重组红细胞生成素对血透患者免疫功能的影响
作者：王质刚 张育 张启东
单位：王质刚(首都医科大学附属北京友谊医院肾内科 北京，100050)；张育(首都医科大学附属北京友谊医院肾内科 北京，100050)；张启东(首都医科大学附属北京友谊医院肾内科 北京，100050)
关键词：免疫功能；重组人红细胞生成素；血液透析
肾脏病与透析肾移植杂志0000110 摘 要 目的：评价重组红细胞生成素(rH-EPO)对透析患者免疫功能的影响。 方法：用流式细胞仪、双抗体夹心酶标法、ELISA法、MTT比色法以及淋巴细胞毒试验检测接受rH-EPO治疗的慢性血透患者以及透析治疗不伴贫血患者的淋巴细胞亚群、细胞因子等免疫指标。 结果：治疗组rH-EPO治疗前淋巴细胞亚群、细胞因子与正常人、患者对照组比较有显著性差异(P<0.05)；治疗组rH-EPO治疗前后CD3、细胞因子、淋巴细胞刺激指数(SI)、群体反应性抗体(PRA)有显著变化(P值分别为<0.05和<0.001)。 结论：rH-EPO不是直接影响患者免疫功能，而是增加RBC数量，间接通过红细胞表面LFA-3与淋巴细胞表面CD2受体直接结合，增加细胞因子的分泌，影响T-细胞功能。
, 百拇医药
EFFECT OF RECOMBINANT HUMAN ERYTHROPOIETIN ON IMMUNE FUNCTION IN HEMODIALYSIS PATIENTS
WANG Zhigang ZHANG Yu ZHANG Qidong
(Department of Nephrology，Beijing Friendship Hospital，Capital University of Medical Science，Beijing 100050)
OBJECTIVE To evaluate the effect and related mechanism of rh-EPO on cellular immune functional parameters in hemodialysis patients. METHODOLOGY 30 rh-EPO treated anemic patients on maintenance hemodialysis(treatment group)，10 non-anemic patients on maintenance hemodialysis(patient control group)and 10 healthy volunteers(control group)were involved in this study.T lymphocyte subgroups were determined with flow cytometry and monoclonal anti-CD3，anti-CD4 and anti-CD8.Interleukine-2(IL-2)，soluble IL-2 receptor and TNF-α were determined with ELISA.Panel reactive antibody(PRA)and lymphocyte stimulation index(SI)were also determined. RESULTS Significant difference in pretreatment lymphocyte subsets were found among the treatment group，the patient control group and the control group.Levels of CD3，TNF α，IL-2 and lymphocyte stimulation index were significantly increased(P<0.05)and panel reactive antibody significantly decreased after treatment with rh-EPO (P<0.01). CONCLUSION rh-EPO treatment in hemodialysis patients exerts its improving effect on immune function via the increment of circulating red blood cell count，which directly influences.T lymphocyte function through combination of RBC LFA-3 with lymphocyte CD2 to enhance cytokine secretion.
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Key words immune function rh-EPO hemodialysis
血液透析患者免疫功能低下[1]，其机制目前尚不完全清楚，但充分透析纠正贫血、输血或应用重组人红细胞生成素(rH-EPO)治疗后免疫功能可以部分改善。为进一步探讨贫血与透析患者免疫功能改善的关系，我们研究了应用rH-EPO治疗与通过透析矫正贫血的血液透析患者免疫功能的变化，并对免疫功能改善的机制进行了讨论。
1 对象和方法
1.1 病例选择 患者来自我院透析中心，选择维持性透析不伴有贫血患者10例为“对照组”，原发疾病为慢性肾炎9例，多囊肾1例；拟用rH-EPO治疗的伴贫血的透析患者30例为“治疗组”，其中8例在3年前曾经接受输血1～5个单位，原发疾病为慢性肾炎21例，糖尿病肾病5例，间质性肾炎2例，动脉硬化2例。临床资料见表1。应用rH-EPO(军事医学科学院生物工程研究所，北京四环生物工程制品厂生产，2500 U/支，批号9601～9603)，初始应用剂量100～150 U/(kg*w)，以后根据红细胞压积(Hct)水平增减rH-EPO剂量，连续观察12周。患者常规服用速力菲或力蜚能。碳酸氢盐透析，均使用聚砜膜(F6)透析器，膜面积1.3m2，每周透析12～15h。选自我科10名正常成人为“正常对照组”，男4人，女6人，平均年龄42±11.7岁。
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Table 1. Clinical data of patients in the treatment group and the control group
(
±s)
n
male/female
average age
(years)
dialysis duration
(month)
average conc of hemaglobin
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(g/L)
Control group
10
6/4
51.9±8.90
37.7±26.8
104±12
Treatment group
30
17/13
48.8±16.0
37.3±28
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64.2±12*
*P<0.05 vs Control group
1.2 检测项目及方法
1.2.1 T-淋巴细胞亚群测定 取全血100 μl，分别加20 μl CD3、CD4、CD8荧光抗体，室温避光10 min，1000 r/min，离心5 min，PBS洗一次，加0.5ml PBS。用流式细胞仪(美国BD公司FAC Sort)测定百分数。
1.2.2 IL-2检测 首先诱生IL-2[2]，取受试患者肝素抗凝静脉血5ml，用淋巴细胞分离液无菌分离单个核细胞，每孔调细胞数1.5×1.66加入96孔板中，每份标本加8孔，其中4孔加植物血凝素(PHA)100μl/孔，4孔作空白对照，37℃，5%CO2饱和湿度，培养48h，收集上清，贮存-20℃待测。采用双抗体夹心法(深圳晶美生物工程有限公司提供酶标试剂盒)，包被用抗人IL-2单克隆抗体，标本和标准品中IL-2与单抗结合，用洗涤液洗去未结合物，再加入生物素化的抗人IL-2，与结合在单抗上的IL-2结合，形成免疫复合物，再洗去多余的抗体，辣根过氧化物酶标记Streptavidin，将多余的酶联物洗掉，加入TMB显兰色，加终止液变黄，在450nm处酶标仪测A值，依据标准曲线，查找浓度(ng/L)。
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1.2.3 sIL-2R测定 分离PBMNC，采用双抗体夹心ELISA法(法国IMMUNOTECH公司试剂盒)。在已包被的96孔板内加入标本、标准品后，再加入100μl sIL-2R酶标抗体(除空白对照孔)，18～25℃孵育120min，每5min振荡一次，用洗涤液洗板3min×3次，加入200μl底物，黑暗处孵育30min，每5min振荡一次，每孔加50μl终止液。于410nm处酶标仪测每孔A值，空白调零。依据标准曲线，查出浓度(pmol/L)。
1.2.4 TNFα测定 分离单核细胞，采用法国MEDGENIX公司试剂盒，上清标本对倍稀释，按试剂盒操作规程操作(单位：ng/L)。
1.2.5 淋巴细胞转化率(刺激指数SI) 淋巴细胞分离同诱生法，用MTT比色法测定PHA诱导的人外周血淋巴细胞转化率[3]。将吸取上清的每孔用1640营养液和PHA补足，继续培养68h，加入MTT 10 μl/孔，再培养4～6h，弃掉上清，加入100 μl/孔酸化SDS，37℃ 1h或4℃过夜，490nm测定A值，计算出刺激指数(SI)。
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1.2.6 群体反应性抗体(PRA) 分离淋巴细胞(L)和单核细胞(M)，取无关健康人静脉血20ml，共37份，2000 r/min离心10min，取富含白细胞层置于分离液上，分别依次加入浓度75%、65%、55%、40%分层液，3600 r/min离心30min，取55%与40%浓度之界面为单核细胞，60%与55%之界面为淋巴细胞。用治疗组患者rH-EPO治疗前和后血清，分别检测针对37份无关健康人单核细胞或淋巴细胞PRA的阳性率，仿照标准微量淋巴细胞毒实验方法[4]。
1.3 统计学处理 使用Microsoft Excel软件包进行统计学分析，各组数据均以均数±标准差表示；两组间均数比较用t检验；百分率均数比较用卡方检验；Hb变化量与淋巴细胞亚群、细胞因子进行单因素相关分析。
2 结 果
2.1 正常人与对照组、治疗前组T-淋巴细胞亚群、细胞因子 见表2。
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Table 2. Pre-treatment T lymphocyte subgroups and cytokines concentrations(±s)
n
CD3(%)
CD4(%)
CD8(%)
CD4/CD8
TNFα(ng/L)
IL-2(ng/L)
sIL-2R(pmol/L)
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Healthy normal
10
69.7±5.25
1.80±0.19
2.53±0.46
1.43±0.44
8683±1436
2009±625
40.7±10.0
Control group
10
65.4±5.49
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1.70±0.24
2.73±0.89
1.77±0.91*
7639±365
1737±49
149±34.3*
Treatment group
30
60.7±7.90
1.60±0.22
3.00±0.84
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1.91±0.84*
7238±1576*
1216±786*
198±89.4**
*P<0.05，**P<0.001 vs Healthy normal and Control group 治疗组rH-EPO治疗前T-淋巴细胞亚群与正常人和对照组有显著性差异(P<0.05)；rH-EPO治疗组治疗前TNFα、IL-2与正常人和对照组有显著性差异(P<0.05)；rH-EPO治疗组治疗前sIL-2R与正常人、对照组均有显著性差异(分别为P<0.001，P<0.05)。
2.2 rH-EPO治疗前、后T-淋巴细胞亚群与细胞因子变化 见表3。rH-EPO治疗前、后CD3、TNFα、IL-2有显著性差异(P<0.05)。
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Table 3.The Pre-treatment and Post-treatment T lymphocyte subgroups and
cytokines concentrations in the treatment group
n
CD3(%)
CD4(%)
CD8(%)
CD4/CD8
TNFα(ng/L)
IL-2(ng/L)
sIL-2R(pmol/L)
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Pre-Treatment
30
60.67±7.90
1.55±0.22
3.00±0.84
1.91±0.84
7237.9±1576
1215.7±785.9
148.7±89.4
Post-Treatment
30
68.35±8.60
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1.69±0.20
2.76±0.50
1.71±0.56
8658.4±2208*
1879.2±875.0*
181.0±122
*P<0.05 vs pre-Treatment
2.3 rH-EPO治疗前、后SI与PRA变化 见表4。
Table 4. The Pre-treatment and Post-treatment T lymphocyte
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stimulation index(SI)and PRA in the treatment group
n
SI(%)
Lymphocyte
PRA(%)
Monocyte
PRA(%)
Pre-Treatment
30
0.91±0.40
35.1
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37.8
Post-Treatment
30
1.58±0.55*
0.80**
10.8**
*P<0.05，**P<0.001 vs Pre-Treatment
rH-EPO治疗前、后SI、PRA有显著性差异(分别为P<0.05，P<0.001)。
2.4 血红蛋白变化 治疗后Hb由64.2±12 g/L上升至109±13 g/L，P<0.05。
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血红蛋白变化量与淋巴细胞亚群、细胞因子的单因素相关分析结果表明，Hb变化量与CD4、CD8呈正相关，相关系数分别为r＝0.6032和0.7053，P<0.05；Hb变化量与TNFα、IL-2呈正相关，相关系数分别为r＝0.6983和0.6475，P<0.05。
3 讨 论
长期透析的终末期肾病患者免疫功能存在缺陷[5]，包括细胞免疫和体液免疫。近年研究证实细胞因子也参与免疫功能的紊乱，其机制尚未完全阐明。本组资料表明，治疗组rH-EPO治疗前与正常成人和对照组T-淋巴细胞亚群有明显差异(P<0.05)，而治疗组rH-EPO治疗前、后(除CD3外)无显著性差异，提示充分透析纠正贫血后异常的淋巴细胞亚群可以部分纠正，与Ueki等[6]报告一致，但作者用rH-EPO治疗6个月后，Hct从21.5±1.7%增加到28.2±3.5%，而CD3、CD4、CD8、CD20、CD4/CD8比值均无变化。作者进一步研究发现，透析患者CD4和CD8细胞亚群CD4+CD45RA+、CD8+S6F1+比健康人明显降低，rH-EPO治疗6个月后，CD4+CD45RA+增加，而CD4+CD29+、CD8+S6F1+无变化。本文正常人TNFα、IL-2高于rH-EPO治疗前(P<0.05)，对照组TNFα、IL-2与rH-EPO治疗前无显著性差异。正常人sIL-2R显著低于对照组(P<0.05)及rH-EPO治疗前(P<0.001)。rH-EPO治疗后TNFα、IL-2水平升高，与rH-EPO治疗前比较均有显著性差异(P<0.05)，而rH-EPO治疗前、后sIL-2R无变化，与Gafter等[7]报道一致。本组还观察了淋巴细胞转化率(刺激指数SI)和群体反应性抗体(PRA)的变化，结果显示，rH-EPO治疗后SI明显升高(P<0.05)，淋巴细胞(L)和单核细胞(M)的PRA有显著减少(P<0.001)。
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本组资料显示，充分透析纠正贫血状态或经rH-EPO治疗贫血改善后患者，均出现免疫功能的改善；有报道提示，体外试验rH-EPO对细胞因子分泌没有影响；有作者体外研究表明，不同rH-EPO浓度时，对T-细胞亚群摄取3H-胸腺嘧啶均无影响，表明rH-EPO诱导的免疫调节是间接刺激免疫系统介导的[5]；Gafter等[7]报道，静脉放血使细胞因子分泌减少，输血后细胞因子分泌增加，并且细胞因子上升程度与Hb浓度升高呈正相关；本文相关分析表明Hb变化量与CD4、CD8、TNFα和IL-2呈正相关，以上事实说明rH-EPO不能直接影响免疫功能，而与rH-EPO治疗后Hb升高，患者全身营养状态改善有关。此外，Ueki等认为，rH-EPO治疗后T-细胞亚群的变化也可能是由于rH-EPO降低了尿毒症患者血清中存在的T-细胞抑制物质，后者可能是一种极低密度脂蛋白。该作者体外试验提示，rH-EPO不能直接引起CD4+CD45RA+、CD4+CD29+、CD8+S6F1+和CD8+S6F1-增生，证实是rH-EPO治疗后透析患者全身状态改善，继而T-细胞亚群的功能恢复。
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Gafter等[7]指出，ESRD患者IL-2水平低于正常人，但用rH-EPO治疗后，其水平与Hb升高呈正相关，随着Hb上升，细胞因子逐渐相应升高。输注RBC也可以促进细胞因子分泌增加。体外研究已证明，RBC可刺激T、B细胞，体内研究表明，RBC刺激单核细胞可以促进细胞因子分泌。RBC可能间接活化单个核细胞，推测单个核细胞对PHA刺激反应增强，是通过把丝裂原结合到RBC上并呈递到反应细胞上达到的。另一种可能是通过RBC直接活化淋巴细胞。人类T-淋巴细胞表面的绵羊红细胞受体(CD2)是存在所有成熟T-细胞上的一种表面糖蛋白，它的天然配体是一种广泛分布于红细胞表面粘附分子的淋巴细胞相关抗原3(LFA-3)。近来研究表明，这种LFA-3抗原在RBC表面表达，与CD2直接结合，相互作用把活化信号传递到人T-淋巴细胞上，促进T-淋巴细胞增生分化，表面IL-2受体表达增加，IL-2、TNF分泌增加。RBC对淋巴细胞的作用，可以被淋巴细胞与抗-CD2抗体预先孵育或RBC与抗LFA-3单克隆抗体预处理所抵消。近来试验证明，同种RBC可以刺激分泌各种细胞因子。当人单核细胞和鼠脾细胞用人或鼠抗CD2抗体分别预处理，会减少细胞因子分泌，表明RBC可以通过RBC上的LFA-3分子和淋巴细胞CD2分子相互作用促进细胞因子分泌。
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本组资料表明，rH-EPO治疗后淋巴细胞刺激指数(SI)明显增加(P<0.05)，与Singh等[8]报道一致。作者认为尿毒症贫血患者淋巴细胞对丝裂原诱导的增殖反应减弱，而rH-EPO治疗后明显改善，表明rH-EPO治疗可以间接增强透析患者的免疫反应。
本治疗组30例患者rH-EPO治疗前8例有输血史，但至少3年患者PRA没有自然阴转，rH-EPO治疗3个月后，对37份无关健康供者淋巴细胞和单核细胞的PRA滴度有显著性下降(P<0.001)。接受输血、妊娠、预防接种和肾移植术后等因素可使受者PRA滴度增高，但很少自然阴转。王质刚等[9]报道，对2例肾移植术后肾失功患者行血浆置换3次，治疗后PRA血清滴度仍无明显变化。Barany等[10]报道，26例透析患者接受rH-EPO治疗，治疗前均有输血史，治疗6～18个月PRA明显下降(从60%降到35%)，作者指出，长期rH-EPO治疗PRA反应下降可能增加移植肾存活率。Grimm等[11]报道，一组年轻CAPD贫血患者抗HLA抗体降低，对PHA刺激增殖反应明显下降，PRA反应低下，作者指出，贫血可能是影响免疫反应的一个因素，停止输血和应用rH-EPO治疗可以使PRA水平下降或消失，表明是由于应用rH-EPO使贫血改善，或由于减少抗原(输血)刺激，PRA自然下降。
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参考文献
1，王质刚.血液透析患者免疫功能紊乱及其机制探讨.国外医学泌尿系统分册，1995，15(增刊)：21
2，曲海政，程佩萱.IL-2在JRA诊断和治疗过程中的临床意义.中国实验临床免疫学杂志，1994，6(4)：29
3，付体辉，谢之荣，邓碧芳等.MTT比色法检测肿瘤患者的淋转功能及其条件分析.中国实验临床免疫学杂志，1994，6(2)：30
4，Terasaki PI，Bernoco D，Park MS et al.Microdroplet testing for HLA-A，-B，-C，and D antigens.The phillip levine award lecture.Am J Clin Pathol，1978，69(2)：103
, 百拇医药
5，Latscha BD，Herbelin A.Long-term dialysis and cellular immunity：A critical survey.Kidney Int，1993，43(Suppl 41)：s135
6，Ueki Y，Nagata M，Miyake S et al.Lymphocyte subsets in hemodialysis patients treated with recombinant human erythropoietin.J Clin Immunol，1993，13(4)：279
7，Gafter U，Kalechman Y，Orlin JB et al.Anemia of uremia is associated with reduced in vitro cytokine secretion：Immunopotentiating activity of red blood cells.Kidney Int，1994，45：224
, 百拇医药
8，Singh AB，Singh M，Palekar S et al.The effects of recombinant human erythropoietin on the cell mediated immune response of renal failure patients.J Med，1992，23(5)：189
9，王质刚，蒲寐医，马林林.血浆置换的临床应用.中华医学杂志，1990，70(2)：98
10，Barany P，Fehrman I，Godoy C.Long-term effects on lymphocytotoxic antibody and immune reactivity in hemodialysis patients treated with recombinant human erythropoietin.Clin Nephrol，1992，37(2)：90
11，Grimm PC，Trieman LS，Sekiya NM et al.Effects of recombinant human erythropoietin on HLA sensitization and cell mediated immunity.Kidney Int，1990，38：12
收稿1999-11-29
修回1999-12-25, http://www.100md.com
单位：王质刚(首都医科大学附属北京友谊医院肾内科 北京，100050)；张育(首都医科大学附属北京友谊医院肾内科 北京，100050)；张启东(首都医科大学附属北京友谊医院肾内科 北京，100050)
关键词：免疫功能；重组人红细胞生成素；血液透析
肾脏病与透析肾移植杂志0000110 摘 要 目的：评价重组红细胞生成素(rH-EPO)对透析患者免疫功能的影响。 方法：用流式细胞仪、双抗体夹心酶标法、ELISA法、MTT比色法以及淋巴细胞毒试验检测接受rH-EPO治疗的慢性血透患者以及透析治疗不伴贫血患者的淋巴细胞亚群、细胞因子等免疫指标。 结果：治疗组rH-EPO治疗前淋巴细胞亚群、细胞因子与正常人、患者对照组比较有显著性差异(P<0.05)；治疗组rH-EPO治疗前后CD3、细胞因子、淋巴细胞刺激指数(SI)、群体反应性抗体(PRA)有显著变化(P值分别为<0.05和<0.001)。 结论：rH-EPO不是直接影响患者免疫功能，而是增加RBC数量，间接通过红细胞表面LFA-3与淋巴细胞表面CD2受体直接结合，增加细胞因子的分泌，影响T-细胞功能。
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EFFECT OF RECOMBINANT HUMAN ERYTHROPOIETIN ON IMMUNE FUNCTION IN HEMODIALYSIS PATIENTS
WANG Zhigang ZHANG Yu ZHANG Qidong
(Department of Nephrology，Beijing Friendship Hospital，Capital University of Medical Science，Beijing 100050)
OBJECTIVE To evaluate the effect and related mechanism of rh-EPO on cellular immune functional parameters in hemodialysis patients. METHODOLOGY 30 rh-EPO treated anemic patients on maintenance hemodialysis(treatment group)，10 non-anemic patients on maintenance hemodialysis(patient control group)and 10 healthy volunteers(control group)were involved in this study.T lymphocyte subgroups were determined with flow cytometry and monoclonal anti-CD3，anti-CD4 and anti-CD8.Interleukine-2(IL-2)，soluble IL-2 receptor and TNF-α were determined with ELISA.Panel reactive antibody(PRA)and lymphocyte stimulation index(SI)were also determined. RESULTS Significant difference in pretreatment lymphocyte subsets were found among the treatment group，the patient control group and the control group.Levels of CD3，TNF α，IL-2 and lymphocyte stimulation index were significantly increased(P<0.05)and panel reactive antibody significantly decreased after treatment with rh-EPO (P<0.01). CONCLUSION rh-EPO treatment in hemodialysis patients exerts its improving effect on immune function via the increment of circulating red blood cell count，which directly influences.T lymphocyte function through combination of RBC LFA-3 with lymphocyte CD2 to enhance cytokine secretion.
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Key words immune function rh-EPO hemodialysis
血液透析患者免疫功能低下[1]，其机制目前尚不完全清楚，但充分透析纠正贫血、输血或应用重组人红细胞生成素(rH-EPO)治疗后免疫功能可以部分改善。为进一步探讨贫血与透析患者免疫功能改善的关系，我们研究了应用rH-EPO治疗与通过透析矫正贫血的血液透析患者免疫功能的变化，并对免疫功能改善的机制进行了讨论。
1 对象和方法
1.1 病例选择 患者来自我院透析中心，选择维持性透析不伴有贫血患者10例为“对照组”，原发疾病为慢性肾炎9例，多囊肾1例；拟用rH-EPO治疗的伴贫血的透析患者30例为“治疗组”，其中8例在3年前曾经接受输血1～5个单位，原发疾病为慢性肾炎21例，糖尿病肾病5例，间质性肾炎2例，动脉硬化2例。临床资料见表1。应用rH-EPO(军事医学科学院生物工程研究所，北京四环生物工程制品厂生产，2500 U/支，批号9601～9603)，初始应用剂量100～150 U/(kg*w)，以后根据红细胞压积(Hct)水平增减rH-EPO剂量，连续观察12周。患者常规服用速力菲或力蜚能。碳酸氢盐透析，均使用聚砜膜(F6)透析器，膜面积1.3m2，每周透析12～15h。选自我科10名正常成人为“正常对照组”，男4人，女6人，平均年龄42±11.7岁。
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Table 1. Clinical data of patients in the treatment group and the control group
(
±s)n
male/female
average age
(years)
dialysis duration
(month)
average conc of hemaglobin
, 百拇医药
(g/L)
Control group
10
6/4
51.9±8.90
37.7±26.8
104±12
Treatment group
30
17/13
48.8±16.0
37.3±28
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*P<0.05 vs Control group
1.2 检测项目及方法
1.2.1 T-淋巴细胞亚群测定 取全血100 μl，分别加20 μl CD3、CD4、CD8荧光抗体，室温避光10 min，1000 r/min，离心5 min，PBS洗一次，加0.5ml PBS。用流式细胞仪(美国BD公司FAC Sort)测定百分数。
1.2.2 IL-2检测 首先诱生IL-2[2]，取受试患者肝素抗凝静脉血5ml，用淋巴细胞分离液无菌分离单个核细胞，每孔调细胞数1.5×1.66加入96孔板中，每份标本加8孔，其中4孔加植物血凝素(PHA)100μl/孔，4孔作空白对照，37℃，5%CO2饱和湿度，培养48h，收集上清，贮存-20℃待测。采用双抗体夹心法(深圳晶美生物工程有限公司提供酶标试剂盒)，包被用抗人IL-2单克隆抗体，标本和标准品中IL-2与单抗结合，用洗涤液洗去未结合物，再加入生物素化的抗人IL-2，与结合在单抗上的IL-2结合，形成免疫复合物，再洗去多余的抗体，辣根过氧化物酶标记Streptavidin，将多余的酶联物洗掉，加入TMB显兰色，加终止液变黄，在450nm处酶标仪测A值，依据标准曲线，查找浓度(ng/L)。
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1.2.3 sIL-2R测定 分离PBMNC，采用双抗体夹心ELISA法(法国IMMUNOTECH公司试剂盒)。在已包被的96孔板内加入标本、标准品后，再加入100μl sIL-2R酶标抗体(除空白对照孔)，18～25℃孵育120min，每5min振荡一次，用洗涤液洗板3min×3次，加入200μl底物，黑暗处孵育30min，每5min振荡一次，每孔加50μl终止液。于410nm处酶标仪测每孔A值，空白调零。依据标准曲线，查出浓度(pmol/L)。
1.2.4 TNFα测定 分离单核细胞，采用法国MEDGENIX公司试剂盒，上清标本对倍稀释，按试剂盒操作规程操作(单位：ng/L)。
1.2.5 淋巴细胞转化率(刺激指数SI) 淋巴细胞分离同诱生法，用MTT比色法测定PHA诱导的人外周血淋巴细胞转化率[3]。将吸取上清的每孔用1640营养液和PHA补足，继续培养68h，加入MTT 10 μl/孔，再培养4～6h，弃掉上清，加入100 μl/孔酸化SDS，37℃ 1h或4℃过夜，490nm测定A值，计算出刺激指数(SI)。
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1.2.6 群体反应性抗体(PRA) 分离淋巴细胞(L)和单核细胞(M)，取无关健康人静脉血20ml，共37份，2000 r/min离心10min，取富含白细胞层置于分离液上，分别依次加入浓度75%、65%、55%、40%分层液，3600 r/min离心30min，取55%与40%浓度之界面为单核细胞，60%与55%之界面为淋巴细胞。用治疗组患者rH-EPO治疗前和后血清，分别检测针对37份无关健康人单核细胞或淋巴细胞PRA的阳性率，仿照标准微量淋巴细胞毒实验方法[4]。
1.3 统计学处理 使用Microsoft Excel软件包进行统计学分析，各组数据均以均数±标准差表示；两组间均数比较用t检验；百分率均数比较用卡方检验；Hb变化量与淋巴细胞亚群、细胞因子进行单因素相关分析。
2 结 果
2.1 正常人与对照组、治疗前组T-淋巴细胞亚群、细胞因子 见表2。
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Table 2. Pre-treatment T lymphocyte subgroups and cytokines concentrations(
±s)n
CD3(%)
CD4(%)
CD8(%)
CD4/CD8
TNFα(ng/L)
IL-2(ng/L)
sIL-2R(pmol/L)
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Healthy normal
10
69.7±5.25
1.80±0.19
2.53±0.46
1.43±0.44
8683±1436
2009±625
40.7±10.0
Control group
10
65.4±5.49
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1.70±0.24
2.73±0.89
1.77±0.91*
7639±365
1737±49
149±34.3*
Treatment group
30
60.7±7.90
1.60±0.22
3.00±0.84
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1.91±0.84*
7238±1576*
1216±786*
198±89.4**
*P<0.05，**P<0.001 vs Healthy normal and Control group 治疗组rH-EPO治疗前T-淋巴细胞亚群与正常人和对照组有显著性差异(P<0.05)；rH-EPO治疗组治疗前TNFα、IL-2与正常人和对照组有显著性差异(P<0.05)；rH-EPO治疗组治疗前sIL-2R与正常人、对照组均有显著性差异(分别为P<0.001，P<0.05)。
2.2 rH-EPO治疗前、后T-淋巴细胞亚群与细胞因子变化 见表3。rH-EPO治疗前、后CD3、TNFα、IL-2有显著性差异(P<0.05)。
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Table 3.The Pre-treatment and Post-treatment T lymphocyte subgroups and
cytokines concentrations in the treatment group
n
CD3(%)
CD4(%)
CD8(%)
CD4/CD8
TNFα(ng/L)
IL-2(ng/L)
sIL-2R(pmol/L)
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Pre-Treatment
30
60.67±7.90
1.55±0.22
3.00±0.84
1.91±0.84
7237.9±1576
1215.7±785.9
148.7±89.4
Post-Treatment
30
68.35±8.60
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1.69±0.20
2.76±0.50
1.71±0.56
8658.4±2208*
1879.2±875.0*
181.0±122
*P<0.05 vs pre-Treatment
2.3 rH-EPO治疗前、后SI与PRA变化 见表4。
Table 4. The Pre-treatment and Post-treatment T lymphocyte
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stimulation index(SI)and PRA in the treatment group
n
SI(%)
Lymphocyte
PRA(%)
Monocyte
PRA(%)
Pre-Treatment
30
0.91±0.40
35.1
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37.8
Post-Treatment
30
1.58±0.55*
0.80**
10.8**
*P<0.05，**P<0.001 vs Pre-Treatment
rH-EPO治疗前、后SI、PRA有显著性差异(分别为P<0.05，P<0.001)。
2.4 血红蛋白变化 治疗后Hb由64.2±12 g/L上升至109±13 g/L，P<0.05。
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血红蛋白变化量与淋巴细胞亚群、细胞因子的单因素相关分析结果表明，Hb变化量与CD4、CD8呈正相关，相关系数分别为r＝0.6032和0.7053，P<0.05；Hb变化量与TNFα、IL-2呈正相关，相关系数分别为r＝0.6983和0.6475，P<0.05。
3 讨 论
长期透析的终末期肾病患者免疫功能存在缺陷[5]，包括细胞免疫和体液免疫。近年研究证实细胞因子也参与免疫功能的紊乱，其机制尚未完全阐明。本组资料表明，治疗组rH-EPO治疗前与正常成人和对照组T-淋巴细胞亚群有明显差异(P<0.05)，而治疗组rH-EPO治疗前、后(除CD3外)无显著性差异，提示充分透析纠正贫血后异常的淋巴细胞亚群可以部分纠正，与Ueki等[6]报告一致，但作者用rH-EPO治疗6个月后，Hct从21.5±1.7%增加到28.2±3.5%，而CD3、CD4、CD8、CD20、CD4/CD8比值均无变化。作者进一步研究发现，透析患者CD4和CD8细胞亚群CD4+CD45RA+、CD8+S6F1+比健康人明显降低，rH-EPO治疗6个月后，CD4+CD45RA+增加，而CD4+CD29+、CD8+S6F1+无变化。本文正常人TNFα、IL-2高于rH-EPO治疗前(P<0.05)，对照组TNFα、IL-2与rH-EPO治疗前无显著性差异。正常人sIL-2R显著低于对照组(P<0.05)及rH-EPO治疗前(P<0.001)。rH-EPO治疗后TNFα、IL-2水平升高，与rH-EPO治疗前比较均有显著性差异(P<0.05)，而rH-EPO治疗前、后sIL-2R无变化，与Gafter等[7]报道一致。本组还观察了淋巴细胞转化率(刺激指数SI)和群体反应性抗体(PRA)的变化，结果显示，rH-EPO治疗后SI明显升高(P<0.05)，淋巴细胞(L)和单核细胞(M)的PRA有显著减少(P<0.001)。
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本组资料显示，充分透析纠正贫血状态或经rH-EPO治疗贫血改善后患者，均出现免疫功能的改善；有报道提示，体外试验rH-EPO对细胞因子分泌没有影响；有作者体外研究表明，不同rH-EPO浓度时，对T-细胞亚群摄取3H-胸腺嘧啶均无影响，表明rH-EPO诱导的免疫调节是间接刺激免疫系统介导的[5]；Gafter等[7]报道，静脉放血使细胞因子分泌减少，输血后细胞因子分泌增加，并且细胞因子上升程度与Hb浓度升高呈正相关；本文相关分析表明Hb变化量与CD4、CD8、TNFα和IL-2呈正相关，以上事实说明rH-EPO不能直接影响免疫功能，而与rH-EPO治疗后Hb升高，患者全身营养状态改善有关。此外，Ueki等认为，rH-EPO治疗后T-细胞亚群的变化也可能是由于rH-EPO降低了尿毒症患者血清中存在的T-细胞抑制物质，后者可能是一种极低密度脂蛋白。该作者体外试验提示，rH-EPO不能直接引起CD4+CD45RA+、CD4+CD29+、CD8+S6F1+和CD8+S6F1-增生，证实是rH-EPO治疗后透析患者全身状态改善，继而T-细胞亚群的功能恢复。
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Gafter等[7]指出，ESRD患者IL-2水平低于正常人，但用rH-EPO治疗后，其水平与Hb升高呈正相关，随着Hb上升，细胞因子逐渐相应升高。输注RBC也可以促进细胞因子分泌增加。体外研究已证明，RBC可刺激T、B细胞，体内研究表明，RBC刺激单核细胞可以促进细胞因子分泌。RBC可能间接活化单个核细胞，推测单个核细胞对PHA刺激反应增强，是通过把丝裂原结合到RBC上并呈递到反应细胞上达到的。另一种可能是通过RBC直接活化淋巴细胞。人类T-淋巴细胞表面的绵羊红细胞受体(CD2)是存在所有成熟T-细胞上的一种表面糖蛋白，它的天然配体是一种广泛分布于红细胞表面粘附分子的淋巴细胞相关抗原3(LFA-3)。近来研究表明，这种LFA-3抗原在RBC表面表达，与CD2直接结合，相互作用把活化信号传递到人T-淋巴细胞上，促进T-淋巴细胞增生分化，表面IL-2受体表达增加，IL-2、TNF分泌增加。RBC对淋巴细胞的作用，可以被淋巴细胞与抗-CD2抗体预先孵育或RBC与抗LFA-3单克隆抗体预处理所抵消。近来试验证明，同种RBC可以刺激分泌各种细胞因子。当人单核细胞和鼠脾细胞用人或鼠抗CD2抗体分别预处理，会减少细胞因子分泌，表明RBC可以通过RBC上的LFA-3分子和淋巴细胞CD2分子相互作用促进细胞因子分泌。
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本组资料表明，rH-EPO治疗后淋巴细胞刺激指数(SI)明显增加(P<0.05)，与Singh等[8]报道一致。作者认为尿毒症贫血患者淋巴细胞对丝裂原诱导的增殖反应减弱，而rH-EPO治疗后明显改善，表明rH-EPO治疗可以间接增强透析患者的免疫反应。
本治疗组30例患者rH-EPO治疗前8例有输血史，但至少3年患者PRA没有自然阴转，rH-EPO治疗3个月后，对37份无关健康供者淋巴细胞和单核细胞的PRA滴度有显著性下降(P<0.001)。接受输血、妊娠、预防接种和肾移植术后等因素可使受者PRA滴度增高，但很少自然阴转。王质刚等[9]报道，对2例肾移植术后肾失功患者行血浆置换3次，治疗后PRA血清滴度仍无明显变化。Barany等[10]报道，26例透析患者接受rH-EPO治疗，治疗前均有输血史，治疗6～18个月PRA明显下降(从60%降到35%)，作者指出，长期rH-EPO治疗PRA反应下降可能增加移植肾存活率。Grimm等[11]报道，一组年轻CAPD贫血患者抗HLA抗体降低，对PHA刺激增殖反应明显下降，PRA反应低下，作者指出，贫血可能是影响免疫反应的一个因素，停止输血和应用rH-EPO治疗可以使PRA水平下降或消失，表明是由于应用rH-EPO使贫血改善，或由于减少抗原(输血)刺激，PRA自然下降。
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参考文献
1，王质刚.血液透析患者免疫功能紊乱及其机制探讨.国外医学泌尿系统分册，1995，15(增刊)：21
2，曲海政，程佩萱.IL-2在JRA诊断和治疗过程中的临床意义.中国实验临床免疫学杂志，1994，6(4)：29
3，付体辉，谢之荣，邓碧芳等.MTT比色法检测肿瘤患者的淋转功能及其条件分析.中国实验临床免疫学杂志，1994，6(2)：30
4，Terasaki PI，Bernoco D，Park MS et al.Microdroplet testing for HLA-A，-B，-C，and D antigens.The phillip levine award lecture.Am J Clin Pathol，1978，69(2)：103
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5，Latscha BD，Herbelin A.Long-term dialysis and cellular immunity：A critical survey.Kidney Int，1993，43(Suppl 41)：s135
6，Ueki Y，Nagata M，Miyake S et al.Lymphocyte subsets in hemodialysis patients treated with recombinant human erythropoietin.J Clin Immunol，1993，13(4)：279
7，Gafter U，Kalechman Y，Orlin JB et al.Anemia of uremia is associated with reduced in vitro cytokine secretion：Immunopotentiating activity of red blood cells.Kidney Int，1994，45：224
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8，Singh AB，Singh M，Palekar S et al.The effects of recombinant human erythropoietin on the cell mediated immune response of renal failure patients.J Med，1992，23(5)：189
9，王质刚，蒲寐医，马林林.血浆置换的临床应用.中华医学杂志，1990，70(2)：98
10，Barany P，Fehrman I，Godoy C.Long-term effects on lymphocytotoxic antibody and immune reactivity in hemodialysis patients treated with recombinant human erythropoietin.Clin Nephrol，1992，37(2)：90
11，Grimm PC，Trieman LS，Sekiya NM et al.Effects of recombinant human erythropoietin on HLA sensitization and cell mediated immunity.Kidney Int，1990，38：12
收稿1999-11-29
修回1999-12-25, http://www.100md.com