银杏叶提取物对小鼠耐缺氧作用的影响
作者：李晓莉 王斌 苏喜生 刘嘉麟 张声华
单位：张声华( 华中农业大学食品科技系)；李晓莉 王斌 苏喜生 刘嘉麟(军事经济学院营养食品研究所，武汉 430035)
关键词：
卫生研究000329 文章编号：1000-8020(2000)03-0190-02
银杏叶(ginkgo biloba leaves)系银杏科植物银杏(ginkgo biloba L.)的干燥叶，其性甘苦涩，具有益心敛肺、化湿止泻、活血化瘀、通脉舒络的作用。银杏叶提取物(ginkgo biloba extract,GBE)化学成分较复杂[1，2]，它们具有多方面的药理和临床作用。随着对银杏叶及其提取物中生物活性成分的化学和生理作用研究的不断深入，GBE已广泛应用于医药、保健食品及化妆品等领域。至90年代，日本和美国等许多国家已将GBE作为防治心脑血管疾病和抗衰老的第3代功能食品或添加剂加以开发。
, 百拇医药
银杏叶提取物中主要生物活性成分为银杏黄酮糖苷和银杏萜内酯，据报道能有效地防治心脑血管疾病，拮抗血小板活化因子(PAF)，增强机体免疫功能，有抗氧化和清除自由基的作用[3]。实验研究已表明，银杏叶水提液可以显著延长小鼠密闭缺氧存活时间[4]。为了探讨其作用机理，研究了GBE对小鼠的耐缺氧作用，并对其作用机理进行了分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 银杏叶 武汉，夏末秋初采集的黄绿色叶。
1.1.2 动物 昆明种小白鼠，2月龄，体重(20±2)g，健康雄性，由湖北省医学科学院实验动物中心提供。
1.1.3 SOD活性测定试剂盒 购自北京海军总医院分子生物学研究室。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 GBE的制备 称取一定量粗碎的叶末，加入5倍于叶重体积的70%乙醇，在60℃水浴回流提取3次，每次2h，抽滤分离出固体残渣，将合并后的提取液置冰箱中放置过夜，离心取上清液，减压浓缩。浓缩液用石油醚萃取2次，弃去醚层，水层冷冻干燥，GBE得率为18%。
1.2.2 耐常压缺氧实验 将小鼠依体重随机分为对照组和GBE实验组，每组20只，正常进食和饮水。实验组每天分别灌胃不同剂量的GBE，设50，100，200，300mg/(kg.d) 4个剂量组，每只小鼠每天灌胃量为25ml/kg BW，对照组则给予等体积的蒸馏水。连续灌胃7天，末次给予后1h，将各组小鼠分别放入盛有5g钠石灰的250ml广口瓶内(每瓶只放1只小鼠)，用凡士林涂抹瓶口，盖严，使之不漏气，立即计时，直至呼吸停止。以小鼠在密闭广口瓶内存活时间为指标，比较各组耐缺氧时间。
, http://www.100md.com
1.2.3 总黄酮苷含量的测定[5] 标准曲线的制作：准确配制0.2300mg/ml的芦丁标准液，按文献方法测定，以吸光度(A)与相应的标液浓度(Y)求回归方程和相关系数，得：
=0.9897A-0.007202，r=0.9999
GBE中总黄酮苷含量的测定 准确称取0.02g左右的GBE，用30%乙醇溶解后定容于25ml容量瓶中，取2.0ml按上述方法进行测定，以试液空白代替常用的试剂空白。GBE中总黄酮苷含量为8.6%。
1.2.4 血红蛋白(Hb)含量的测定 高铁氰化法[6]。小鼠停止呼吸后，立即取出，以微量取血管从小鼠心脏采取10μl血液，按文献方法测定。
1.2.5 丙二醛(MDA)含量的测定 TBA显色法[7]。取小白鼠全脑和心肌，以预冷的0.667mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.45)制成10%匀浆液，依文献方法测定，按下列公式求MDA的含量C(nmol/g组织)：
, http://www.100md.com
式中，A532：正丁醇提取液在532nm波长的吸光度
ε(消光系数)：1.56×105/(mol.cm)
D：每克匀浆中的组织重(g)
1.2.6 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定 SOD活性测定试剂盒。分离小鼠血浆，按试剂盒说明书操作方法测定血浆中总SOD活性。总SOD活性以亚硝酸盐单位表示，即NU/ml。
1.3 统计方法
采用t检验法。
2 结果
2.1 小鼠密闭缺氧存活时间
, 百拇医药
从表1结果可知，不同剂量的GBE均能显著延长小鼠在密闭缺氧条件下的存活时间，其中以100mg/(kg.d)剂量组增加率最大(60.8%)。
表1 GBE对小鼠密闭缺氧存活时间的影响(
±s,n=20) 剂量组
[mg/(kg.d)]
t/min
延长率(%)
—
31.1±1.5
—
, http://www.100md.com
50
41.8±3.0(1)
34.4
100
50.0±2.5(1)
60.8
200
41.7±2.5(1)
34.1
300
39.3±4.2(1)
, http://www.100md.com
35.0
注：(1)与对照组比较 P<0.01
2.2 血液Hb含量、组织中MDA含量及血浆总SOD活性的影响
从表2结果可知，GBE100mg/(kg.d)剂量组小鼠的Hb蛋白含量高于对照组(P<0.05)，其它3组与对照组相比无显著性差异。
GBE可以降低缺氧小鼠脑组织MDA含量，而低剂量组与对照组比较差异无显著性。GBE各剂量组小鼠心肌MDA含量均比对照组显著下降(P<0.01)。
除50mg/(kg.d)剂量组可以显著增加小鼠血浆中SOD活性(P<0.05)外，随着GBE剂量的增大SOD活性呈下降趋势。
, http://www.100md.com
表2 GBE对血液Hb和组织MDA含量及血浆总SOD活性的影响(±s,n=20) 剂量组
[mg/(kg.d)]
Hb含量
(g/L)
脑MDA
(nmol/g)
心肌MDA
(nmol/g)
SOD活性
(NU/ml)
, 百拇医药
对照组
164.86±2.51
98.36±4.05
98.08±4.98
32.0±3.7
50
166.92±3.90
97.44±4.26
82.69±1.34(2)
44.4±2.6
100
177.38±5.17(1)
, http://www.100md.com
91.03±5.07
83.33±2.03(2)
29.6±3.6
200
161.92±3.26
76.92±2.33(2)
71.80±2.43(2)
23.5±1.5(1)
300
164.86±2.56
, http://www.100md.com 68.59±4.26(2)
73.08±3.38(2)
22.2±2.3(1)
注：与对照组比较(1)P<0.05 (2)P<0.01
3 讨 论
本研究显示，银杏叶提取物(GBE)可以显著延长小鼠在密闭条件下的存活时间。该结果与银杏叶水提液耐缺氧实验结果[4]在含量上的对应关系互为印证，但是GBE对小鼠的耐缺氧效应明显优于银杏叶水提液，这与银杏黄酮糖苷和银杏萜内酯的浓集有关。
在高原缺氧条件下，机体为适应缺氧环境，血液中的Hb含量出现代偿性增高。而GBE灌胃小鼠在短时间密闭缺氧后Hb含量无显著性变化。
, http://www.100md.com
胡敏在实验中已证实，银杏叶粗提物具有明显的清除活性氧的效果，且粗提物清除氧自由基的效果略好于精提物，银杏叶提取物中的黄酮糖苷和银杏萜内酯均具有抗氧化效应，从而防止脂质过氧化反应[5]。
GBE各组小鼠脑和心肌MDA含量降低，且随着剂量的增大效果增加；血浆中总SOD活性在GBE低剂量时比对照组显著升高(P<0.05)，但随剂量增加SOD活性下降。这一结果表明，在GBE低剂量时SOD起主要作用，但抗氧化作用的效果并不明显；在GBE高剂量时，GBE起到清除自由基的主导作用，SOD活性受到抑制。GBE可显著降低机体中脂质过氧化反应，减缓组织在缺氧时的损伤，有利于保护组织的生理功能。
基金项目：总后勤部课题资助项目(No.98(后司)86-123)
作者简介：李晓莉，女，博士，讲师
参考文献
, 百拇医药
1，Hasler A, Gian-Andrea GA, Meier B,et al. Complex flavonol glycosides from the leaves of Ginkgo biloba. Phytochemistry.1992,31(41):1391—1394
2，Victoiv C, Hagg-Berruier M, Lobstein-Guth A,et al.Isolation of flavonol Glycosides from Ginkgo biloba leaves. Planta Medica,1988,245—247
3，游松，姚新生，陈英杰.银杏的化学药理研究进展.沈阳药学院学报.1998，5(2)：142—148
4，李晓莉，王斌，刘嘉麟，等.枸杞、人参、天麻、银杏叶耐缺氧效应的比较研究.食品科学，1999，(2)：18—20
5，胡敏.银杏叶生物活性成分研究(Ⅰ).见：华中农业大学.博士学位论文集.武汉：华中农业大学，1998
6，金宗濂，文镜，唐粉芳，等.功能食品评价原理及方法.北京：北京大学出版社，1995
7，叶于聪，陈钦铭，柴凤玲，等.藏药唐古特青兰耐缺氧和清除自由基作用的实验研究.中草药，1994，25(3)：134—136
(1999-09-08收稿), http://www.100md.com
单位：张声华( 华中农业大学食品科技系)；李晓莉 王斌 苏喜生 刘嘉麟(军事经济学院营养食品研究所，武汉 430035)
关键词：
卫生研究000329 文章编号：1000-8020(2000)03-0190-02
银杏叶(ginkgo biloba leaves)系银杏科植物银杏(ginkgo biloba L.)的干燥叶，其性甘苦涩，具有益心敛肺、化湿止泻、活血化瘀、通脉舒络的作用。银杏叶提取物(ginkgo biloba extract,GBE)化学成分较复杂[1，2]，它们具有多方面的药理和临床作用。随着对银杏叶及其提取物中生物活性成分的化学和生理作用研究的不断深入，GBE已广泛应用于医药、保健食品及化妆品等领域。至90年代，日本和美国等许多国家已将GBE作为防治心脑血管疾病和抗衰老的第3代功能食品或添加剂加以开发。
, 百拇医药
银杏叶提取物中主要生物活性成分为银杏黄酮糖苷和银杏萜内酯，据报道能有效地防治心脑血管疾病，拮抗血小板活化因子(PAF)，增强机体免疫功能，有抗氧化和清除自由基的作用[3]。实验研究已表明，银杏叶水提液可以显著延长小鼠密闭缺氧存活时间[4]。为了探讨其作用机理，研究了GBE对小鼠的耐缺氧作用，并对其作用机理进行了分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 银杏叶 武汉，夏末秋初采集的黄绿色叶。
1.1.2 动物 昆明种小白鼠，2月龄，体重(20±2)g，健康雄性，由湖北省医学科学院实验动物中心提供。
1.1.3 SOD活性测定试剂盒 购自北京海军总医院分子生物学研究室。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 GBE的制备 称取一定量粗碎的叶末，加入5倍于叶重体积的70%乙醇，在60℃水浴回流提取3次，每次2h，抽滤分离出固体残渣，将合并后的提取液置冰箱中放置过夜，离心取上清液，减压浓缩。浓缩液用石油醚萃取2次，弃去醚层，水层冷冻干燥，GBE得率为18%。
1.2.2 耐常压缺氧实验 将小鼠依体重随机分为对照组和GBE实验组，每组20只，正常进食和饮水。实验组每天分别灌胃不同剂量的GBE，设50，100，200，300mg/(kg.d) 4个剂量组，每只小鼠每天灌胃量为25ml/kg BW，对照组则给予等体积的蒸馏水。连续灌胃7天，末次给予后1h，将各组小鼠分别放入盛有5g钠石灰的250ml广口瓶内(每瓶只放1只小鼠)，用凡士林涂抹瓶口，盖严，使之不漏气，立即计时，直至呼吸停止。以小鼠在密闭广口瓶内存活时间为指标，比较各组耐缺氧时间。
, http://www.100md.com
1.2.3 总黄酮苷含量的测定[5] 标准曲线的制作：准确配制0.2300mg/ml的芦丁标准液，按文献方法测定，以吸光度(A)与相应的标液浓度(Y)求回归方程和相关系数，得：
=0.9897A-0.007202，r=0.9999GBE中总黄酮苷含量的测定 准确称取0.02g左右的GBE，用30%乙醇溶解后定容于25ml容量瓶中，取2.0ml按上述方法进行测定，以试液空白代替常用的试剂空白。GBE中总黄酮苷含量为8.6%。
1.2.4 血红蛋白(Hb)含量的测定 高铁氰化法[6]。小鼠停止呼吸后，立即取出，以微量取血管从小鼠心脏采取10μl血液，按文献方法测定。
1.2.5 丙二醛(MDA)含量的测定 TBA显色法[7]。取小白鼠全脑和心肌，以预冷的0.667mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.45)制成10%匀浆液，依文献方法测定，按下列公式求MDA的含量C(nmol/g组织)：
, http://www.100md.com
式中，A532：正丁醇提取液在532nm波长的吸光度
ε(消光系数)：1.56×105/(mol.cm)
D：每克匀浆中的组织重(g)
1.2.6 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定 SOD活性测定试剂盒。分离小鼠血浆，按试剂盒说明书操作方法测定血浆中总SOD活性。总SOD活性以亚硝酸盐单位表示，即NU/ml。
1.3 统计方法
采用t检验法。
2 结果
2.1 小鼠密闭缺氧存活时间
, 百拇医药
从表1结果可知，不同剂量的GBE均能显著延长小鼠在密闭缺氧条件下的存活时间，其中以100mg/(kg.d)剂量组增加率最大(60.8%)。
表1 GBE对小鼠密闭缺氧存活时间的影响(
±s,n=20) 剂量组[mg/(kg.d)]
t/min
延长率(%)
—
31.1±1.5
—
, http://www.100md.com
50
41.8±3.0(1)
34.4
100
50.0±2.5(1)
60.8
200
41.7±2.5(1)
34.1
300
39.3±4.2(1)
, http://www.100md.com
35.0
注：(1)与对照组比较 P<0.01
2.2 血液Hb含量、组织中MDA含量及血浆总SOD活性的影响
从表2结果可知，GBE100mg/(kg.d)剂量组小鼠的Hb蛋白含量高于对照组(P<0.05)，其它3组与对照组相比无显著性差异。
GBE可以降低缺氧小鼠脑组织MDA含量，而低剂量组与对照组比较差异无显著性。GBE各剂量组小鼠心肌MDA含量均比对照组显著下降(P<0.01)。
除50mg/(kg.d)剂量组可以显著增加小鼠血浆中SOD活性(P<0.05)外，随着GBE剂量的增大SOD活性呈下降趋势。
, http://www.100md.com
表2 GBE对血液Hb和组织MDA含量及血浆总SOD活性的影响(
±s,n=20) 剂量组[mg/(kg.d)]
Hb含量
(g/L)
脑MDA
(nmol/g)
心肌MDA
(nmol/g)
SOD活性
(NU/ml)
, 百拇医药
对照组
164.86±2.51
98.36±4.05
98.08±4.98
32.0±3.7
50
166.92±3.90
97.44±4.26
82.69±1.34(2)
44.4±2.6
100
177.38±5.17(1)
, http://www.100md.com
91.03±5.07
83.33±2.03(2)
29.6±3.6
200
161.92±3.26
76.92±2.33(2)
71.80±2.43(2)
23.5±1.5(1)
300
164.86±2.56
, http://www.100md.com 68.59±4.26(2)
73.08±3.38(2)
22.2±2.3(1)
注：与对照组比较(1)P<0.05 (2)P<0.01
3 讨 论
本研究显示，银杏叶提取物(GBE)可以显著延长小鼠在密闭条件下的存活时间。该结果与银杏叶水提液耐缺氧实验结果[4]在含量上的对应关系互为印证，但是GBE对小鼠的耐缺氧效应明显优于银杏叶水提液，这与银杏黄酮糖苷和银杏萜内酯的浓集有关。
在高原缺氧条件下，机体为适应缺氧环境，血液中的Hb含量出现代偿性增高。而GBE灌胃小鼠在短时间密闭缺氧后Hb含量无显著性变化。
, http://www.100md.com
胡敏在实验中已证实，银杏叶粗提物具有明显的清除活性氧的效果，且粗提物清除氧自由基的效果略好于精提物，银杏叶提取物中的黄酮糖苷和银杏萜内酯均具有抗氧化效应，从而防止脂质过氧化反应[5]。
GBE各组小鼠脑和心肌MDA含量降低，且随着剂量的增大效果增加；血浆中总SOD活性在GBE低剂量时比对照组显著升高(P<0.05)，但随剂量增加SOD活性下降。这一结果表明，在GBE低剂量时SOD起主要作用，但抗氧化作用的效果并不明显；在GBE高剂量时，GBE起到清除自由基的主导作用，SOD活性受到抑制。GBE可显著降低机体中脂质过氧化反应，减缓组织在缺氧时的损伤，有利于保护组织的生理功能。
基金项目：总后勤部课题资助项目(No.98(后司)86-123)
作者简介：李晓莉，女，博士，讲师
参考文献
, 百拇医药
1，Hasler A, Gian-Andrea GA, Meier B,et al. Complex flavonol glycosides from the leaves of Ginkgo biloba. Phytochemistry.1992,31(41):1391—1394
2，Victoiv C, Hagg-Berruier M, Lobstein-Guth A,et al.Isolation of flavonol Glycosides from Ginkgo biloba leaves. Planta Medica,1988,245—247
3，游松，姚新生，陈英杰.银杏的化学药理研究进展.沈阳药学院学报.1998，5(2)：142—148
4，李晓莉，王斌，刘嘉麟，等.枸杞、人参、天麻、银杏叶耐缺氧效应的比较研究.食品科学，1999，(2)：18—20
5，胡敏.银杏叶生物活性成分研究(Ⅰ).见：华中农业大学.博士学位论文集.武汉：华中农业大学，1998
6，金宗濂，文镜，唐粉芳，等.功能食品评价原理及方法.北京：北京大学出版社，1995
7，叶于聪，陈钦铭，柴凤玲，等.藏药唐古特青兰耐缺氧和清除自由基作用的实验研究.中草药，1994，25(3)：134—136
(1999-09-08收稿), http://www.100md.com