补肾复方对11例肾虚证老年人单核细胞增殖反应及其细胞膜流动性的影响
作者：仝战旗 赵美龄 孟勇 刘素宾
单位：仝战旗 赵美龄：解放军总医院中医科，北京 100853；孟勇 刘素宾：北京医科大学第一附属医院，北京 100034
关键词：增殖反应；膜流动性；外周血单核细胞；老年人；肾虚证；补肾复方
补肾复方对11例肾虚证老年人单核细胞 增殖反应及其细胞膜流动性的影响 摘要 目的：探讨中药补肾复方对老年人外周血单核细胞(PBMC)增殖反应及膜流动性的影响。方法：选择老年人肾虚证患者给予补肾复方、治疗前后运用MTT比色法检测PBMC对植物血凝素(PHA)刺激的增殖反应，同时运用荧光偏振技术以DPH(1，6-二苯基，1，3，5-己三烯)为荧光探剂检测PBMC膜流动性。结果：补肾复方可以改善老年人肾虚证症状，并能提高其降低的增殖反应和膜流动性(P<0.05)。结论：补肾复方增强老年人肾虚证患者细胞免疫功能，可能与提高PBMC膜流动性有关。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 241.1
The influence of Chinese Tonifying Kidneyherbs upon the
proliferative response and themembrane fluidity of
peripheral bloodmononuclear cells in 11 aged patients
Tong Zhanqi, Zhaomeiling,meng Yong, Liu Subin
(Department of Traditional Chinesemedicine,generalhospital of PLA, Beijing 100853)
, 百拇医药
Abstract Objective：The present paper was aimed to investigate the influence of Chinese traditional Tonifying Kidneyherbs (TKH) upon the proliferative response and themembrane fluidity of PBMC in the aged.Methods:Eleven aged patients with functional kidney-deficiency were selected and treated with TKH.The proliferative response of PBMC to PHA bymeans ofmTT before and after treatment, and themembrane fluidity of PBMC was tested by using DPH as fluorescent probe.Results：The proliferative response andmembrane fluidity of PBMC were signicanfly improved after TKH treatment (P<0.05) as compared with the controls.Conclusion:Chinese TKHmay improve the cellular immunity of the aged with functional kidney-deficiency by the possible way of enhancing the proliferative response andmembrane fluidity of PBMC.
, 百拇医药
Key words proliferative response;membrane fluidity; PBMC； the aged people; Kidney-Deficiency; Chinese Tonifying Kidneyherbs
老年人免疫功能降低主要表现在细胞免疫低下。对细胞来讲，合适的膜流动性是其执行各种功能的必要条件。因而，老年人外周血单核细胞(PBMC)功能的降低可能与膜流动性有关。我们运用MTT比色法检测了PBMC对植物血凝素(PHA)刺激的增殖反应，又用荧光偏振技术以DPH(1，6-二苯基，1，3，5-己三烯)为荧光探剂检测了PBMC膜流动性变化，并观察了补肾复方的影响。
1 对象和方法
1.1 对象 基本健康的老年人共11例，男8例，女3例，年龄60～78岁。均来源于我院中医九诊室，符合 1982 年中华医学会老年医学学会规定的健康“五条标准”〔1〕。本组患者治疗前均有不同程度的肾虚证〔2〕。治疗前 1 个月内无服用免疫调节药物或中药的历史。另选青年对照组 11 例，男 7 例，女 4 例，年龄 21～36 岁，为健康献血员。
, 百拇医药
1.2 治疗方法 补肾复方由菟丝子、女贞子、续断，枸杞子等药组成，每日1剂，水煎取汁约 400ml，分两次口服。共服 1 个月为 1 疗程。
1.3 主要试剂 MTT为Fluka公司(瑞士)产品，4°C 避光保存，临用前配成 5mg/ml溶液，并过滤除菌。DPH为Sigma公司产品，用四氢呋喃溶成 2×10-3mol/L的母液，4°C保存备用，用时稀释成 2×10-6mol/L的工作液。RPMI 1640 培养液：RPMI 1640 20.8g、Hepes 11.9g、NaHCO34.2g、丙酮酸钠 0.22g，溶于 2 000ml三蒸水，为不完全RPMI 1640 (ic-1640)，过滤除菌分装冻存备用。若加入 10% 小牛血清则为完全RPMI 1640(c-1640)。
1.4 实验方法
1.4.1 PBMC的制备 无菌取静脉血 10ml、肝素抗凝。在超净台内加约等体积的ic-1640 稀释。离心 2000r/min,20min。PBMC位于分层液和血浆的界面上，小心吸出细胞层移入另一试管中，用ic-1640 洗两遍，最后用c-1640 悬起计数，配成所需浓度。
, 百拇医药
1.4.2 细胞增殖反应测定〔3〕 将新鲜分离的PBMC 2×106/ml，加入平底 96 孔细胞培养板，100μl/孔，每个样品设 3 个平行孔，再加入PHA(终浓度 100ug/ml)，用c-1640 将每孔总体积补足 200μl，并设对照孔(只加 c-1640)。将培养板置于37°C，5% CO2培养箱中培养 44h，每孔加入MTT溶液 20μl，继续培养 4h。将培养板离心 2000r/min,5min，弃上清，每孔加入酸化异丙醇 200μl，在酶联免疫检测仪上测 570nm的OD值。
1.4.3 膜流动性测定〔4〕 取PBMC 5×106 1.5ml与等量DPH工作液混匀，37°C水浴 30min，然后用PBS洗两遍，在石英比色杯中用荧光分光光度仪(850 型，日本HITACHI公司)检测荧光偏振度P值。再根据公式计算出细胞膜流动度(LFU)：LFU=(Pmax÷P-1)÷P。Pmax为荧光偏振的理论极限值 0.5。
, 百拇医药
1.5 统计处理 经我院医学统计室用SPSS软件统计分析。
2 结果
11 例老年人在服用补肾复方 1 疗程后，各种肾虚证的症状得到不同程度改善(表 1)。其中腰酸、耳鸣、尿后余沥、性欲减退症状改善较为显著。
表 1 补肾复方对老年人肾虚症状的影响
n
腰酸
膝软
足根痛
耳鸣
耳聋
齿摇
, http://www.100md.com
尿后余沥
性欲减退
服药前
10
8
4
6
8
8
9
11
服药后
4
4
, http://www.100md.com
2
2
4
4
3
5
表 2 示老年人较青年人PBMC增殖反应降低，下降达 34.4%，而服药后得到明显的改善(P<0.05)。老年人静息状态的PBMC膜流动性较青年人显著降低，下降达 59%，服药后同样得到改善(P<0.05)。 表 2 老年人服药前后PBMC的增殖反应和
膜流动性的改变以及与青年的对比(
±s)
, http://www.100md.com
组 别
OD值
PDPH
LFU
青年 (a)
0.459±0.088
0.194±0.030
8.943±3.979
服药前(b)
0.301±0.077
0.262±0.027
3.639±1.215
, http://www.100md.com
老年
服药后(c)
0.359±0.089
0.220±0.034
6.304±2.413
注：a与b相比P<0.05，b与c相比P<0.05
3 讨论
随着年龄的增长，机体的免疫功能会出现不同程度的减退。本实验检测到老年人PBMC增殖反应和膜流动性减低，与文献报道一致〔6〕。膜流动性减低是否是淋巴细胞功能降低的初始原因尚不清楚，但膜流动性的改变必然会影响细胞功能。应用补肾复方后，老年人PBMC增殖反应及膜流动性得到改善，起到了提高免疫功能、增强抗病能力的作用。该方除改善膜流动性外是否还有其它免疫调节机制有待进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
[1]吕维善，宗 启，陈家驹等.我国四省四市健康老年人五项生理参考值的调查.中华老年医学杂志，1985,4(4)∶214
[2]沈自尹，王文健整理.中医虚证辨证参考标准(1986年5月修订).中国中西医结合杂志，1986,6(11)∶598
[3]黄瑾，安继红，薛 晓等.MTT比色检测细胞增殖方法的改良及实验影响因素观察.白求恩医科大学学报，1992,18(14)∶395
[4]陈泽涛，顾振东.中药对淋巴细胞型白血病小鼠细胞膜流动性的影响.中国中西医结合杂志，1991,11(1)∶39
[5]YegutkingG, Sambursky SS, Zhitkovitch AV et al.Evaluation of age-related changes of physicochemical properties and functional activity of rat adipose plasmamembranes and their possible relationship.Mech Ageing Dev, 1991,(59)∶1
(1998—09—12收稿，1998—10—09修回), http://www.100md.com
单位：仝战旗 赵美龄：解放军总医院中医科，北京 100853；孟勇 刘素宾：北京医科大学第一附属医院，北京 100034
关键词：增殖反应；膜流动性；外周血单核细胞；老年人；肾虚证；补肾复方
补肾复方对11例肾虚证老年人单核细胞 增殖反应及其细胞膜流动性的影响 摘要 目的：探讨中药补肾复方对老年人外周血单核细胞(PBMC)增殖反应及膜流动性的影响。方法：选择老年人肾虚证患者给予补肾复方、治疗前后运用MTT比色法检测PBMC对植物血凝素(PHA)刺激的增殖反应，同时运用荧光偏振技术以DPH(1，6-二苯基，1，3，5-己三烯)为荧光探剂检测PBMC膜流动性。结果：补肾复方可以改善老年人肾虚证症状，并能提高其降低的增殖反应和膜流动性(P<0.05)。结论：补肾复方增强老年人肾虚证患者细胞免疫功能，可能与提高PBMC膜流动性有关。
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中国图书资料分类法分类号 R 241.1
The influence of Chinese Tonifying Kidneyherbs upon the
proliferative response and themembrane fluidity of
peripheral bloodmononuclear cells in 11 aged patients
Tong Zhanqi, Zhaomeiling,meng Yong, Liu Subin
(Department of Traditional Chinesemedicine,generalhospital of PLA, Beijing 100853)
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Abstract Objective：The present paper was aimed to investigate the influence of Chinese traditional Tonifying Kidneyherbs (TKH) upon the proliferative response and themembrane fluidity of PBMC in the aged.Methods:Eleven aged patients with functional kidney-deficiency were selected and treated with TKH.The proliferative response of PBMC to PHA bymeans ofmTT before and after treatment, and themembrane fluidity of PBMC was tested by using DPH as fluorescent probe.Results：The proliferative response andmembrane fluidity of PBMC were signicanfly improved after TKH treatment (P<0.05) as compared with the controls.Conclusion:Chinese TKHmay improve the cellular immunity of the aged with functional kidney-deficiency by the possible way of enhancing the proliferative response andmembrane fluidity of PBMC.
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Key words proliferative response;membrane fluidity; PBMC； the aged people; Kidney-Deficiency; Chinese Tonifying Kidneyherbs
老年人免疫功能降低主要表现在细胞免疫低下。对细胞来讲，合适的膜流动性是其执行各种功能的必要条件。因而，老年人外周血单核细胞(PBMC)功能的降低可能与膜流动性有关。我们运用MTT比色法检测了PBMC对植物血凝素(PHA)刺激的增殖反应，又用荧光偏振技术以DPH(1，6-二苯基，1，3，5-己三烯)为荧光探剂检测了PBMC膜流动性变化，并观察了补肾复方的影响。
1 对象和方法
1.1 对象 基本健康的老年人共11例，男8例，女3例，年龄60～78岁。均来源于我院中医九诊室，符合 1982 年中华医学会老年医学学会规定的健康“五条标准”〔1〕。本组患者治疗前均有不同程度的肾虚证〔2〕。治疗前 1 个月内无服用免疫调节药物或中药的历史。另选青年对照组 11 例，男 7 例，女 4 例，年龄 21～36 岁，为健康献血员。
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1.2 治疗方法 补肾复方由菟丝子、女贞子、续断，枸杞子等药组成，每日1剂，水煎取汁约 400ml，分两次口服。共服 1 个月为 1 疗程。
1.3 主要试剂 MTT为Fluka公司(瑞士)产品，4°C 避光保存，临用前配成 5mg/ml溶液，并过滤除菌。DPH为Sigma公司产品，用四氢呋喃溶成 2×10-3mol/L的母液，4°C保存备用，用时稀释成 2×10-6mol/L的工作液。RPMI 1640 培养液：RPMI 1640 20.8g、Hepes 11.9g、NaHCO34.2g、丙酮酸钠 0.22g，溶于 2 000ml三蒸水，为不完全RPMI 1640 (ic-1640)，过滤除菌分装冻存备用。若加入 10% 小牛血清则为完全RPMI 1640(c-1640)。
1.4 实验方法
1.4.1 PBMC的制备 无菌取静脉血 10ml、肝素抗凝。在超净台内加约等体积的ic-1640 稀释。离心 2000r/min,20min。PBMC位于分层液和血浆的界面上，小心吸出细胞层移入另一试管中，用ic-1640 洗两遍，最后用c-1640 悬起计数，配成所需浓度。
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1.4.2 细胞增殖反应测定〔3〕 将新鲜分离的PBMC 2×106/ml，加入平底 96 孔细胞培养板，100μl/孔，每个样品设 3 个平行孔，再加入PHA(终浓度 100ug/ml)，用c-1640 将每孔总体积补足 200μl，并设对照孔(只加 c-1640)。将培养板置于37°C，5% CO2培养箱中培养 44h，每孔加入MTT溶液 20μl，继续培养 4h。将培养板离心 2000r/min,5min，弃上清，每孔加入酸化异丙醇 200μl，在酶联免疫检测仪上测 570nm的OD值。
1.4.3 膜流动性测定〔4〕 取PBMC 5×106 1.5ml与等量DPH工作液混匀，37°C水浴 30min，然后用PBS洗两遍，在石英比色杯中用荧光分光光度仪(850 型，日本HITACHI公司)检测荧光偏振度P值。再根据公式计算出细胞膜流动度(LFU)：LFU=(Pmax÷P-1)÷P。Pmax为荧光偏振的理论极限值 0.5。
, 百拇医药
1.5 统计处理 经我院医学统计室用SPSS软件统计分析。
2 结果
11 例老年人在服用补肾复方 1 疗程后，各种肾虚证的症状得到不同程度改善(表 1)。其中腰酸、耳鸣、尿后余沥、性欲减退症状改善较为显著。
表 1 补肾复方对老年人肾虚症状的影响
n
腰酸
膝软
足根痛
耳鸣
耳聋
齿摇
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尿后余沥
性欲减退
服药前
10
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服药后
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表 2 示老年人较青年人PBMC增殖反应降低，下降达 34.4%，而服药后得到明显的改善(P<0.05)。老年人静息状态的PBMC膜流动性较青年人显著降低，下降达 59%，服药后同样得到改善(P<0.05)。 表 2 老年人服药前后PBMC的增殖反应和
膜流动性的改变以及与青年的对比(
±s), http://www.100md.com
组 别
OD值
PDPH
LFU
青年 (a)
0.459±0.088
0.194±0.030
8.943±3.979
服药前(b)
0.301±0.077
0.262±0.027
3.639±1.215
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老年
服药后(c)
0.359±0.089
0.220±0.034
6.304±2.413
注：a与b相比P<0.05，b与c相比P<0.05
3 讨论
随着年龄的增长，机体的免疫功能会出现不同程度的减退。本实验检测到老年人PBMC增殖反应和膜流动性减低，与文献报道一致〔6〕。膜流动性减低是否是淋巴细胞功能降低的初始原因尚不清楚，但膜流动性的改变必然会影响细胞功能。应用补肾复方后，老年人PBMC增殖反应及膜流动性得到改善，起到了提高免疫功能、增强抗病能力的作用。该方除改善膜流动性外是否还有其它免疫调节机制有待进一步研究。
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参考文献
[1]吕维善，宗 启，陈家驹等.我国四省四市健康老年人五项生理参考值的调查.中华老年医学杂志，1985,4(4)∶214
[2]沈自尹，王文健整理.中医虚证辨证参考标准(1986年5月修订).中国中西医结合杂志，1986,6(11)∶598
[3]黄瑾，安继红，薛 晓等.MTT比色检测细胞增殖方法的改良及实验影响因素观察.白求恩医科大学学报，1992,18(14)∶395
[4]陈泽涛，顾振东.中药对淋巴细胞型白血病小鼠细胞膜流动性的影响.中国中西医结合杂志，1991,11(1)∶39
[5]YegutkingG, Sambursky SS, Zhitkovitch AV et al.Evaluation of age-related changes of physicochemical properties and functional activity of rat adipose plasmamembranes and their possible relationship.Mech Ageing Dev, 1991,(59)∶1
(1998—09—12收稿，1998—10—09修回), http://www.100md.com