘤细胞,离心后用裂解液裂解细胞团块,离心后上清用酚/氯仿抽提,无水乙醇沉淀。
1.3 逆转录-PCR
根据Kabat库[7],5'-端引物设计为互补于FR1区,5'端为简并引物,序列为:5'-GGGAATTCATGGAGGTG(CA)AGCT(GT)C(AT)GGAGTC-3'。3'-端互补于重链JH区,因小鼠JH区有4类,故合成4条引物,序列分别为:JH1:5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC-
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3',JH2:5'-TGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCC,JH3:5'-TGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-
3',JH4:5'-TGAGGAGAC-GGTGACTGAGGTTCC-3'。以10μl RNA为模板,分别以JH1-JH4为引物,在AMV逆转录酶催化下合成cDNA,以cDNA为模板,在30μl:反应体系中,加入5'端可变区引物,在GeneAmp PCR System(Perlin Elmer公司产品)上进行扩增,参数设为:94℃变性60分,55℃退火60分,72℃延伸60分,30次循环。PCR产物用1.5%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收。
1.4 重链可变区基因的克隆及序列测定
将琼脂糖凝胶电泳回收的PCR产物纯化(Qiagen,gel extraction kit)后,克隆在末端T突出的pEGMR-T Vector中,转化感受态细菌CM1601,挑选阳性克隆,抽提质粒DNA,T7及SP6通用引物双向测序。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 RT-PCR扩增产物的鉴定
用RT-PCR扩增抗VEGF单抗重链可变区基因,仅JH4获得特异扩增,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1),可观察到清晰的条带,大小在370 bp左右,与引物设计结果吻合。
图1 VH凝胶电泳结果
M：标准分子量参照
VH：扩增片段
2.2 重链可变区的克隆及序列分析
PCR产物经纯化后,克隆进T-Vector载体,用通用引物在310 A全自动DNA序列分析仪(ABI)公司上测序结果表明,该重链可变区基因的长度为369 bp,编码123个氨基酸(图2)。
, 百拇医药
图2 抗VEGF单克隆抗体重链可变区核苷酸及其氨基酸推导序列(划线处为CDRs)
3 讨 论
本研究已建立的抗人VEGF单克隆抗体用于临床检测VEGF的表达已取得良好效果[8],并初步证实有体内抑瘤活性,显示了作为生物导向药物的潜力。为了减少鼠源单抗对人的免疫源性,本研究拟对鼠源性单抗进行基因工程改造,构建单链抗体(scFv)。之前作者报道了轻链可变区的克隆和测序[9]。一般认为[10],抗体VH区在参与抗原结合过程中,起着较轻链更重要的作用。重链可变区(VH)的成功克隆和测序,为构建scFv创造了条件。
最初本研究用于克隆VH的引物为针对引导序列和恒定区的一对引物,经摸索聚合酶链反应(PCR)各种条件,均未获得成功,遂改为针对骨架区FR1(5'-端)及J区(3'-端)的引物(因小鼠有4个J基因段,故设计了4条引物(JH1,JH2,JH3,JH4),仅JH4克隆出特异基因片段。由于可变区上游没有保守序列,5'端引物通常均设计为简并引物,但3'端引物不允许为简并引物。尽管聚合酶可以耐受引物与模板非绝对互补,但3'端引物与模板的完全互补是克隆成功的关键,因为DNA合成的起始点在3'端。前述失败的原因很可能系针对恒定区的引物与模板不完全互补所致,与PCR的反应条件关系不大。本研究克隆的重链可变区基因序列与Kabat库联机检索证明,该VH基因符合小鼠免疫球蛋白重链可变区基因特征,同源性高达87%,归属小鼠可变区基因第Ⅱ(A)亚组,由VH-D-JH4重排产生。
, 百拇医药
抗人VEGF单抗轻、重链可变区经一条人工合成多肽连接,使之成为既保持抗原抗体结合区的完整结构,又不发生解离的小分子抗体(即scFv),可有效地减弱原亲本抗体的免疫源性。最近,作者已构建并表达了抗人VEGF单链抗体,初步证实该单链抗体保持有原亲本抗体的结合活性及特异性,为今后有效的临床应用奠定了良好基础。
本课题为国家自然科学基金资助项目(编号 395707687)
参考文献
1 Ferrara N, Henzel WJ. Pituitary follicular cells secret a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun, 1989, 161(2):851～858
, 百拇医药
2 Claffey KP, Robinson GS. Regulation of VEGF/VPF expression in tumor cells: consequences for tumor growth and metastasis. Cancer Metastasis Rev, 1996, 15(2):165～176
3 Kim KJ, Li B, Winer J. Inhibition of vascular endothelial growth factor induced angiogenesis suppress tumor growth in vivo. Nature, 1993, 362(6423):841～844
4 Asano M, Suzuki H, Kondo S. Isolation and characterization of neutralizing monoclonal antibodies to human vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor 121 (VEGF/VPF121). Hybridoma, 1995, 14(5):475～480
, 百拇医药
5 杨西川,王大章,李 虹,等.抗人血管内皮生长因子合成肽杂交瘤细胞株的建立.细胞与分子免疫学杂志,1998,14(3):220～221
6 Kabat EA, Clark M, Waldmann H. Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th ed, Washington DC: US Department of Health and Human Service, 1991: 1～222
7 Boom R, Sol CJA, Salimans MMM, et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol, 1990, 28(3):495
8 王大章,杨西川,何志秀,等.血管内皮生长因子在颊癌中的表达与分布.中华医学杂志,1998,78(11):845
9 杨西川,王大章,郑光勇,等.抗人血管内皮生长因子单克隆抗体轻链可变区基因的克隆和序列分析.华西口腔医学杂志,1998,16(3):195～197
10 Padlan EA. Anatomy of the antibody molecule. Mole Immumology, 1994, 31(3):169～217
(1998-09-04收稿), http://www.100md.com