反相高效液相色谱法测定复方银杏胶囊中总黄酮含量
作者：陆敏仪 李梅 周燕文 杨正鸿 黄剑辉 郭世彦
单位：(陆敏仪)广西药品检验所 南宁 530021；(李梅 周燕文 杨正鸿 黄剑辉 郭世彦)广西医科大学第一附属医院
关键词：槲皮素，银杏叶，总黄酮，反相高效液相色谱法
中国医院药学杂志991209
摘要 目的:为本品质量控制提供了一个准确、重现性好的测定方法及积累数据。方法:CLC-ODS1柱，流动相磷酸溶液(4→1000)-甲醇(50∶50)，检测波长360nm，反相高效液相色谱法测定复方银杏胶囊中总黄酮含量。结果:线性范围40～320μg.ml-1，加样回收率98.70%(n=10,RSD=3.79%)。结论:提供本品10批测定数据，其含量限度应为标示量(10mg/粒)的±10.0%。
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Determination of total flavonoids in
compound Ginkgo capsules by RP-HPLC
Lu Minyi Lie Mei Zhao Yanwen et al
Guangxi Institute for Drug Control,Nanning 530021
ABSTRACT OBJECTIVE：To develope an effective quality control method for compound Ginkgo capsules.METHODS：Total flavonoids in compound Ginkgo capsules was determined by RP-HPLC,using CLC-ODSI column,H3PO4 (4→1000)-methanol (50∶50) as mobile phase and UV detector at 360 nm.RESULTS：The linearity range was 40～320 μg.ml-1,the average recovery was 98.70% with RSD 3.79%.CONCLUSION：Ten batches were determined,and limit of the contents for total flavonoids should be ±10.00% of the standard amount.
, 百拇医药
KEY WORDS Quercetin,compound Ginkgo capsules,flavonoids,RP-HPLC
复方银杏胶囊主要有效成分为银杏黄酮苷、银杏内酯和三七皂苷等，具有改善血液流变学、调整血管功能、保护组织细胞等作用。临床用于治疗脑栓塞、缺血性脑血管病、冠心病、心绞痛、心肌梗塞等症，效果良好。为保证制剂质量，本文采用高效液相色谱法[1]测定银杏总黄酮的含量，现报道如下。
1 材料与仪器
样品 复方银杏胶囊(本院制剂，批号详见表2)；对照品 槲皮素(中国药品生物制品检定所，批号911131)；日本岛津LC-6A高效液相色谱仪；CR4-AX数据处理机：LC-6A紫外检测器；10μl微量注射器；实验所用的甲醇为分析纯(AR)。
2 对照品、供试品溶液的配制
, 百拇医药
2.1 对照品贮备液的制备 精密称取105℃干燥至恒重的槲皮素对照品20.0mg，置50.0ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，备用(每1ml中含槲皮素0.4mg)。
2.2 对照品溶液的制备 精密吸取对照品贮备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0ml，分置10ml量瓶中，各加甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。
2.3 供试品溶液的制备 各取供试品20粒，精密称定，倾出内容物，研细，精密称取约1.2g(约相当于总黄酮60mg，精密加甲醇20ml，超声提取20min，滤过，弃去初滤液。精密量取续滤液10ml，置100ml烧瓶中，加甲醇10ml，再加硫酸液(4→100)20ml，水浴加热回流3h，放冷，移至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，用0.5mm滤膜滤过，作为供试液。
3 条件及其优化
3.1 条件 色谱柱：日本岛津CLC-ODS1(6mm×150mm,5μm)。保护柱：日本岛津CLC-ODS(6mm×10mm,5mm)。色谱条件：流动相为磷酸溶液(4→1000)-甲醇(50∶50)，流速1ml.min-1，柱温40℃，检测波长360nm，AUFS0.02，记录仪衰减5，纸速5mm.min-1，进样量10μl。
, 百拇医药
3.2 系统适用性 取槲皮素对照品溶液(120μg.ml-1)进样5次，计算理论板数，理论板数按槲皮素峰计算，不得低于3000(n=5,S=188.6,RSD=5.00%)，详见图1。
图1 HPLC色谱图
a.空白；b.对照品；c.复方银杏叶胶囊
3.3 线性试验 取上述槲皮素系列对照品溶液分别进样，结果表明在40～320μg.ml-1浓度范围内线性良好，回归方程：Y(μg.ml-1)=7.0126×10-6X(峰面积)+0.0367，r=0.9999(n=8)。
, http://www.100md.com 3.4 阴性试验 对不加入银杏浸膏的阴性模拟处方以同样的方法测定，结果无干扰。
3.5 稳定性试验 取槲皮素对照品、970503批号样品溶液，依本法每隔60min测定一次，连续监测8h，结果对照品平均含量为123.15μg.ml-1(n=7,RSD=2.26%)。样品平均含量为9.48mg/粒(n=7,RSD=2.41%)，结果表明对照品和样品均于8h内稳定。
3.6 精密度 取970503批号样品，依本法测定5次，结果平均含量为9.52mg/粒(n=5,RSD=1.45%)。
3.7 重复性试验 取970503批号样品，依本法进行6次测定，结果平均含量为9.54mg/粒(n=6,RSD=2.01%)。
3.8 加样回收试验 精密称取950701批号样品约0.6g，共15份，其中5份不加槲皮素对照品(用以测定样品本底)，5份各加入10mg，5份各加入20mg槲皮素对照品，按供试品溶液制备项下从加甲醇20ml起，依本法测定。结果平均回收率为98.07%(n=5,RSD=3.23%)，见表1。
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表1 加样回收率试验 序
号
样品中槲
皮素量
μg.ml-1
加入量
μg.ml-1
实测量
μg.ml-1
回收率
%
平均
, 百拇医药
回收率
%
1
9.36
(n=5)
RSD=
0.52%
10.00
18.54
91.80
98.11
RSD＝
3.16%
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2
10.00
18.83
94.70
3
10.00
19.12
97.60
4
10.00
19.29
99.30
5
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10.00
19.27
99.10
6
20.00
28.73
96.85
7
20.00
29.33
99.85
8
20.00
, 百拇医药
29.28
99.60
9
20.00
29.22
99.30
10
20.00
29.96
103.00
3.9 样品测定 取供试品溶液分别依本法测定，其中最大的3个峰，据保留时间依次为槲皮素、山萘酚、异鼠李素，以外标法照下列公式计算供试品中总黄酮的含量，见表2。Y=Q(756.7/302.2)+K(740.7/286.2)+I(770.6/316.2)[2]表2 10批复方银杏叶胶囊中槲皮素的含量(n=4) 编号
, 百拇医药
批号
槲皮素含量/mg/粒
样品标示量/%
1
970401
10.2
102.00
2
970402
9.9
99.00
3
970403
, 百拇医药
9.3
93.00
4
970404
9.9
99.00
5
970501
9.7
97.00
6
970502
9.8
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98.00
7
970503
9.5
95.00
8
980816
10.5
105.00
9
980612
9.6
96.00
, 百拇医药
10
981012
10.3
103.00
±s
9±0.4
98.7±3.7
式中：Y为供试品中总黄酮的含量(mg)，Q为供试品中槲皮素的含量(mg)；K为供试品中山萘酚的含量(mg)，I为供试品中异鼠李素的含量(mg)。
4 讨论
国内外多以黄酮苷作为银杏制剂含量控制指标。本方法亦沿用相近的质控手段对本品中银杏总黄酮进行了高效液相色谱法的含量测定，实验表明本法可有效地排除本方中黄芪，三七等药味的干扰，方法简便，准确度高，重现性好，可作为本品质量控制手段。
, 百拇医药
对研制的10批复方银杏胶囊测定结果表明，本品总黄酮含量在(9.3±10.5)mg/粒之间，均落于标示量(10mg/粒)±10.0%幅度之内。故本品的含量测定限度暂订为标示量的±10.0%为宜。为此，本品的制备过程中，必须对本品的原料银杏叶干膏及半成品总干颗粒也进行相应的含量测定，以确保本品的内在质量。
本法是间接测定本品中银杏总黄酮苷，其最大特点是所用对照品大多实验室易得，但经水解和公式换算易产生一定偏差，故进一步深入植化研究，尽快普及各银杏叶黄酮苷对照品，将是银杏类制剂分析急待解决的课题。
注释：黄剑辉 郭世彦 广西桂林医学药学系93级实习生
参考文献
1 陈志一.4家药厂银杏片剂的质量比较.中国医院药学杂志，1996，16(12)：558
2 粟晓黎、鲁静.银杏叶制剂总黄酮醇苷HPLC测定方法对比研究.药物分析杂志.1998，18(3)：186
收稿日期：1998年11月28日, 百拇医药
单位：(陆敏仪)广西药品检验所 南宁 530021；(李梅 周燕文 杨正鸿 黄剑辉 郭世彦)广西医科大学第一附属医院
关键词：槲皮素，银杏叶，总黄酮，反相高效液相色谱法
中国医院药学杂志991209
摘要 目的:为本品质量控制提供了一个准确、重现性好的测定方法及积累数据。方法:CLC-ODS1柱，流动相磷酸溶液(4→1000)-甲醇(50∶50)，检测波长360nm，反相高效液相色谱法测定复方银杏胶囊中总黄酮含量。结果:线性范围40～320μg.ml-1，加样回收率98.70%(n=10,RSD=3.79%)。结论:提供本品10批测定数据，其含量限度应为标示量(10mg/粒)的±10.0%。
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Determination of total flavonoids in
compound Ginkgo capsules by RP-HPLC
Lu Minyi Lie Mei Zhao Yanwen et al
Guangxi Institute for Drug Control,Nanning 530021
ABSTRACT OBJECTIVE：To develope an effective quality control method for compound Ginkgo capsules.METHODS：Total flavonoids in compound Ginkgo capsules was determined by RP-HPLC,using CLC-ODSI column,H3PO4 (4→1000)-methanol (50∶50) as mobile phase and UV detector at 360 nm.RESULTS：The linearity range was 40～320 μg.ml-1,the average recovery was 98.70% with RSD 3.79%.CONCLUSION：Ten batches were determined,and limit of the contents for total flavonoids should be ±10.00% of the standard amount.
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KEY WORDS Quercetin,compound Ginkgo capsules,flavonoids,RP-HPLC
复方银杏胶囊主要有效成分为银杏黄酮苷、银杏内酯和三七皂苷等，具有改善血液流变学、调整血管功能、保护组织细胞等作用。临床用于治疗脑栓塞、缺血性脑血管病、冠心病、心绞痛、心肌梗塞等症，效果良好。为保证制剂质量，本文采用高效液相色谱法[1]测定银杏总黄酮的含量，现报道如下。
1 材料与仪器
样品 复方银杏胶囊(本院制剂，批号详见表2)；对照品 槲皮素(中国药品生物制品检定所，批号911131)；日本岛津LC-6A高效液相色谱仪；CR4-AX数据处理机：LC-6A紫外检测器；10μl微量注射器；实验所用的甲醇为分析纯(AR)。
2 对照品、供试品溶液的配制
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2.1 对照品贮备液的制备 精密称取105℃干燥至恒重的槲皮素对照品20.0mg，置50.0ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，备用(每1ml中含槲皮素0.4mg)。
2.2 对照品溶液的制备 精密吸取对照品贮备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0ml，分置10ml量瓶中，各加甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。
2.3 供试品溶液的制备 各取供试品20粒，精密称定，倾出内容物，研细，精密称取约1.2g(约相当于总黄酮60mg，精密加甲醇20ml，超声提取20min，滤过，弃去初滤液。精密量取续滤液10ml，置100ml烧瓶中，加甲醇10ml，再加硫酸液(4→100)20ml，水浴加热回流3h，放冷，移至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，用0.5mm滤膜滤过，作为供试液。
3 条件及其优化
3.1 条件 色谱柱：日本岛津CLC-ODS1(6mm×150mm,5μm)。保护柱：日本岛津CLC-ODS(6mm×10mm,5mm)。色谱条件：流动相为磷酸溶液(4→1000)-甲醇(50∶50)，流速1ml.min-1，柱温40℃，检测波长360nm，AUFS0.02，记录仪衰减5，纸速5mm.min-1，进样量10μl。
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3.2 系统适用性 取槲皮素对照品溶液(120μg.ml-1)进样5次，计算理论板数，理论板数按槲皮素峰计算，不得低于3000(n=5,S=188.6,RSD=5.00%)，详见图1。
图1 HPLC色谱图
a.空白；b.对照品；c.复方银杏叶胶囊
3.3 线性试验 取上述槲皮素系列对照品溶液分别进样，结果表明在40～320μg.ml-1浓度范围内线性良好，回归方程：Y(μg.ml-1)=7.0126×10-6X(峰面积)+0.0367，r=0.9999(n=8)。
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3.5 稳定性试验 取槲皮素对照品、970503批号样品溶液，依本法每隔60min测定一次，连续监测8h，结果对照品平均含量为123.15μg.ml-1(n=7,RSD=2.26%)。样品平均含量为9.48mg/粒(n=7,RSD=2.41%)，结果表明对照品和样品均于8h内稳定。
3.6 精密度 取970503批号样品，依本法测定5次，结果平均含量为9.52mg/粒(n=5,RSD=1.45%)。
3.7 重复性试验 取970503批号样品，依本法进行6次测定，结果平均含量为9.54mg/粒(n=6,RSD=2.01%)。
3.8 加样回收试验 精密称取950701批号样品约0.6g，共15份，其中5份不加槲皮素对照品(用以测定样品本底)，5份各加入10mg，5份各加入20mg槲皮素对照品，按供试品溶液制备项下从加甲醇20ml起，依本法测定。结果平均回收率为98.07%(n=5,RSD=3.23%)，见表1。
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表1 加样回收率试验 序
号
样品中槲
皮素量
μg.ml-1
加入量
μg.ml-1
实测量
μg.ml-1
回收率
%
平均
, 百拇医药
回收率
%
1
9.36
(n=5)
RSD=
0.52%
10.00
18.54
91.80
98.11
RSD＝
3.16%
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2
10.00
18.83
94.70
3
10.00
19.12
97.60
4
10.00
19.29
99.30
5
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10.00
19.27
99.10
6
20.00
28.73
96.85
7
20.00
29.33
99.85
8
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29.28
99.60
9
20.00
29.22
99.30
10
20.00
29.96
103.00
3.9 样品测定 取供试品溶液分别依本法测定，其中最大的3个峰，据保留时间依次为槲皮素、山萘酚、异鼠李素，以外标法照下列公式计算供试品中总黄酮的含量，见表2。Y=Q(756.7/302.2)+K(740.7/286.2)+I(770.6/316.2)[2]表2 10批复方银杏叶胶囊中槲皮素的含量(n=4) 编号
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批号
槲皮素含量/mg/粒
样品标示量/%
1
970401
10.2
102.00
2
970402
9.9
99.00
3
970403
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9.3
93.00
4
970404
9.9
99.00
5
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9.7
97.00
6
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9.8
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98.00
7
970503
9.5
95.00
8
980816
10.5
105.00
9
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9.6
96.00
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981012
10.3
103.00
±s9±0.4
98.7±3.7
式中：Y为供试品中总黄酮的含量(mg)，Q为供试品中槲皮素的含量(mg)；K为供试品中山萘酚的含量(mg)，I为供试品中异鼠李素的含量(mg)。
4 讨论
国内外多以黄酮苷作为银杏制剂含量控制指标。本方法亦沿用相近的质控手段对本品中银杏总黄酮进行了高效液相色谱法的含量测定，实验表明本法可有效地排除本方中黄芪，三七等药味的干扰，方法简便，准确度高，重现性好，可作为本品质量控制手段。
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对研制的10批复方银杏胶囊测定结果表明，本品总黄酮含量在(9.3±10.5)mg/粒之间，均落于标示量(10mg/粒)±10.0%幅度之内。故本品的含量测定限度暂订为标示量的±10.0%为宜。为此，本品的制备过程中，必须对本品的原料银杏叶干膏及半成品总干颗粒也进行相应的含量测定，以确保本品的内在质量。
本法是间接测定本品中银杏总黄酮苷，其最大特点是所用对照品大多实验室易得，但经水解和公式换算易产生一定偏差，故进一步深入植化研究，尽快普及各银杏叶黄酮苷对照品，将是银杏类制剂分析急待解决的课题。
注释：黄剑辉 郭世彦 广西桂林医学药学系93级实习生
参考文献
1 陈志一.4家药厂银杏片剂的质量比较.中国医院药学杂志，1996，16(12)：558
2 粟晓黎、鲁静.银杏叶制剂总黄酮醇苷HPLC测定方法对比研究.药物分析杂志.1998，18(3)：186
收稿日期：1998年11月28日, 百拇医药