丙型肝炎病毒E2蛋白的高效表达及其临床应用
作者：谢尧 陶其敏
单位：北京医科大学人民医院肝病研究所,北京 100044
关键词：肝炎病毒；丙型；病毒包膜蛋白质类；代谢；抗体；病毒；血液；大肠杆菌；E2蛋白☆
北京医科大学学报990507 摘 要 目的：在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)E2包膜蛋白，并对其进行初步纯化。用纯化的包膜蛋白检测HCV RNA阳性血清中E2抗体，研究其检测E2抗体的敏感性和特异性。方法：将HCV E2蛋白基因克隆到原核表达载体中，并转化大肠杆菌。用IPTG诱导细菌表达E2蛋白，经离子交换层析纯化蛋白。用纯化的包膜蛋白包被微孔板，经ELISA方法检测HCV RNA阳性血清中的E2抗体。结果：在大肠杆菌表达了相对分子质量为45 000的可溶性E2蛋白，占细菌总蛋白量的21%，纯化后，蛋白纯度为85%。用其检测HCV患者血清171例，E2抗体的检出率为63%。在E2抗体阳性的血清中，部分为抗HCV阴性。结论：E2蛋白的表达及初步纯化的成功，可能用于临床检测。各基因型HCV E2包膜蛋白的抗体之间有交叉反应，在目前的抗HCV诊断试剂中加入可溶性、非融合E2包膜蛋白，可以改善抗HCV诊断试剂的特异性和敏感性。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R512.6
Expression of the E2 protein of hepatitis C virus and its application in clinical diagnosis study
XIE Yao, TAO Qi-Min
(Institute of Hepatology, People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044)
MeSH Hepatitis C viruses Viral envelope proteins/metab Antibodies, viral/blood Escherichia coli E2 envelope protein☆
, 百拇医药
ABSTRACT Objective： To express HCV E2 protein in E.coli and study the specificity and sensitivity of anti-E2 antibody measurement. Methods： The vector expressing HCV E2 protein was constructed by inserting E2 gene into prokaryotic expression vector and transformed into E.coli, then the E.coli was induced with IPTG to express E2 protein. By means of affinity chromatography the expressed protein was purified. By ELISA, the anti-E2 antibodies were detected in HCV RNA positive serum using the expressed protein. Results： The soluble E2 protein with the molecular mass of 45 000 was expressed in E.coli. After purification, the purity of the E2 protein was 85 percent. The purified E2 protein used, anti-E2 antibodies can be detected in 63% patients with chronic hepatitis C and can be detected in some HCV RNA positive but anti-HCV negative serum. Conclusion： The success of expressing and purifying HCV E2 protein was helpful for studying the clinical significance of anti-E2 antibodies examination. The antibodies against E2 from a HCV isolate can crossly react with the E2 protein from another isolate. Inclusion of E2 protein in the antigenic mixture utilized in HCV screening assay would improve the sensitivity and specificity of serological assays.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ, 1999,31:408-411)
对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染的病原学诊断有PCR检测其RNA和抗HCV抗体
检测等方法。但PCR检测操作复杂，价格昂贵，难难以用于临床检测和血源的筛选，目前多用抗HCV抗体检测法。然而，目前所用的试剂检出的抗体阳性不能反映血清中HCV RNA的存在。也有一些患者HCV RNA为阳性，而抗HCV却为阴性，因此不能凭抗HCV检测作出诊断，对HCV E2包膜蛋白的研究发现，用CHO细胞表达的E2糖蛋白检测慢性HCV感染患者血清，80%～97%的患者有E2蛋白抗体 ，且抗E2抗体的检出率与病毒血症密切相关[1，2]。E2抗体水平与病毒复制和血清中HCV RNA的滴度相关，是病毒复制活动的血清学指标[3]。E2抗体的检测可以改善目前抗HCV试剂的特异性和敏感性[4]，是HCV感染诊断的新指标[5]。但是文献中所用的是真核表达的糖基化E2蛋白，表达量低，价格昂贵，不能在临床上广泛应用。本文在大肠杆菌中高效表达了HCV E2蛋白，进行了蛋白的初步纯化，并对其检测HCV患者血清中E2抗体的临床应用进行了研究。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 HCV E2蛋白原核表达载体的构建及蛋白表达
用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ内切酶将本所构建的HCV E2蛋白的真核表达载体(pcDNAE2)上的E2基因切下，并克隆于pUC18质粒。再用EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ将pUC18质粒上的E2基因切下,克隆于原核表达载体pKK223-3中，质粒转化JM105细菌，经扩大培养，提取质粒进行酶切鉴定而获得含有E2基因的阳性克隆(pKKE2)。挑取阳性克隆单个菌落接种于LA培养基中，37℃振摇培养，细菌生长至对数生长期时，加入IPTG诱导E2蛋白表达5 h。取1 ml于离心管中，离心去上清，加入1×SDS-PAGE上样液100 μl，沸水中煮5 min，上样进行SDS-PAGE电泳，转膜后用HCV RNA阳性血清为一抗，做Western Blot检测。
1.2 E2蛋白的初步纯化
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将E2基因阳性克隆细菌接种于LA培养基中，在37℃经2 ml、50 ml和1 000 ml逐步扩大培养，当细菌生长到对数生长期后，加入IPTG继续培养5 h，诱导E2蛋白表达。菌液在4 ℃下离心，弃上清，加冰预冷的PBS 洗涤细菌一次，用100 ml PBS重悬细菌，用超声破碎仪破碎细菌，离心后，上清置于洁净的容器中，沉淀用8 mol.L-1尿素溶解，分别取上清及沉淀溶解物进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色。上清置于透析袋中，于0.1 mol.L-1 PB(pH 8.0)中透析24 h，上样于平衡好的phenyl-sepharose FF疏水性离子交换层析柱中并洗脱，收集洗脱峰。将含有E2蛋白的洗脱液透析后，上样于sepharose-DEAE FF柱中，用不同NaCl浓度的洗脱液洗脱，分别收集洗脱峰，最后得初步纯化的E2蛋白。
1.3 用纯化的E2蛋白检测HCV RNA阳性血清中抗E2抗体
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HCV血清为本所经RT-PCR证实的HCV RNA阳性血清，共171例。E2蛋白抗原在4℃下包被酶标板过夜，用洗液(PBS/Tween, pH 7.4)洗3次，封闭液封闭2 h，洗液洗3次，加入血清稀释液[0.05%(体积分数)Tween/PBS 90 μl +大肠杆菌裂解液10 μl]95 μl和5 μl血清，37℃下孵育1 h，洗3次，加入酶标二抗 100 μl，37℃孵育1 h，洗液洗5次，每次3 min。甩干洗液，加入显色剂100 μl，显色10 min，用50 μl终止液终止反应。在450 nm波长下测光密度值。以阴性对照组(20例) 光密度的均值加两个标准差以上为抗E2抗体阳性标准。
2 结果
全长的HCV E2蛋白基因约为1.1 kb，克隆于pKK223-3原核表达载体后，用IPTG诱导，在大肠杆菌中表达出了相对分子质量约为45 000的E2蛋白，相对分子质量与预计的相符。经扫描检测，E2蛋白的表达量达细菌蛋白总量的21%。用HCV RNA阳性血清做Western blot检测，在45 000处可见一特异性条带，而对照细菌在此处未见条带(见图1)。细菌悬液经超声破碎和离心沉淀后，经SDS-PAGE电泳，沉淀物中未见特异性条带，而上清中可见有45 000的特异性条带，E2蛋白存在于上清中。经疏水柱phenyl-sepharose FF层析和 sepharose-DEAE FF层析后，得到初步纯化的E2蛋白，纯度约为85%左右(图2)。
, 百拇医药
1， cells transfected with pKKE2, in which E2protein was expressed； 2， cells transfected with pKK223-3 blank plasmid； M， protein marker.
图1 大肠杆菌表达的HCV E2蛋白的Western blot检测
Figure 1 Western blotting analysis of E2 protein expressed in E.coli
1， cells transfected with pKK223-3 blank plasmid； 2， cells transfected with pKKE2； 3， purifed E2 protein； M， protein marker.
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图2 大肠杆菌表达的和初步纯化的E2蛋白的SDS-PAGE电泳
Figure 2 SDS-PAGE electrophoresis map of expressed and purified E2 protein
用此纯化的蛋白包被酶标板，检测HCV患者血清171例，检出E2抗体阳性108例，阳性检出率为63.1%。在抗HCV阴性而HCV RNA阳性血清70例的检测中，检出E2抗体阳性35例；63例E2抗体阴性而HCV RNA阳性血清中，检出抗HCV阳性28例。
3 讨论
在HCV的自然感染中，HCV在宿主体内产生的E2蛋白为糖蛋白，糖基对E2蛋白的抗原性和免疫原性有着重要的影响。因慢性HCV患者有较高的抗E2抗体阳性率，且能很好地反映HCV RNA的存在，诸多学者认为抗E2抗体是诊断HCV感染的新指标。我们将HCV E2蛋白基因克隆到非融合性原核表达载体pKK223-3中，细菌经IPTG诱导后，细菌蛋白经SDS-PAGE电泳，用HCV RNA阳性血清做Western Blot检测，在相对分子质量约为45 000处可见一特异性条带，而对照细菌在此处未见条带，说明表达了HCV E2蛋白，且表达量较高，占细菌总蛋白的21%。表达的E2蛋白因无糖基化，其相对分子质量小于真核表达的E2蛋白的相对分子质量(70 000)。对细菌进行超声裂解后，E2蛋白存在于上清中，说明表达的E2蛋白为可溶性蛋白。在本文的纯化过程中不存在包涵体处理的变性和复性，纯化过程中不影响E2蛋白的天然构象，而E2蛋白的抗原性正依赖于蛋白的构象表位[6]，从而不引起E2蛋白抗原性的丢失。但这也给蛋白的纯化带来一定的困难，经两种介质的层析，蛋白纯度只达到85%。
, 百拇医药
因HCV颗粒及其抗原在循环中的浓度极低，难以检测。因此，对以HCV感染的诊断目前以检测抗HCV为主。但目前所用抗HCV检测试剂盒所检测的抗体在HCV感染后出现相对较晚，且有一部分感染者，尤其是免疫功能抑制患者，如肾功能衰竭、肾移植和骨髓移植患者，难以检出抗HCV[7]。抗HCV的检测也难以区分抗HCV阳性患者是有过HCV感染，还是正被HCV感染。因而众多医学工作者在探索如何提高HCV感染的检出率和提高抗HCV检测的敏感性和特异性。
有些作者用真核表达的HCV E2蛋白检测抗E2抗体发现，抗包膜抗体(抗E1或E2抗体)在HCV感染时出现较早[7，4]，检出率高，且与病毒血症密切相关[1，5]，因而引起研究者的极大兴趣。因E2抗体与病毒血症有密切关系，而HCV RNA阴性血清很少有E2抗体[2]，所以我们只检测了HCV RNA阳性血清，研究了E2抗体检测在这些阳性血清中的敏感性和特异性。结果显示，171例HCV RNA阳性血清中，有108例为E2抗体阳性，检出率为63.1%。此检出率低于Lesniewski和Zaaijer报道的检出率(88%～97%)。原因为他们使用的是哺乳动物细胞表达的有糖基化的E2蛋白，而我们使用的E2抗原是原核表达的无糖基化的E2蛋白。但本文的检出率高于Mita[8]报道的(17%)和Hus[9]报道的检出率(28%)。原因可能有：(1) 所检测的样本不同;(2) Mita使用的E2抗原为原核表达的与MBP融合的E2蛋白，E2蛋白与MBP融合，可能改变了E2蛋白的构象表位。Hus使用的是经SDS-PAGE电泳回收的变性蛋白，同样也破坏了E2蛋白的构象表位，而E2抗体的检测却高度依赖于E2蛋白的构象表位[6]。我们所用的是原核表达的非融合性E2蛋白，且是可溶性蛋白，虽没有糖基化，但在纯化过程中无使其变性的操作，因而不破坏其构象表位。
, 百拇医药
Cerino[2]报道，在HCV RNA阳性、抗HCV阴性的血清中很少检出E2抗体。而在我们的检测中，70例抗HCV阴性、HCV RNA阳性血清，有35例为E2抗体阳性。这可能与他使用的是变性蛋白有关。变性蛋白没有构象表位，使检出率降低。而且他使用的是昆虫细胞表达的E2蛋白，虽然昆虫细胞为真核细胞，但Hussy用昆虫细胞表达的E1包膜蛋白检测抗E1抗体时发现，其检出率(10%～40%)低于用大肠杆菌表达的E1蛋白的E1抗体检出率(93%)。认为昆虫细胞表达的E1蛋白过度糖基化，糖基可能掩盖了包膜蛋白的表位[10]。在我们检出的108例E2抗体阳性血清中，既有HCV Ⅲ型病毒株血清，又有Ⅱ型病毒株血清。结果表明，不同型HCV E2蛋白的抗体之间有交叉反应，这些抗体无、或不足以清除血清中的病毒。
本研究结果显示，在大肠杆菌中高效表达了可溶性天然的HCV E2蛋白，用纯化的E2蛋白进行E2抗体检测，可以检出一部分抗HCV检测不能检出的HCV感染者。将E2抗原加入到目前使用的抗HCV检测试剂中，可以改善抗HCV检测试剂的特异性和敏感性。
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注：☆ 自由词。
参考文献
1 Zaaijer HL, Vallari DS, Cunnungham M. E2 and NS5: new antigens for detection of hepatitis C virus antibodies. J Med Virol, 1994,44:395-397
2 Cerino A, Bissolati M, Cividini A. Antibody responses to the hepatitis C virus E2 protein: relationship to viraemia and prevalence in anti-HCV seronegative subjects. J Med Virol, 1997,51：1-5
3 Yuki N, Hayashi N, Kasahara A. Quantitative analysis of antibody to hepatitis C virus envelope 2 glycoprotein in patients with chronic hepatitis C virus infection. Hepatology, 1996,23：947-952
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4 Leon P, Lopez JA, Elola C. Detection of antibody to hepatitis C virus E2 recombinant antigen among samples indeterminate for anti-HCV after wide serological testing and correlation with viremia. Vox Sang, 1996,70：213-216
5 Lesniewski R, Okasinski G, Carrick R. Antibody to hepatitis C virus second envelope (HCV-E2) glycoprotein: a new marker of HCV infection closely associated with viremia. J Med Virol, 1995, 45：415-422
6 Anne FJ, Lunel F, Cahour A. Antibody responses to hepatitis C envelope proteins in patients with acute or chronic hepatitis C. J Med Virol, 1996,50：159-167
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7 Lok ASF, Chien D, Choo QL. Antibody response to core, envelope and nonstructural hepatitis C virus antigens: comparison of immunocompetent and immunosuppressed patients. Hepatology, 1993, 18：497-502
8 Mita E, Hayashi N, Ueda K. Expression of MBP-HCV NS1/E2 fusion protein in E.coli and detection of anti-NS1/E2 antibody in type C chronic liver disease. Biochem Biophys Res Commun, 1992, 183： 925-930
9 Hus HH, Donets M, Greenberg HB. Characterization of hepatitis C virus structural proteins with a recombinant baculovirus expression system. Hepatology, 1993, 17： 763-771
10 Hussy P, Faust H, Wagner JC. Evaluation of hepatitis C virus envelope protein expressed in E.coli and insect cell for use as tools for antibody screening. J Hepatol, 1997, 26：1179-1186
(1998-11-20收稿), 百拇医药
单位：北京医科大学人民医院肝病研究所,北京 100044
关键词：肝炎病毒；丙型；病毒包膜蛋白质类；代谢；抗体；病毒；血液；大肠杆菌；E2蛋白☆
北京医科大学学报990507 摘 要 目的：在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)E2包膜蛋白，并对其进行初步纯化。用纯化的包膜蛋白检测HCV RNA阳性血清中E2抗体，研究其检测E2抗体的敏感性和特异性。方法：将HCV E2蛋白基因克隆到原核表达载体中，并转化大肠杆菌。用IPTG诱导细菌表达E2蛋白，经离子交换层析纯化蛋白。用纯化的包膜蛋白包被微孔板，经ELISA方法检测HCV RNA阳性血清中的E2抗体。结果：在大肠杆菌表达了相对分子质量为45 000的可溶性E2蛋白，占细菌总蛋白量的21%，纯化后，蛋白纯度为85%。用其检测HCV患者血清171例，E2抗体的检出率为63%。在E2抗体阳性的血清中，部分为抗HCV阴性。结论：E2蛋白的表达及初步纯化的成功，可能用于临床检测。各基因型HCV E2包膜蛋白的抗体之间有交叉反应，在目前的抗HCV诊断试剂中加入可溶性、非融合E2包膜蛋白，可以改善抗HCV诊断试剂的特异性和敏感性。
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中国图书资料分类法分类号 R512.6
Expression of the E2 protein of hepatitis C virus and its application in clinical diagnosis study
XIE Yao, TAO Qi-Min
(Institute of Hepatology, People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044)
MeSH Hepatitis C viruses Viral envelope proteins/metab Antibodies, viral/blood Escherichia coli E2 envelope protein☆
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ABSTRACT Objective： To express HCV E2 protein in E.coli and study the specificity and sensitivity of anti-E2 antibody measurement. Methods： The vector expressing HCV E2 protein was constructed by inserting E2 gene into prokaryotic expression vector and transformed into E.coli, then the E.coli was induced with IPTG to express E2 protein. By means of affinity chromatography the expressed protein was purified. By ELISA, the anti-E2 antibodies were detected in HCV RNA positive serum using the expressed protein. Results： The soluble E2 protein with the molecular mass of 45 000 was expressed in E.coli. After purification, the purity of the E2 protein was 85 percent. The purified E2 protein used, anti-E2 antibodies can be detected in 63% patients with chronic hepatitis C and can be detected in some HCV RNA positive but anti-HCV negative serum. Conclusion： The success of expressing and purifying HCV E2 protein was helpful for studying the clinical significance of anti-E2 antibodies examination. The antibodies against E2 from a HCV isolate can crossly react with the E2 protein from another isolate. Inclusion of E2 protein in the antigenic mixture utilized in HCV screening assay would improve the sensitivity and specificity of serological assays.
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(J Beijing Med Univ, 1999,31:408-411)
对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染的病原学诊断有PCR检测其RNA和抗HCV抗体
检测等方法。但PCR检测操作复杂，价格昂贵，难难以用于临床检测和血源的筛选，目前多用抗HCV抗体检测法。然而，目前所用的试剂检出的抗体阳性不能反映血清中HCV RNA的存在。也有一些患者HCV RNA为阳性，而抗HCV却为阴性，因此不能凭抗HCV检测作出诊断，对HCV E2包膜蛋白的研究发现，用CHO细胞表达的E2糖蛋白检测慢性HCV感染患者血清，80%～97%的患者有E2蛋白抗体 ，且抗E2抗体的检出率与病毒血症密切相关[1，2]。E2抗体水平与病毒复制和血清中HCV RNA的滴度相关，是病毒复制活动的血清学指标[3]。E2抗体的检测可以改善目前抗HCV试剂的特异性和敏感性[4]，是HCV感染诊断的新指标[5]。但是文献中所用的是真核表达的糖基化E2蛋白，表达量低，价格昂贵，不能在临床上广泛应用。本文在大肠杆菌中高效表达了HCV E2蛋白，进行了蛋白的初步纯化，并对其检测HCV患者血清中E2抗体的临床应用进行了研究。
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1 材料与方法
1.1 HCV E2蛋白原核表达载体的构建及蛋白表达
用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ内切酶将本所构建的HCV E2蛋白的真核表达载体(pcDNAE2)上的E2基因切下，并克隆于pUC18质粒。再用EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ将pUC18质粒上的E2基因切下,克隆于原核表达载体pKK223-3中，质粒转化JM105细菌，经扩大培养，提取质粒进行酶切鉴定而获得含有E2基因的阳性克隆(pKKE2)。挑取阳性克隆单个菌落接种于LA培养基中，37℃振摇培养，细菌生长至对数生长期时，加入IPTG诱导E2蛋白表达5 h。取1 ml于离心管中，离心去上清，加入1×SDS-PAGE上样液100 μl，沸水中煮5 min，上样进行SDS-PAGE电泳，转膜后用HCV RNA阳性血清为一抗，做Western Blot检测。
1.2 E2蛋白的初步纯化
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将E2基因阳性克隆细菌接种于LA培养基中，在37℃经2 ml、50 ml和1 000 ml逐步扩大培养，当细菌生长到对数生长期后，加入IPTG继续培养5 h，诱导E2蛋白表达。菌液在4 ℃下离心，弃上清，加冰预冷的PBS 洗涤细菌一次，用100 ml PBS重悬细菌，用超声破碎仪破碎细菌，离心后，上清置于洁净的容器中，沉淀用8 mol.L-1尿素溶解，分别取上清及沉淀溶解物进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色。上清置于透析袋中，于0.1 mol.L-1 PB(pH 8.0)中透析24 h，上样于平衡好的phenyl-sepharose FF疏水性离子交换层析柱中并洗脱，收集洗脱峰。将含有E2蛋白的洗脱液透析后，上样于sepharose-DEAE FF柱中，用不同NaCl浓度的洗脱液洗脱，分别收集洗脱峰，最后得初步纯化的E2蛋白。
1.3 用纯化的E2蛋白检测HCV RNA阳性血清中抗E2抗体
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HCV血清为本所经RT-PCR证实的HCV RNA阳性血清，共171例。E2蛋白抗原在4℃下包被酶标板过夜，用洗液(PBS/Tween, pH 7.4)洗3次，封闭液封闭2 h，洗液洗3次，加入血清稀释液[0.05%(体积分数)Tween/PBS 90 μl +大肠杆菌裂解液10 μl]95 μl和5 μl血清，37℃下孵育1 h，洗3次，加入酶标二抗 100 μl，37℃孵育1 h，洗液洗5次，每次3 min。甩干洗液，加入显色剂100 μl，显色10 min，用50 μl终止液终止反应。在450 nm波长下测光密度值。以阴性对照组(20例) 光密度的均值加两个标准差以上为抗E2抗体阳性标准。
2 结果
全长的HCV E2蛋白基因约为1.1 kb，克隆于pKK223-3原核表达载体后，用IPTG诱导，在大肠杆菌中表达出了相对分子质量约为45 000的E2蛋白，相对分子质量与预计的相符。经扫描检测，E2蛋白的表达量达细菌蛋白总量的21%。用HCV RNA阳性血清做Western blot检测，在45 000处可见一特异性条带，而对照细菌在此处未见条带(见图1)。细菌悬液经超声破碎和离心沉淀后，经SDS-PAGE电泳，沉淀物中未见特异性条带，而上清中可见有45 000的特异性条带，E2蛋白存在于上清中。经疏水柱phenyl-sepharose FF层析和 sepharose-DEAE FF层析后，得到初步纯化的E2蛋白，纯度约为85%左右(图2)。
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1， cells transfected with pKKE2, in which E2protein was expressed； 2， cells transfected with pKK223-3 blank plasmid； M， protein marker.
图1 大肠杆菌表达的HCV E2蛋白的Western blot检测
Figure 1 Western blotting analysis of E2 protein expressed in E.coli
1， cells transfected with pKK223-3 blank plasmid； 2， cells transfected with pKKE2； 3， purifed E2 protein； M， protein marker.
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图2 大肠杆菌表达的和初步纯化的E2蛋白的SDS-PAGE电泳
Figure 2 SDS-PAGE electrophoresis map of expressed and purified E2 protein
用此纯化的蛋白包被酶标板，检测HCV患者血清171例，检出E2抗体阳性108例，阳性检出率为63.1%。在抗HCV阴性而HCV RNA阳性血清70例的检测中，检出E2抗体阳性35例；63例E2抗体阴性而HCV RNA阳性血清中，检出抗HCV阳性28例。
3 讨论
在HCV的自然感染中，HCV在宿主体内产生的E2蛋白为糖蛋白，糖基对E2蛋白的抗原性和免疫原性有着重要的影响。因慢性HCV患者有较高的抗E2抗体阳性率，且能很好地反映HCV RNA的存在，诸多学者认为抗E2抗体是诊断HCV感染的新指标。我们将HCV E2蛋白基因克隆到非融合性原核表达载体pKK223-3中，细菌经IPTG诱导后，细菌蛋白经SDS-PAGE电泳，用HCV RNA阳性血清做Western Blot检测，在相对分子质量约为45 000处可见一特异性条带，而对照细菌在此处未见条带，说明表达了HCV E2蛋白，且表达量较高，占细菌总蛋白的21%。表达的E2蛋白因无糖基化，其相对分子质量小于真核表达的E2蛋白的相对分子质量(70 000)。对细菌进行超声裂解后，E2蛋白存在于上清中，说明表达的E2蛋白为可溶性蛋白。在本文的纯化过程中不存在包涵体处理的变性和复性，纯化过程中不影响E2蛋白的天然构象，而E2蛋白的抗原性正依赖于蛋白的构象表位[6]，从而不引起E2蛋白抗原性的丢失。但这也给蛋白的纯化带来一定的困难，经两种介质的层析，蛋白纯度只达到85%。
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因HCV颗粒及其抗原在循环中的浓度极低，难以检测。因此，对以HCV感染的诊断目前以检测抗HCV为主。但目前所用抗HCV检测试剂盒所检测的抗体在HCV感染后出现相对较晚，且有一部分感染者，尤其是免疫功能抑制患者，如肾功能衰竭、肾移植和骨髓移植患者，难以检出抗HCV[7]。抗HCV的检测也难以区分抗HCV阳性患者是有过HCV感染，还是正被HCV感染。因而众多医学工作者在探索如何提高HCV感染的检出率和提高抗HCV检测的敏感性和特异性。
有些作者用真核表达的HCV E2蛋白检测抗E2抗体发现，抗包膜抗体(抗E1或E2抗体)在HCV感染时出现较早[7，4]，检出率高，且与病毒血症密切相关[1，5]，因而引起研究者的极大兴趣。因E2抗体与病毒血症有密切关系，而HCV RNA阴性血清很少有E2抗体[2]，所以我们只检测了HCV RNA阳性血清，研究了E2抗体检测在这些阳性血清中的敏感性和特异性。结果显示，171例HCV RNA阳性血清中，有108例为E2抗体阳性，检出率为63.1%。此检出率低于Lesniewski和Zaaijer报道的检出率(88%～97%)。原因为他们使用的是哺乳动物细胞表达的有糖基化的E2蛋白，而我们使用的E2抗原是原核表达的无糖基化的E2蛋白。但本文的检出率高于Mita[8]报道的(17%)和Hus[9]报道的检出率(28%)。原因可能有：(1) 所检测的样本不同;(2) Mita使用的E2抗原为原核表达的与MBP融合的E2蛋白，E2蛋白与MBP融合，可能改变了E2蛋白的构象表位。Hus使用的是经SDS-PAGE电泳回收的变性蛋白，同样也破坏了E2蛋白的构象表位，而E2抗体的检测却高度依赖于E2蛋白的构象表位[6]。我们所用的是原核表达的非融合性E2蛋白，且是可溶性蛋白，虽没有糖基化，但在纯化过程中无使其变性的操作，因而不破坏其构象表位。
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Cerino[2]报道，在HCV RNA阳性、抗HCV阴性的血清中很少检出E2抗体。而在我们的检测中，70例抗HCV阴性、HCV RNA阳性血清，有35例为E2抗体阳性。这可能与他使用的是变性蛋白有关。变性蛋白没有构象表位，使检出率降低。而且他使用的是昆虫细胞表达的E2蛋白，虽然昆虫细胞为真核细胞，但Hussy用昆虫细胞表达的E1包膜蛋白检测抗E1抗体时发现，其检出率(10%～40%)低于用大肠杆菌表达的E1蛋白的E1抗体检出率(93%)。认为昆虫细胞表达的E1蛋白过度糖基化，糖基可能掩盖了包膜蛋白的表位[10]。在我们检出的108例E2抗体阳性血清中，既有HCV Ⅲ型病毒株血清，又有Ⅱ型病毒株血清。结果表明，不同型HCV E2蛋白的抗体之间有交叉反应，这些抗体无、或不足以清除血清中的病毒。
本研究结果显示，在大肠杆菌中高效表达了可溶性天然的HCV E2蛋白，用纯化的E2蛋白进行E2抗体检测，可以检出一部分抗HCV检测不能检出的HCV感染者。将E2抗原加入到目前使用的抗HCV检测试剂中，可以改善抗HCV检测试剂的特异性和敏感性。
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注：☆ 自由词。
参考文献
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4 Leon P, Lopez JA, Elola C. Detection of antibody to hepatitis C virus E2 recombinant antigen among samples indeterminate for anti-HCV after wide serological testing and correlation with viremia. Vox Sang, 1996,70：213-216
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9 Hus HH, Donets M, Greenberg HB. Characterization of hepatitis C virus structural proteins with a recombinant baculovirus expression system. Hepatology, 1993, 17： 763-771
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(1998-11-20收稿), 百拇医药