TNF-α及IL-1β与多形核白细胞在牙周炎症组织中浸润的关系
作者：刘荣坤 曹采方 孟焕新 高岩
单位：刘荣坤(北京医科大学口腔医学院牙周科 100081)；曹采方(北京医科大学口腔医学院牙周科 100081)；孟焕新(北京医科大学口腔医学院牙周科 100081)；高岩(北京医科大学口腔医学院病理科)
关键词：牙周炎；中性白细胞；肿瘤坏死因子；白细胞介素1
中华口腔医学杂志000502 【摘要】 目的 探讨快速进展性牙周炎(rapidly progressive periodontitis, RPP)患者局部牙周组织中多形核白细胞(polymorphonuclear neutrophil, PMN)过度浸润及激活与肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)的关系。方法 采用夹心ELISA法检测22例RPP患者共41个位点的龈沟液TNF-α水平，并采用酶促反应法检测同一份龈沟液中的PMN特异酶——弹性蛋白酶(elastase，EA)的活性，通过Spearman相关检验分析TNF-α水平与EA活性的相关性。另取10例RPP患者的牙龈组织，采用免疫组化法检测TNF-α和IL-1β蛋白的表达，通过HE染色观察PMN浸润。结果 龈沟液中的TNF-α水平[(3.23±1.81)ng/位点]与EA活性[(0.54±0.37)Abs/位点]呈显著正相关(r＝0.44,P<0.05)；牙龈组织中的TNF-α和IL-1β蛋白表达与PMN浸润密切相关；有大量PMN浸润的组织，炎症浸润广泛，袋上皮的增生与溃疡显著。结论 与TNF-α和IL-1β等细胞因子相关的PMN的过度浸润与激活促进了RPP的进展。
, http://www.100md.com
The role of IL-1β and TNF-α in hyper-reactivity of neutrophils in rapidly progressive periodontitis patients
LIU Rongkun, CAO Caifang, MENG Huanxin, et al.
(Department of Periodontology, School of Stomatology, Beijing Medical University, Beijing 100081，China)
【Abstract】 Objective Neutrophils (PMNs) from rapidly progressive periodontitis (RPP) was found to generate abnormally high levels of oxygen radicals. Elastase activity in gingival crevicular fluid (GCF) from RPP was also found much higher. It suggested that PMNs in some RPP patients are hyper-reactive. The purpose of this study was to investigate the mechanism of PMN hyper-reactivity by surveying the correlation of TNF-α level with elastase activity in GCF and by evaluating the association between PMN infiltration and the expression of IL-1β and TNF-α in gingival tissues from RPP patients. Methods 41 GCF samples from 22 RPP patients and 34 GCF samples from 11 healthy controls were collected. The total amount of TNF-α in GCF was detected using ELISA. The elastase activity was measured with a low molecular weight substrate (S2484) specific for granulocyte. The correlation of TNF-α level with elastase activity in a GCF sample was analyzed with Spearman correlation. 20 gingival specimens were obtained respectively from 10 RPP patients and 5 periodontally healthy controls. The expression of IL-1β and TNF-α was detected with immunohistochemistry. The distribution of PMN was observed with hematoxylin and eosin staining. Results Total amount of TNF-α in GCF was positively correlated with elastase activity (r=0.44, P< 0.05). The IL-1β- and TNF-α-positive cells in gingiva were superimposed in areas where PMNs infiltration predominant. Conclusion The hyper-reactivity of PMN in RPP patients was related to locally produced IL-1β and TNF-α.
, 百拇医药
【Key words】 Periodontitis； Neutrophils； Tumor necrosis factor； Interleukin-1
快速进展性牙周炎(rapidly progressive periodontitis, RPP)以迅速发展的附着丧失和牙槽骨吸收为特点。有研究报道,中性多形核白细胞(polymorphonuclear neutrophil, PMN)的功能缺陷与RPP的发病特点有关[1]。而另一些研究却未发现RPP患者存在PMN的功能不足[2-5]。Shapira等[6]报道,RPP患者的PMN可过度释放溶酶体酶或超氧离子。我们的研究也发现，RPP患者龈沟液(gingival crevicular fluid, GCF )中的PMN特异酶——弹性蛋白酶(elastase,EA)的活性显著升高[7]，提示部分RPP患者存在PMN的过度浸润或过度释放溶酶体酶。我们通过检测RPP患者龈沟液和牙龈组织中PMN与肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)分泌与表达的关系,以期进一步探讨RPP患者PMN过度浸润与激活的调节机制及意义。
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图1 袋内壁浅层增生的上皮钉突及邻近的结缔组织中可见大量PMN浸润 ( HE×100)
图2 与PMN密集浸润区重叠的TNF-α阳性细胞 (免疫组织化学染色×100)
图3 分布于有大量PMN浸润的袋上皮钉突的IL-1β阳性细胞( 免疫组织化学染色×200)
材料与方法
1.GCF样本的制备：参考Page 1983年提出的诊断标准选择22例RPP患者。另选择11名全身及牙周均健康者作为对照。RPP取样位点41个，健康对照34个。实验对象的一般情况及取样位点的牙周状况见表1。用滤纸条放置于龈沟内30 s取GCF样本，采用称重法定量。离心洗提获取170 μl/位点的GCF洗液，其中100 μl用于检测TNF-α，50 μl用于检测EA活性。
, 百拇医药
2.GCF TNF-α和EA活性的检测：采用夹心ELISA法检测GCF中的TNF-α。ELISA检测试剂盒购自第四军医大学免疫学教研室，敏感性100 ng/L。反应体积为100 μl，单孔，操作步骤按试剂盒提供的实验手册进行。EA活性的检测采用酶催化的底物法[7]。
3.统计分析:同一份GCF中，TNF-α检出量与EA活性的相关性采用Spearman相关分析。
4.牙龈样本的制备：10例RPP患者的牙龈样本均取自重症牙周炎需拔牙者，取样牙无牙周治疗史、无修复体(包括邻牙)、无明显创伤，牙龈组织的切取采用内斜切口，深达袋底。5名健康对照者的牙龈于牙冠延长术中切取。切取的牙龈经OCT包埋，液氮骤冷后，-70℃冰箱保存。
5.牙龈组织切片与染色：用恒冷箱低温切片机(-30℃)，按与牙冠长轴平行的颊舌向纵向剖面切取6～8 μm连续切片，贴于用APES防脱片胶常规处理过的载玻片上，每块载玻片同时贴RPP和健康对照各1张组织切片，丙酮固定10 min。取相邻切片分别进行常规HE和免疫组化染色。后者采用抗TNF-α抗体(第四军医大学免疫学教研室提供)和抗IL-1β抗体(英国PeproTech公司)，通过免疫组化-SP(Streptavidin/Peroxidase)法(SP试剂盒，美国Zymed公司)检测牙龈组织中的TNF-α 和IL-1β蛋白的表达，染色结果用显微镜观察，阳性细胞胞浆见黄褐色颗粒。
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结果
1.RPP组GCF中，TNF-α的检出率为51.2%,阳性位点的平均总量为(3.23±1.81)ng/位点；EA活性为(0.54±0.37)Abs/位点；同一份GCF中的TNF-α水平与EA活性呈显著正相关，r值为0.44,P<0.05。健康组的GCF中， TNF-α未能检出，EA活性为(0.06±0.04)Abs/位点。
2.10个RPP牙龈样本中，7个样本的炎症反应明显较重，有密集炎症细胞浸润的面积占整个组织块面积的一半以上，袋内壁的浅层可见袋上皮的显著增生、溃疡，在增生的上皮钉突及其邻近的结缔组织乳头中，可见密集的PMN浸润，其他类型的炎症细胞少见；在PMN密集浸润的区域，TNF-α和IL-1β蛋白也呈强阳性表达，阳性细胞呈片状或灶状分布，而在无PMN密集浸润的区域，TNF-α和IL-1β蛋白的阳性细胞散在分布(图1～3)。其余3个样本的炎症反应则比较局限，袋上皮轻度增生，浸润的炎症细胞以浆细胞和淋巴细胞为主，未见PMN的大量浸润；TNF-α和IL-1β蛋白的阳性细胞也散在分布。健康对照的牙龈组织均有轻度的炎症反应，以淋巴细胞浸润为主，TNF-α和IL-1β蛋白的阳性细胞少见。
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讨论
PMN在炎症反应过程中发挥抗炎与致炎的双重作用。PMN通过释放溶酶体酶或产生超氧离子杀灭细菌，而这些被释放的溶酶体酶与超氧离子对组织又具有损伤作用。因此，PMN的功能缺陷或反应过度均与牙周炎症反应有关[8,9]。本实验显示，RPP患者牙龈组织中有大量PMN浸润，在PMN密集浸润的组织，袋上皮的增生、溃疡及炎症细胞的浸润程度均明显重于PMN较少的组织。这些结果均支持部分RPP患者存在PMN的过度浸润与激活，与炎症为正相关关系。
表1 实验对象的一般情况及取样位点的牙周状况 组别
n
平均年龄(岁)
男/女
探诊深度(mm)
, 百拇医药
附着丧失(mm)
出血指数
RPP-GCF
41
27.7(21～36)
9/13
6.00±1.55
6.15±1.71
3.42±0.76
对照-GCF
34
29.3(19～35)
, 百拇医药
6/5
<3
0
<2
RPP-牙龈
10
30.7(27～36)
5/5
7.86±2.27
6.86±1.57
3.29±1.11
对照-牙龈
10
, 百拇医药
26.5(19～29)
2/3
≤2
0
≤2
注：RPP：快速进展性牙周炎；GCF：龈沟液；平均年龄括号中为年龄范围 TNF-α和IL-1β均是牙周炎的重要炎症因子，调节结缔组织基质降解和牙槽骨吸收。它们也是PMN浸润与激活的调节因子，参与调节PMN粘附、趋化与释放溶酶体酶和超氧离子的系列活动。近年来的研究还发现，PMN在其吞噬活动中可合成与释放TNF-α和IL-1β，甚至前列腺素E2[10,11]。因此，TNF-α、IL-1β与PMN在炎症反应过程中可能形成一种正反馈机制，即TNF-α和IL-1β可调节更多PMN的浸润与激活，进一步浸润的PMN又可产生更多的TNF-α和IL-1β，其最终的结局是PMN的过度浸润与激活、TNF-α和IL-1β的大量产生，这种恶性循环造成炎症的扩大与持续发展。本实验结果显示，RPP患者不仅其龈沟液中的TNF-α水平与EA活性呈显著正相关，牙龈组织中的TNF-α和IL-1β也与PMN的浸润密切相关，并且这些组织的炎症反应明显较重，提示TNF-α、IL-1β与PMN的正反馈调节机制存在于RPP的炎症反应过程中。
, 百拇医药
综合其他学者及本实验室的系列研究，我们认为，部分RPP患者存在PMN的过度浸润与激活，这种与TNF-α 和IL-1β等细胞因子相关的PMN的过度反应可促进RPP炎症的发展。
基金项目：高等院校博士学科点专项科研基金资助项目(9501020)
参考文献
1，Page PC, Sims TJ, Geissler F, et al. Defective neutrophil and monocyte motility in patients with early onset periodontitis. Infect Immun, 1985, 47: 169-175.
2，Kinane DF, Cullen CF, Johnston FA, et al. Neutrophil chemotactic behaviour in patients with early-onset forms of periodontitis (Ⅱ). Assessment using the under agarose technique. J Clin Periodontol, 1989, 16: 247-251.
, http://www.100md.com
3，Mouynet P, Delamaire M ，le Goff MC, et al. Ex vivo studies of polymorphonuclear neutrophils from patients with early-onset forms of periodontitis (Ⅰ). Chemotactic assessment using the under agarose method. J Clin Periodontol, 1994, 21: 177-183.
4，Biasi D, Bambara LM, Carletto A, et al. Neutrophil migration, oxidative metabolism and adhesion in early onset periodontitis. J Clin Periodontol ，1999, 26:563-568.
5，刘荣坤，曹采方.快速进展性牙周炎患者的白细胞趋化功能. 中华口腔医学杂志，1998，33：335-337.
, 百拇医药
6，Shapira L, Gordon B, Warbington M, et al. Priming effect of Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide on superoxide production by neutrophils from healthy and rapidly progressive periodontitis subjects. J Periodontol, 1994, 65: 129-133.
7，刘荣坤，曹采方.快速进展性牙周炎龈沟液中的弹性蛋白酶活性.中华口腔医学杂志，1999，34：49-51.
8，Hart TC, Shapira L, Van Dyke TE. Neutrophil defects as risk factors for periodontal diseases. J Periodontol, 1994, 65(5 Suppl): 521-529.
, 百拇医药
9，Page RC. Host response tests for diagnosing periodontal diseases. J Periodontol, 1992, 63(4 Suppl):356-366.
10，Galbraith GM, Hagan C , Steed RB, et al. Cytokine production by oral and peripheral blood neutrophils in adult periodontitis. J Periodontol, 1997,68:832-838.
11，Dubravec DB, Spriggs DR, Mannick JA, et al . Circulating human peripheral blood granulocytes synthesize and secrete tumor necrosis factor alpha. Proc Natl Acad Sci U S A ,1990,87:6 758-6 761.
(收稿日期：1999-12-17), 百拇医药
单位：刘荣坤(北京医科大学口腔医学院牙周科 100081)；曹采方(北京医科大学口腔医学院牙周科 100081)；孟焕新(北京医科大学口腔医学院牙周科 100081)；高岩(北京医科大学口腔医学院病理科)
关键词：牙周炎；中性白细胞；肿瘤坏死因子；白细胞介素1
中华口腔医学杂志000502 【摘要】 目的 探讨快速进展性牙周炎(rapidly progressive periodontitis, RPP)患者局部牙周组织中多形核白细胞(polymorphonuclear neutrophil, PMN)过度浸润及激活与肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)的关系。方法 采用夹心ELISA法检测22例RPP患者共41个位点的龈沟液TNF-α水平，并采用酶促反应法检测同一份龈沟液中的PMN特异酶——弹性蛋白酶(elastase，EA)的活性，通过Spearman相关检验分析TNF-α水平与EA活性的相关性。另取10例RPP患者的牙龈组织，采用免疫组化法检测TNF-α和IL-1β蛋白的表达，通过HE染色观察PMN浸润。结果 龈沟液中的TNF-α水平[(3.23±1.81)ng/位点]与EA活性[(0.54±0.37)Abs/位点]呈显著正相关(r＝0.44,P<0.05)；牙龈组织中的TNF-α和IL-1β蛋白表达与PMN浸润密切相关；有大量PMN浸润的组织，炎症浸润广泛，袋上皮的增生与溃疡显著。结论 与TNF-α和IL-1β等细胞因子相关的PMN的过度浸润与激活促进了RPP的进展。
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The role of IL-1β and TNF-α in hyper-reactivity of neutrophils in rapidly progressive periodontitis patients
LIU Rongkun, CAO Caifang, MENG Huanxin, et al.
(Department of Periodontology, School of Stomatology, Beijing Medical University, Beijing 100081，China)
【Abstract】 Objective Neutrophils (PMNs) from rapidly progressive periodontitis (RPP) was found to generate abnormally high levels of oxygen radicals. Elastase activity in gingival crevicular fluid (GCF) from RPP was also found much higher. It suggested that PMNs in some RPP patients are hyper-reactive. The purpose of this study was to investigate the mechanism of PMN hyper-reactivity by surveying the correlation of TNF-α level with elastase activity in GCF and by evaluating the association between PMN infiltration and the expression of IL-1β and TNF-α in gingival tissues from RPP patients. Methods 41 GCF samples from 22 RPP patients and 34 GCF samples from 11 healthy controls were collected. The total amount of TNF-α in GCF was detected using ELISA. The elastase activity was measured with a low molecular weight substrate (S2484) specific for granulocyte. The correlation of TNF-α level with elastase activity in a GCF sample was analyzed with Spearman correlation. 20 gingival specimens were obtained respectively from 10 RPP patients and 5 periodontally healthy controls. The expression of IL-1β and TNF-α was detected with immunohistochemistry. The distribution of PMN was observed with hematoxylin and eosin staining. Results Total amount of TNF-α in GCF was positively correlated with elastase activity (r=0.44, P< 0.05). The IL-1β- and TNF-α-positive cells in gingiva were superimposed in areas where PMNs infiltration predominant. Conclusion The hyper-reactivity of PMN in RPP patients was related to locally produced IL-1β and TNF-α.
, 百拇医药
【Key words】 Periodontitis； Neutrophils； Tumor necrosis factor； Interleukin-1
快速进展性牙周炎(rapidly progressive periodontitis, RPP)以迅速发展的附着丧失和牙槽骨吸收为特点。有研究报道,中性多形核白细胞(polymorphonuclear neutrophil, PMN)的功能缺陷与RPP的发病特点有关[1]。而另一些研究却未发现RPP患者存在PMN的功能不足[2-5]。Shapira等[6]报道,RPP患者的PMN可过度释放溶酶体酶或超氧离子。我们的研究也发现，RPP患者龈沟液(gingival crevicular fluid, GCF )中的PMN特异酶——弹性蛋白酶(elastase,EA)的活性显著升高[7]，提示部分RPP患者存在PMN的过度浸润或过度释放溶酶体酶。我们通过检测RPP患者龈沟液和牙龈组织中PMN与肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)分泌与表达的关系,以期进一步探讨RPP患者PMN过度浸润与激活的调节机制及意义。
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图1 袋内壁浅层增生的上皮钉突及邻近的结缔组织中可见大量PMN浸润 ( HE×100)
图2 与PMN密集浸润区重叠的TNF-α阳性细胞 (免疫组织化学染色×100)
图3 分布于有大量PMN浸润的袋上皮钉突的IL-1β阳性细胞( 免疫组织化学染色×200)
材料与方法
1.GCF样本的制备：参考Page 1983年提出的诊断标准选择22例RPP患者。另选择11名全身及牙周均健康者作为对照。RPP取样位点41个，健康对照34个。实验对象的一般情况及取样位点的牙周状况见表1。用滤纸条放置于龈沟内30 s取GCF样本，采用称重法定量。离心洗提获取170 μl/位点的GCF洗液，其中100 μl用于检测TNF-α，50 μl用于检测EA活性。
, 百拇医药
2.GCF TNF-α和EA活性的检测：采用夹心ELISA法检测GCF中的TNF-α。ELISA检测试剂盒购自第四军医大学免疫学教研室，敏感性100 ng/L。反应体积为100 μl，单孔，操作步骤按试剂盒提供的实验手册进行。EA活性的检测采用酶催化的底物法[7]。
3.统计分析:同一份GCF中，TNF-α检出量与EA活性的相关性采用Spearman相关分析。
4.牙龈样本的制备：10例RPP患者的牙龈样本均取自重症牙周炎需拔牙者，取样牙无牙周治疗史、无修复体(包括邻牙)、无明显创伤，牙龈组织的切取采用内斜切口，深达袋底。5名健康对照者的牙龈于牙冠延长术中切取。切取的牙龈经OCT包埋，液氮骤冷后，-70℃冰箱保存。
5.牙龈组织切片与染色：用恒冷箱低温切片机(-30℃)，按与牙冠长轴平行的颊舌向纵向剖面切取6～8 μm连续切片，贴于用APES防脱片胶常规处理过的载玻片上，每块载玻片同时贴RPP和健康对照各1张组织切片，丙酮固定10 min。取相邻切片分别进行常规HE和免疫组化染色。后者采用抗TNF-α抗体(第四军医大学免疫学教研室提供)和抗IL-1β抗体(英国PeproTech公司)，通过免疫组化-SP(Streptavidin/Peroxidase)法(SP试剂盒，美国Zymed公司)检测牙龈组织中的TNF-α 和IL-1β蛋白的表达，染色结果用显微镜观察，阳性细胞胞浆见黄褐色颗粒。
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结果
1.RPP组GCF中，TNF-α的检出率为51.2%,阳性位点的平均总量为(3.23±1.81)ng/位点；EA活性为(0.54±0.37)Abs/位点；同一份GCF中的TNF-α水平与EA活性呈显著正相关，r值为0.44,P<0.05。健康组的GCF中， TNF-α未能检出，EA活性为(0.06±0.04)Abs/位点。
2.10个RPP牙龈样本中，7个样本的炎症反应明显较重，有密集炎症细胞浸润的面积占整个组织块面积的一半以上，袋内壁的浅层可见袋上皮的显著增生、溃疡，在增生的上皮钉突及其邻近的结缔组织乳头中，可见密集的PMN浸润，其他类型的炎症细胞少见；在PMN密集浸润的区域，TNF-α和IL-1β蛋白也呈强阳性表达，阳性细胞呈片状或灶状分布，而在无PMN密集浸润的区域，TNF-α和IL-1β蛋白的阳性细胞散在分布(图1～3)。其余3个样本的炎症反应则比较局限，袋上皮轻度增生，浸润的炎症细胞以浆细胞和淋巴细胞为主，未见PMN的大量浸润；TNF-α和IL-1β蛋白的阳性细胞也散在分布。健康对照的牙龈组织均有轻度的炎症反应，以淋巴细胞浸润为主，TNF-α和IL-1β蛋白的阳性细胞少见。
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讨论
PMN在炎症反应过程中发挥抗炎与致炎的双重作用。PMN通过释放溶酶体酶或产生超氧离子杀灭细菌，而这些被释放的溶酶体酶与超氧离子对组织又具有损伤作用。因此，PMN的功能缺陷或反应过度均与牙周炎症反应有关[8,9]。本实验显示，RPP患者牙龈组织中有大量PMN浸润，在PMN密集浸润的组织，袋上皮的增生、溃疡及炎症细胞的浸润程度均明显重于PMN较少的组织。这些结果均支持部分RPP患者存在PMN的过度浸润与激活，与炎症为正相关关系。
表1 实验对象的一般情况及取样位点的牙周状况 组别
n
平均年龄(岁)
男/女
探诊深度(mm)
, 百拇医药
附着丧失(mm)
出血指数
RPP-GCF
41
27.7(21～36)
9/13
6.00±1.55
6.15±1.71
3.42±0.76
对照-GCF
34
29.3(19～35)
, 百拇医药
6/5
<3
0
<2
RPP-牙龈
10
30.7(27～36)
5/5
7.86±2.27
6.86±1.57
3.29±1.11
对照-牙龈
10
, 百拇医药
26.5(19～29)
2/3
≤2
0
≤2
注：RPP：快速进展性牙周炎；GCF：龈沟液；平均年龄括号中为年龄范围 TNF-α和IL-1β均是牙周炎的重要炎症因子，调节结缔组织基质降解和牙槽骨吸收。它们也是PMN浸润与激活的调节因子，参与调节PMN粘附、趋化与释放溶酶体酶和超氧离子的系列活动。近年来的研究还发现，PMN在其吞噬活动中可合成与释放TNF-α和IL-1β，甚至前列腺素E2[10,11]。因此，TNF-α、IL-1β与PMN在炎症反应过程中可能形成一种正反馈机制，即TNF-α和IL-1β可调节更多PMN的浸润与激活，进一步浸润的PMN又可产生更多的TNF-α和IL-1β，其最终的结局是PMN的过度浸润与激活、TNF-α和IL-1β的大量产生，这种恶性循环造成炎症的扩大与持续发展。本实验结果显示，RPP患者不仅其龈沟液中的TNF-α水平与EA活性呈显著正相关，牙龈组织中的TNF-α和IL-1β也与PMN的浸润密切相关，并且这些组织的炎症反应明显较重，提示TNF-α、IL-1β与PMN的正反馈调节机制存在于RPP的炎症反应过程中。
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综合其他学者及本实验室的系列研究，我们认为，部分RPP患者存在PMN的过度浸润与激活，这种与TNF-α 和IL-1β等细胞因子相关的PMN的过度反应可促进RPP炎症的发展。
基金项目：高等院校博士学科点专项科研基金资助项目(9501020)
参考文献
1，Page PC, Sims TJ, Geissler F, et al. Defective neutrophil and monocyte motility in patients with early onset periodontitis. Infect Immun, 1985, 47: 169-175.
2，Kinane DF, Cullen CF, Johnston FA, et al. Neutrophil chemotactic behaviour in patients with early-onset forms of periodontitis (Ⅱ). Assessment using the under agarose technique. J Clin Periodontol, 1989, 16: 247-251.
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3，Mouynet P, Delamaire M ，le Goff MC, et al. Ex vivo studies of polymorphonuclear neutrophils from patients with early-onset forms of periodontitis (Ⅰ). Chemotactic assessment using the under agarose method. J Clin Periodontol, 1994, 21: 177-183.
4，Biasi D, Bambara LM, Carletto A, et al. Neutrophil migration, oxidative metabolism and adhesion in early onset periodontitis. J Clin Periodontol ，1999, 26:563-568.
5，刘荣坤，曹采方.快速进展性牙周炎患者的白细胞趋化功能. 中华口腔医学杂志，1998，33：335-337.
, 百拇医药
6，Shapira L, Gordon B, Warbington M, et al. Priming effect of Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide on superoxide production by neutrophils from healthy and rapidly progressive periodontitis subjects. J Periodontol, 1994, 65: 129-133.
7，刘荣坤，曹采方.快速进展性牙周炎龈沟液中的弹性蛋白酶活性.中华口腔医学杂志，1999，34：49-51.
8，Hart TC, Shapira L, Van Dyke TE. Neutrophil defects as risk factors for periodontal diseases. J Periodontol, 1994, 65(5 Suppl): 521-529.
, 百拇医药
9，Page RC. Host response tests for diagnosing periodontal diseases. J Periodontol, 1992, 63(4 Suppl):356-366.
10，Galbraith GM, Hagan C , Steed RB, et al. Cytokine production by oral and peripheral blood neutrophils in adult periodontitis. J Periodontol, 1997,68:832-838.
11，Dubravec DB, Spriggs DR, Mannick JA, et al . Circulating human peripheral blood granulocytes synthesize and secrete tumor necrosis factor alpha. Proc Natl Acad Sci U S A ,1990,87:6 758-6 761.
(收稿日期：1999-12-17), 百拇医药