小鼠白细胞介素-18的cDNA克隆及在真核细胞中初步表达的研究
作者：成军 柯亨宁 刘妍 斯崇文 王勤环 洪卫国 钟彦伟
单位：成军(解放军三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京100039)；柯亨宁(北京医科大学第一医院感染疾病科，北京100034)；刘妍(解放军三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京100039)；斯崇文(北京医科大学第一医院感染疾病科，北京100034)；王勤环(北京医科大学第一医院感染疾病科，北京100034)
关键词：白细胞介素-18；逆转录多聚酶链反应；cDNA；基因克隆化；基因表达
中国免疫学杂志000507
摘 要 目的： 克隆小鼠白细胞介素-18(IL-18)编码区的cDNA， 并实现在真核细胞中的表达。方法：用小鼠白细胞介素-18( mIL-18)的cDNA核苷酸序列，设计、合成基因序列特异性引物，应用逆转录多聚酶链反应RT -PCR，以植物血凝(PHA)和细菌脂多糖(LPS)刺激的小鼠非粘附性脾细胞的mRNA为模板，扩 增获得全长mIL-1 8，转染小鼠成纤维细胞系SVT2，并进行IL-18生物学活性的检测。结果：经测序证实获得的 小鼠IL-18的cDNA序列与文献报道的mIL-18的cDNA序列完全一致。构建的小鼠IL-18的重 组表达载体在转染小鼠成纤维细胞SVT2后，获得具有生物学活性mIL-18的分泌表达。结论：克隆了小鼠IL-18的cDNA，并实现了在真核细胞中的表达。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R392.11
cDNA cloning and expression in murine fibrobla st cell line SVT2 of murine interleukin-18
CHENG Jun KE Heng-Ning LIU Yan
(Gene Therapy Research Center , The Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA,Beijing 100039)
Abstract Objective：To clone murine interleukin -18 cDNA and express it by transfe ction of murine fibroblast SVT2. Methods：According to the previously reported nuc leic acid sequence of murine interleukin-18(mIL-18) cDNA, specific primers f or mIL-18 have been designed and synthesized. Using total RNA from nonadherent spl enocytes stimulated with PHA and LPS as the template, mIL-18 cDNA was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). The mIL-18 eukaryo tic expression vector was constructed by subcloning this cDNA fragment into pcDN A3 at EcoRI/XbaI restriction sites, and use the recombinat vector to transfect m urine fibroblast cell line SVT2, secreted mIL-18 level was determined. Results：S equence analysis indicated that this cDNA is 100% homology tothe published mIL- 18 cDNA sepuence, and found biological mIL-18 expressed in the supernatants of the transfected cells.Conclusion： We have cloned murine I L-18 cDNA and exqressed it by murine fibroblast SVT2.
, 百拇医药
Key words Interleukin-18 RT-PCR cDNA Gene cl oning Gene expression
细胞因子网络中的新成员白细胞介素(IL-18，interleukin-18)，又称为 干扰素γ诱导因 子(interferon γ-inducing factor IGIF)是Okamura等在研究丙酸杆菌(Propiontibacter ium acnes,P.acnes)感染引起的小鼠内毒素休克时发现的一种能够诱导IFNγ大量分泌表达的细胞因子[1-3]。初步的研究结果表明，丙酸杆菌感染引起的感染性 休克中，肝脏的枯否氏细胞是表达IL-18的主要细胞类型，而且这种IL-18的基因表达不受 细菌脂多糖刺激的影响[4]。由于近年来认识到IFNγ在免疫调节中，特别是对Th1 细胞发育和机体感染过程中具有十分重要的作用，因此，认为IL-18的研究也具有重要的意 义[5]。我们根据已发表的小鼠IL-18的cDNA序列[6]，设计合成小鼠IL -18基因特异性的引物，以小鼠脾mRNA为模板，应用逆转录多聚酶链反应技术，获得了全长 的小鼠IL-18基因克隆，并实现了在小鼠成纤维细胞中的初步表达。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 小鼠脾细胞的制备与总RNA的提取 取健康6周龄的Balb/c小鼠1只， 无菌条件下取出 脾脏，剪碎，以毛玻璃片研磨，使之成为单细胞悬液，加入2倍体积的不含胎牛血清的RPMI 16 40培养基洗涤1次，离心5 min，小鼠脾组织中的不溶性结缔组织即粘附在试管或吸管壁上。 以含有氯化氨(0.144 mol/L NH4Cl， 0.017 mol/L Tris-HCl)的红细胞裂解液裂解红细 胞15 min。以 不含胎牛血清的细胞培养基RPMI 1640洗涤细胞2次将脾细胞浓度调整为1×106ml-1 ，在5% CO2，37C的条件下培养60min。取非粘附细胞，将细胞浓度调整到5×105ml-1 ，以含有 10 μg/ml PHA 和1 μg/ml LPS 的完全RPMI1640培养基进行培养和刺激12 h。收集细胞， 以异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取细胞总RNA[7，8]。
, 百拇医药
1.2 逆转录多聚酶链反应扩增 有义链引物：5’-ATG G CT ACC ATG TCA GAA GAC TC -3’，反义链引物：5’-CTA ACT TTG ATG TAA GTT AGT G-3’。参照Gibco/BRL 试剂盒 说明书，以总RNA 为模板进行逆转录合成cDNA 的第1条链，以Taq多聚酶进行PCR扩增。扩 增的条件为94C 3 min，(94C 30 s+58C 30 s+70C 30 s)25个循环，70C 10 min，反应体积为100 μl。
1.3 RT-PCR扩增产物 以1.2%的琼脂糖凝胶电泳，收取0.5 kb大小的基 因片段，以HB101公司 的玻璃牛奶(Glassmilk)试剂盒对基因片段进行纯化。将纯化的基因片段克隆到Invitroge n 公司的载体pTOPO中，所有操作均按照试剂盒有关的操作说明书进行。选择阳性克隆，以ABI 公司的自动测序仪对克隆的片段进行双向测序分析。
1.4 mIL-18真核表达载体的构建 重组TOPO载体以限制性内切酶EcoRI、XbaI进行消化，以释出带有合适粘性末端的小鼠IL -18的编码基因片段，以同样的限制性内切酶消化真核表达载体pcDNA3(购自美国Invitroge n公司)，将mIL-18的基因片段定向克隆到相应位点上。所有操作均按照分子克隆手册有关 的方法进行[9]。
, 百拇医药
1.5 mIL-18在小鼠成纤维细胞系SVT2中的表达和活性测定 以8 μg的pc DNA3-mIL-18 质粒DNA，以脂质体(lipofectin)方法，转染小鼠成纤细胞系SVT2，以新霉素的类似物G418 进行筛选，获得G418抗性细胞克隆。转染细胞培养上清中的mIL-18的生物学活性，按照Oka mura等的诱导IFNγ产生能力测定方法进行[6]。
2 结果
2.1 RT-PCR对mIL-18的扩增结果 以经过植物血凝素PHA和细菌脂多糖LPS刺激的小鼠脾细胞来源的总RNA逆转录物为模板，以 有义链和反义链两段引物进行的PCR扩增，获得500bp大小的基因片段，如图1所示。
2.2 mIL-18的核苷酸序列 应用RT-PCR技术，从小鼠脾细胞mRNA扩增获得的mIL-18的基因序列，与文献报道的mIL-1 8的核苷系列完全一致。小鼠
, 百拇医药
图1 小鼠IL-18 cDNA片段的PCR扩增
Fig.1 Murine IL-18 cDNA fragment amplified by PCR
表1 转化细胞培养上清对小鼠脾细胞IFNγ的诱导作 用
Tab.1 Induction of IFNγ from murine splenocytes by supernatant
of transfor meed SVTZ Number of cell colonies
SVT2
2
25
, 百拇医药 56
IFNγ activity (U/ml)
50
302
450
760
IL-18基因的开放读码框架由579个核苷酸组成，编码产物由19 2个氨基酸残基组成。
2.3 mIL-18在小鼠成纤维细胞中的表达 以诱导小鼠脾细胞产生IFNγ的能力，测定转染细胞培养上清中分泌表达mIL-18活性水平 [1]。选择不同的转化细胞克隆(细胞克隆号为2，24，56)以及作为对照的小鼠纤维细 胞系SVT2的上清进行测定，结果如表1所示。
, 百拇医药 3 讨论
白细胞介素-18是一种具有多种免疫生物学功能的细胞因子[1]，除了能够诱 导NK细 胞、T淋巴细胞、肝脏的枯否氏细胞表达IFNγ以外，还能促进T淋巴细胞增殖以 及诱导自然杀伤(NK)细胞的细胞毒活性[6，4]。小鼠IL-18诱导细胞产生IFNγ的 能力 和作用性质与白细胞介素-12(IL-12)的作用机制是不同的[10]，但是在诱导IFN γ的功能方面，两者又有一定的协同作用[11]。近年来，Udagawa等的研究发现 [12]，成骨细胞也具有产生IL-18的能力，并抑制破骨细胞的形成，但是这种生物学 作用，并不是通过对IFNγ的诱生而实现的，其作用机制是通过对粒细胞，巨噬细胞集落 刺激因子(GM-CSF)的诱生而实现的。小鼠IL-18的生物化学特性，在这种蛋白质的纯化过 程中得到充分的验证[1]。例如，小鼠IL-18在以苯基琼脂糖凝胶(phenyl-sephar ose CL-6B)疏水柱层折，在高离子浓度条件下大部分mIL-18蛋白可以顺利地洗脱下来，说 明小鼠的IL-18的蛋白质并不是疏水性很强的蛋白质。以DEAE-琼脂糖凝胶柱层析时，也可 以得到大部分的IL-18的蛋白质。应用等电聚焦柱层析的研究结果证实小鼠IL-18的等电点 (pI)为4.9。通过Superdex 75的分子筛凝胶过滤，证实小鼠IL-18的分子量是1819 kDa。 但 是以蛋白C4进行反向柱层析时，小鼠的IL-18蛋白大部分失活，说明小鼠的IL-18这种蛋白 质不适合应用蛋白C4反向柱层析这种纯化方法。
, 百拇医药
本文根据文献已经发表的小鼠IL-18的cDNA基因序列，设计基因特异性的核苷酸引物，以从 植物血凝素(PHA)和细菌多糖(LPS)进行刺激以后的非粘附脾细胞提取的总RNA为材料，进行 逆转录多聚酶链反应扩增，获得小鼠IL-18的全长编码基因。序列测定结果表明，本文克隆 的小鼠IL-18基因序列与文献报导的小鼠IL-18基因序列完全一致[6]。构建了小 鼠IL-18基因表达载体，转染小鼠的成纤维细胞系SVT2，经过G418的抗性选择，获得稳定表 达小鼠IL-18的转化细胞克隆。其分泌的小鼠IL-18能够诱导小鼠脾细胞的IFNγ的表达， 证实是具有生物学活性的小鼠IL-18的表达。小鼠IL-18表达的成功，为研究小鼠IL-18的 生物学功能提供了一定的条件。因为小鼠IL-18是一种强有力的IFNγ和GM-CSF的诱导剂， 而且其诱导IFNγ产生的能力比白细胞介素-12(IL-12)还要强得多，因此考虑小鼠IL-18 可能通过对INFγ和GM-CSF的诱导作用，促进主要组织相容性复合体-I(MHC-I)蛋白的表 达， 因而有可能成为DNA疫苗研究的一种重要的免疫佐剂。关于小鼠IL-18的真核细胞表达载体 质粒DNA对乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原与丙型肝炎病毒(HCV)核心和非结构蛋白3(NS3)DNA疫 苗表达载体免疫效果的促进作用，目前正在研究之中。
, 百拇医药
作者简介：成军，博士，男，35岁，副主任医师，副教授、硕士生导师，主要从 事传染病相关基因的克隆化，基因治疗与基因疫苗的研究
洪卫国(解放军三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京100039)
钟彦伟(解放军三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京100039)
4 参考文献
1，Okamura H, Nagata K, Komatsu T et al. A novel costimulatory fact or for gam ma interferon induction found in the livers of mice causes endotoxic s hock.Infect Immun,1995；63(10)：3966
, 百拇医药 2，Okamura H, Kawaguchi M, Shoji K et al.High-level induction of gamma int e rferon with various mitogens in mice pretreated with propionibactderia acnes. In fect Immun,1982；38：440
3，Wada M, Okamura H, Nagata K et al. Cellular mechanisms in vivo production of gamma interferon inducecd by lipopolysacchride in mice infected with Mycobact erium bovis BCG.J Interferon Res, 1985；5：431
4，Ushio S, Namba M, Okura T et al. Cloning of the cDNA for human IFN γ-i n ducing factor, expresion in Escherichia coli,and studies on the biologic activit ies of the protein.J Immunl, 1996；156：4274
, 百拇医药
5，Mosmann T R,Coffman R L. Th1 and Th2 cells:different patterns of lymphokin e secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol, 1989；7：14 5
6，Okamura H, Tsutsui H, Komatsu T et al. Cloning of a new cytokine that in duces IFN γ production by T cells. Nature, 1995；378：88
7，Southby J, Murphy L M,Martin T J et al. Cell-specific and regulator-ind uc ed promoter usage and messenger ribonucleic acid splicing for parathyroid hormon e-related protein. Endocrinology, 1996；137；1349
, 百拇医药
8，Traianedes K, Findlay D M, Martin T J et al. Modulation of the signal r ecog nition particle 54-kDa subunit(SRP54)in rat preosteoblasts by the extrcellular matrix. J Biol Chem,1995；270：20891
9，Sambrrok J, Fritsch E F,Maniatis T. Molecular Cloning.A laboratory Mannua l, 2nd ed. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989：293
10，Kohno K, Kataoka J, Ohtsuki T et al. IFN-γ-inducing factor(IGIF) is a costimulatory facor on the activation of Th1 but not Th2 cells and exert its ef fect independently of IL-12. J Immunl, 1997；158：1543.
, 百拇医药
11，Micallef MJ, Ohtsuki T, Kohno K et al. IFN-γ-inducin factor enhance s T helper 1 cytokine production. Eur J Immunol, 1996；26：1647.
12，Udagawa N, Horwood NJ, Elliott J et al. Interleukin-18(interferon γ i nd ucing factor) is produced by osteoblast and acts via granulocyte/macrophage colo ny-stimulating factor and not via interferon-γ to inhibit osteoclast formatio n. J Exp Med,1997；185：1005.
[收稿1998-04-29 修回1999-11-01], http://www.100md.com
单位：成军(解放军三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京100039)；柯亨宁(北京医科大学第一医院感染疾病科，北京100034)；刘妍(解放军三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京100039)；斯崇文(北京医科大学第一医院感染疾病科，北京100034)；王勤环(北京医科大学第一医院感染疾病科，北京100034)
关键词：白细胞介素-18；逆转录多聚酶链反应；cDNA；基因克隆化；基因表达
中国免疫学杂志000507
摘 要 目的： 克隆小鼠白细胞介素-18(IL-18)编码区的cDNA， 并实现在真核细胞中的表达。方法：用小鼠白细胞介素-18( mIL-18)的cDNA核苷酸序列，设计、合成基因序列特异性引物，应用逆转录多聚酶链反应RT -PCR，以植物血凝(PHA)和细菌脂多糖(LPS)刺激的小鼠非粘附性脾细胞的mRNA为模板，扩 增获得全长mIL-1 8，转染小鼠成纤维细胞系SVT2，并进行IL-18生物学活性的检测。结果：经测序证实获得的 小鼠IL-18的cDNA序列与文献报道的mIL-18的cDNA序列完全一致。构建的小鼠IL-18的重 组表达载体在转染小鼠成纤维细胞SVT2后，获得具有生物学活性mIL-18的分泌表达。结论：克隆了小鼠IL-18的cDNA，并实现了在真核细胞中的表达。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R392.11
cDNA cloning and expression in murine fibrobla st cell line SVT2 of murine interleukin-18
CHENG Jun KE Heng-Ning LIU Yan
(Gene Therapy Research Center , The Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA,Beijing 100039)
Abstract Objective：To clone murine interleukin -18 cDNA and express it by transfe ction of murine fibroblast SVT2. Methods：According to the previously reported nuc leic acid sequence of murine interleukin-18(mIL-18) cDNA, specific primers f or mIL-18 have been designed and synthesized. Using total RNA from nonadherent spl enocytes stimulated with PHA and LPS as the template, mIL-18 cDNA was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). The mIL-18 eukaryo tic expression vector was constructed by subcloning this cDNA fragment into pcDN A3 at EcoRI/XbaI restriction sites, and use the recombinat vector to transfect m urine fibroblast cell line SVT2, secreted mIL-18 level was determined. Results：S equence analysis indicated that this cDNA is 100% homology tothe published mIL- 18 cDNA sepuence, and found biological mIL-18 expressed in the supernatants of the transfected cells.Conclusion： We have cloned murine I L-18 cDNA and exqressed it by murine fibroblast SVT2.
, 百拇医药
Key words Interleukin-18 RT-PCR cDNA Gene cl oning Gene expression
细胞因子网络中的新成员白细胞介素(IL-18，interleukin-18)，又称为 干扰素γ诱导因 子(interferon γ-inducing factor IGIF)是Okamura等在研究丙酸杆菌(Propiontibacter ium acnes,P.acnes)感染引起的小鼠内毒素休克时发现的一种能够诱导IFNγ大量分泌表达的细胞因子[1-3]。初步的研究结果表明，丙酸杆菌感染引起的感染性 休克中，肝脏的枯否氏细胞是表达IL-18的主要细胞类型，而且这种IL-18的基因表达不受 细菌脂多糖刺激的影响[4]。由于近年来认识到IFNγ在免疫调节中，特别是对Th1 细胞发育和机体感染过程中具有十分重要的作用，因此，认为IL-18的研究也具有重要的意 义[5]。我们根据已发表的小鼠IL-18的cDNA序列[6]，设计合成小鼠IL -18基因特异性的引物，以小鼠脾mRNA为模板，应用逆转录多聚酶链反应技术，获得了全长 的小鼠IL-18基因克隆，并实现了在小鼠成纤维细胞中的初步表达。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 小鼠脾细胞的制备与总RNA的提取 取健康6周龄的Balb/c小鼠1只， 无菌条件下取出 脾脏，剪碎，以毛玻璃片研磨，使之成为单细胞悬液，加入2倍体积的不含胎牛血清的RPMI 16 40培养基洗涤1次，离心5 min，小鼠脾组织中的不溶性结缔组织即粘附在试管或吸管壁上。 以含有氯化氨(0.144 mol/L NH4Cl， 0.017 mol/L Tris-HCl)的红细胞裂解液裂解红细 胞15 min。以 不含胎牛血清的细胞培养基RPMI 1640洗涤细胞2次将脾细胞浓度调整为1×106ml-1 ，在5% CO2，37C的条件下培养60min。取非粘附细胞，将细胞浓度调整到5×105ml-1 ，以含有 10 μg/ml PHA 和1 μg/ml LPS 的完全RPMI1640培养基进行培养和刺激12 h。收集细胞， 以异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取细胞总RNA[7，8]。
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1.2 逆转录多聚酶链反应扩增 有义链引物：5’-ATG G CT ACC ATG TCA GAA GAC TC -3’，反义链引物：5’-CTA ACT TTG ATG TAA GTT AGT G-3’。参照Gibco/BRL 试剂盒 说明书，以总RNA 为模板进行逆转录合成cDNA 的第1条链，以Taq多聚酶进行PCR扩增。扩 增的条件为94C 3 min，(94C 30 s+58C 30 s+70C 30 s)25个循环，70C 10 min，反应体积为100 μl。
1.3 RT-PCR扩增产物 以1.2%的琼脂糖凝胶电泳，收取0.5 kb大小的基 因片段，以HB101公司 的玻璃牛奶(Glassmilk)试剂盒对基因片段进行纯化。将纯化的基因片段克隆到Invitroge n 公司的载体pTOPO中，所有操作均按照试剂盒有关的操作说明书进行。选择阳性克隆，以ABI 公司的自动测序仪对克隆的片段进行双向测序分析。
1.4 mIL-18真核表达载体的构建 重组TOPO载体以限制性内切酶EcoRI、XbaI进行消化，以释出带有合适粘性末端的小鼠IL -18的编码基因片段，以同样的限制性内切酶消化真核表达载体pcDNA3(购自美国Invitroge n公司)，将mIL-18的基因片段定向克隆到相应位点上。所有操作均按照分子克隆手册有关 的方法进行[9]。
, 百拇医药
1.5 mIL-18在小鼠成纤维细胞系SVT2中的表达和活性测定 以8 μg的pc DNA3-mIL-18 质粒DNA，以脂质体(lipofectin)方法，转染小鼠成纤细胞系SVT2，以新霉素的类似物G418 进行筛选，获得G418抗性细胞克隆。转染细胞培养上清中的mIL-18的生物学活性，按照Oka mura等的诱导IFNγ产生能力测定方法进行[6]。
2 结果
2.1 RT-PCR对mIL-18的扩增结果 以经过植物血凝素PHA和细菌脂多糖LPS刺激的小鼠脾细胞来源的总RNA逆转录物为模板，以 有义链和反义链两段引物进行的PCR扩增，获得500bp大小的基因片段，如图1所示。
2.2 mIL-18的核苷酸序列 应用RT-PCR技术，从小鼠脾细胞mRNA扩增获得的mIL-18的基因序列，与文献报道的mIL-1 8的核苷系列完全一致。小鼠
, 百拇医药
图1 小鼠IL-18 cDNA片段的PCR扩增
Fig.1 Murine IL-18 cDNA fragment amplified by PCR
表1 转化细胞培养上清对小鼠脾细胞IFNγ的诱导作 用
Tab.1 Induction of IFNγ from murine splenocytes by supernatant
of transfor meed SVTZ Number of cell colonies
SVT2
2
25
, 百拇医药 56
IFNγ activity (U/ml)
50
302
450
760
IL-18基因的开放读码框架由579个核苷酸组成，编码产物由19 2个氨基酸残基组成。
2.3 mIL-18在小鼠成纤维细胞中的表达 以诱导小鼠脾细胞产生IFNγ的能力，测定转染细胞培养上清中分泌表达mIL-18活性水平 [1]。选择不同的转化细胞克隆(细胞克隆号为2，24，56)以及作为对照的小鼠纤维细 胞系SVT2的上清进行测定，结果如表1所示。
, 百拇医药 3 讨论
白细胞介素-18是一种具有多种免疫生物学功能的细胞因子[1]，除了能够诱 导NK细 胞、T淋巴细胞、肝脏的枯否氏细胞表达IFNγ以外，还能促进T淋巴细胞增殖以 及诱导自然杀伤(NK)细胞的细胞毒活性[6，4]。小鼠IL-18诱导细胞产生IFNγ的 能力 和作用性质与白细胞介素-12(IL-12)的作用机制是不同的[10]，但是在诱导IFN γ的功能方面，两者又有一定的协同作用[11]。近年来，Udagawa等的研究发现 [12]，成骨细胞也具有产生IL-18的能力，并抑制破骨细胞的形成，但是这种生物学 作用，并不是通过对IFNγ的诱生而实现的，其作用机制是通过对粒细胞，巨噬细胞集落 刺激因子(GM-CSF)的诱生而实现的。小鼠IL-18的生物化学特性，在这种蛋白质的纯化过 程中得到充分的验证[1]。例如，小鼠IL-18在以苯基琼脂糖凝胶(phenyl-sephar ose CL-6B)疏水柱层折，在高离子浓度条件下大部分mIL-18蛋白可以顺利地洗脱下来，说 明小鼠的IL-18的蛋白质并不是疏水性很强的蛋白质。以DEAE-琼脂糖凝胶柱层析时，也可 以得到大部分的IL-18的蛋白质。应用等电聚焦柱层析的研究结果证实小鼠IL-18的等电点 (pI)为4.9。通过Superdex 75的分子筛凝胶过滤，证实小鼠IL-18的分子量是1819 kDa。 但 是以蛋白C4进行反向柱层析时，小鼠的IL-18蛋白大部分失活，说明小鼠的IL-18这种蛋白 质不适合应用蛋白C4反向柱层析这种纯化方法。
, 百拇医药
本文根据文献已经发表的小鼠IL-18的cDNA基因序列，设计基因特异性的核苷酸引物，以从 植物血凝素(PHA)和细菌多糖(LPS)进行刺激以后的非粘附脾细胞提取的总RNA为材料，进行 逆转录多聚酶链反应扩增，获得小鼠IL-18的全长编码基因。序列测定结果表明，本文克隆 的小鼠IL-18基因序列与文献报导的小鼠IL-18基因序列完全一致[6]。构建了小 鼠IL-18基因表达载体，转染小鼠的成纤维细胞系SVT2，经过G418的抗性选择，获得稳定表 达小鼠IL-18的转化细胞克隆。其分泌的小鼠IL-18能够诱导小鼠脾细胞的IFNγ的表达， 证实是具有生物学活性的小鼠IL-18的表达。小鼠IL-18表达的成功，为研究小鼠IL-18的 生物学功能提供了一定的条件。因为小鼠IL-18是一种强有力的IFNγ和GM-CSF的诱导剂， 而且其诱导IFNγ产生的能力比白细胞介素-12(IL-12)还要强得多，因此考虑小鼠IL-18 可能通过对INFγ和GM-CSF的诱导作用，促进主要组织相容性复合体-I(MHC-I)蛋白的表 达， 因而有可能成为DNA疫苗研究的一种重要的免疫佐剂。关于小鼠IL-18的真核细胞表达载体 质粒DNA对乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原与丙型肝炎病毒(HCV)核心和非结构蛋白3(NS3)DNA疫 苗表达载体免疫效果的促进作用，目前正在研究之中。
, 百拇医药
作者简介：成军，博士，男，35岁，副主任医师，副教授、硕士生导师，主要从 事传染病相关基因的克隆化，基因治疗与基因疫苗的研究
洪卫国(解放军三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京100039)
钟彦伟(解放军三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京100039)
4 参考文献
1，Okamura H, Nagata K, Komatsu T et al. A novel costimulatory fact or for gam ma interferon induction found in the livers of mice causes endotoxic s hock.Infect Immun,1995；63(10)：3966
, 百拇医药 2，Okamura H, Kawaguchi M, Shoji K et al.High-level induction of gamma int e rferon with various mitogens in mice pretreated with propionibactderia acnes. In fect Immun,1982；38：440
3，Wada M, Okamura H, Nagata K et al. Cellular mechanisms in vivo production of gamma interferon inducecd by lipopolysacchride in mice infected with Mycobact erium bovis BCG.J Interferon Res, 1985；5：431
4，Ushio S, Namba M, Okura T et al. Cloning of the cDNA for human IFN γ-i n ducing factor, expresion in Escherichia coli,and studies on the biologic activit ies of the protein.J Immunl, 1996；156：4274
, 百拇医药
5，Mosmann T R,Coffman R L. Th1 and Th2 cells:different patterns of lymphokin e secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol, 1989；7：14 5
6，Okamura H, Tsutsui H, Komatsu T et al. Cloning of a new cytokine that in duces IFN γ production by T cells. Nature, 1995；378：88
7，Southby J, Murphy L M,Martin T J et al. Cell-specific and regulator-ind uc ed promoter usage and messenger ribonucleic acid splicing for parathyroid hormon e-related protein. Endocrinology, 1996；137；1349
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[收稿1998-04-29 修回1999-11-01], http://www.100md.com