慢性丙型肝炎血清IL-2、TNF及丙肝病毒基因型与干扰素疗效的关系*
作者：王平 田德英 张东绅 宋佩辉
单位：同济医科大学附属同济医院传染科，武汉 430030
关键词：慢性丙型肝炎；干扰素；丙肝病毒基因型；IL-2；TNF
同济医科大学学报000228 摘要：应用放射免疫法及HCV-RNA NS5酶切分型法 检测48例慢性丙型肝炎患者血清中IL-2、TNF及 HCV基因型，并以20例健康人为正常对照。 结果显示：HCV基因型 Ⅱ型的慢性丙型肝炎干扰素疗效(显效率 23%)差于 Ⅲ型(显效率8 0%)(P<0.05)；慢性丙型肝炎患者干扰素治疗无效组IL-2水平[(2.53±0.57) n g/m l]低于显效组[(3.68±0.84) ng/ml](P<0.05) ；慢性丙型肝炎患者干扰素治 疗显 效组TNF水平[(3.15±0.77) ng/ml]与无效组[(3.47±1.10) ng/ml]相仿 (P >0.05)。提示：HCV基因型及IL-2可能影响干扰素的疗效；TNF不影响干扰素的疗效。
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中图法分类号：R575.1， R977.6， R392.12， R730.3
The Response to IFN Therapy in CHC Pat ients Varies with Their HCV Genotype and Pretreatment Serum IL-2 and TNF Levels
Wang Ping，Tian Deying，Zhang Dongshen et al
Department of Infectious Diseases, Tongji Hospital, To ngji Medical University, Wuhan 430030
Abstract：The pretreatment serum IL-2 and TNF levels were detec ted by using r adioimmunoassay and HCV genotypes analyzed by digesting HCV RNA NS5 region with restriction enzyme in 48 patients with chronic hepatitis C and 20 healthy subjec ts as control group. After 6-month IFN therapy, a sustained response was obser ved in 23 % patients with genotype Ⅱ and 80 % patients with genotype Ⅲ (P< 0.05). The levels of pretreatment serum IL-2 in the patients with sustained re sponse was significantly higher than those in the patients without sustained res ponse (3.68±0.84 ng/ml vs 2.53±0.07 ng/ml, P<0.05). Mean pretreatment ser um TNF levels were 3.15±0.77 ng /ml and 3.47±1.10 ng/ml in the patients w ith sustained response and without sustained response, respectively (P>0.05 ). No difference in TNF level was found between sustained response group and non sustained response group. The results suggest that pretreatment serum IL-2 lev els and HCV genotype might affect the outcome of IFN therapy, but the pretreatme nt serum TNF levels dit not influence the response to IFN therapy.
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Key words：chronic hepatitis C； interferon； hepatitis C viru s genotype； interleukin-2； tumor necrosis factor
文献报道[1～3,6]丙肝病毒基因型、病毒量、干扰素抗体等多种因素可以影响干扰 素的疗效。本试验应用放射免疫法及HCV-RNA NS5酶切分型法检测48例慢性丙型肝炎患 者 血清IL-2、TNF及 HCV基因型，20例正常人作对照，探讨血清 IL-2、TNF及HCV基因型对干 扰素疗效的影响。
1 材料与方法
1.1 病例选择
48例慢性丙型肝炎患者为同济医院1996年 2月至1998年3月肝病门诊及传染科住院病人，诊 断符合1995年北京第五届全国传染病会议标准。其中男31例，女17例，年龄21～65岁， 平均年龄38.2岁，所有病例HCV-RNA阳性，抗-HCV阳性，ALT为正常值2倍以上。治疗方案 ：α-干扰素，300万单位肌注，隔日一次，共6个月，治疗结束后随访6个月，观察HCV-R NA及ALT的变化情况。疗效判断标准：① 显效：HCV-RNA持续阴转，ALT恢复正常。② 无效 ：HCV-RNA持续阳性或转阴后又转阳;ALT未恢复正常或波动。
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1.2 标本制备
于治疗开始前取48例慢性丙型肝炎患者外周静脉血7 ml，离心分离血清储存于-70℃备用。
1.3 主要试剂
过筛实验用限制性内切酶：Alu I。确证实验用限制性内切酶：Bal I [供1a(I)确证 实验用]、Mbo I[供2b(IV)确证实验用]、Cfr10 I [供1b(Ⅱ)确证实验用]、Stu I [供1b(Ⅱ)与1b(Ⅱ)混合感染确证实验用]、Apa I [供2a (Ⅲ)确证实验用]。HC V-RNA NS5酶切分型试剂盒由北京医科大学肝病研究所提供。TNF及IL-2试剂盒 (放射免 疫法)均由东亚免疫技术研究所提供。
1.4 实验方法
1.4.1丙型肝炎病毒基因分型：① HCV-RNA NS5的 PCR程序： 具体方法参照试剂 盒说明书。② HCV-RNA NS5 PCR产物的酶切分型：先进行过筛试验，后做确证试验，根 据酶切产物分子量的大小判断基因型。酶切方法：取酶切10×缓冲液2 μl，加灭菌注射用 水16 μl，加内切酶1～4单位/人，加PCR产物2 μl混匀后，置37 ℃ 1 h，聚丙烯酰胺凝胶 电泳检测酶切产物。过筛试验以检测1b(Ⅱ)型为主，经 Al u I 酶切证实具有209、 114 、50、8bp cDNA带的样品可判断为1b(Ⅱ)，不必再进行确证试验。确证实验分别采用限制 性内切酶Bal Ⅰ、Mbo Ⅰ、Cfr10 Ⅰ、Apa Ⅰ及 Stu Ⅰ分别检测1a(Ⅰ)、2b(Ⅳ)、1b(Ⅱ )、2a(Ⅲ)及1b(Ⅱ)与1b(Ⅱ)混合感染。
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1.4.2 血清IL-2的检测(放射免疫法)：具体方法参照试剂盒说明书。
1.4.3 血清肿瘤坏死因子的检测 (放射免疫法)：具体方法参照试剂盒说明书。
1.5 统计学处理
采用F检验、q检验及卡方检验进行差异显著性检验。
2 结果
2.1 慢性丙型肝炎HCV基因型的检测结果
试验中HCV-RNA NS5的PCR产物为381 bp的cDNA，经Alu I酶切后产生209、114、50、8bp 的 cDNA片段为Ⅱ型。当PCR产物经Alu I酶切后为381 bp的cDNA，经Mbo I酶切后为266、115 bp的cDNA时，则为IV型。当PCR产物经Alu I 及Mbo I酶切后均为381 bp的cDNA时，则为Ⅲ 型。本试验共检测48例慢性丙型肝炎患者HCV基因型，其中 43/48例 (89.59%)HCV为 Ⅱ型，5/48例 (10.41%)HCV为Ⅲ型，未测得其他基因型，说明本地区HCV以Ⅱ型为主。48 例接受干扰素治疗的患者，14 例 (29%)显效，34例(71%)无效。HCV基因型Ⅱ型的慢性丙型 肝炎10/43例(23%)显效，33/43例 (77%)无效；HCV基因型Ⅲ型的慢性丙型肝炎4/5例 (80%) 显效，1 /5例(20%)无效。 HCV基因Ⅲ型的慢性丙型肝炎与Ⅱ型比较，干扰素疗效存在显著 差异(P<0.05)，HCV基因Ⅲ型慢性丙型肝炎干扰素的疗效优于 Ⅱ型。
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2.2 慢性丙型肝炎血清IL-2及TNF的检测结果
本试验共检测48例慢性丙型肝炎患者的血清IL-2及 TNF浓度，按疗效分组，其中显效14例 ，无效 34例 ，以 20例正常人作对照，无效组IL-2 [(2.53±0.57) ng/ml]与正常 对照组[(3.72±0.95) ng/ml]及显效组[(3.68±0.84) ng/ml]比较，两者均有 显著差异(P<0.05)，无效组的IL-2水平明显低于其他两组。显效组 IL-2与正常对照 组比较，两组水平无显著性差异 (P>0.05)。显效组TNF [(3.15±0.77) ng/ml] 及无效组TNF[(3.47±1.10) ng/ml]与正常对照组[(1.56±0.47) ng/ml]比较， 存在显著性差异(P<0.05)，慢性丙型肝炎患者的TNF水平较健康人为高，显效组TNF与 无效组比较，两者无显著性差异(P>0.05)。
2.3 HCV基因型与慢性丙型肝炎血清IL-2的关系
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本试验对检测的48例慢性丙型肝炎患者的血清IL - 2浓度 ，按基因型分组 ，其中HCV基因 型Ⅱ型组(43/48例)IL-2为[(2.85±0.88) ng/ml]，Ⅲ型组(5/48例)为[(2.98±0 .36) ng/ml]，两组比较无显著性差异(P>0.05)，两组IL-2水平相仿。
3 讨论
3.1 丙肝病毒基因型对丙型肝炎α-INF疗效的影响
HCV为单股正链RNA病毒，基因结构与黄病毒相似，并具有高度的异源型和显著的变异型，HC V为适应环境和逃避宿主免疫监控作用而发生突变，所以在长期的适应演化过程中，HCV逐渐 形成了众多的突变毒株，即基因型。近来多数学者认为HCV基因型是影响干扰素疗效的重要 原因之一。Chemello[4]等研究证明 HCVⅠ、Ⅱ、Ⅲ的长期应答率分别为29%、 52% 、74%，表明Ⅲ型应答率较高，Ⅰ型则偏低; 国内陆志檬等[5]研究发现，Ⅰ、Ⅲ 型较Ⅱ型病毒易于清除。本文研究显示，武汉地区丙肝病毒基因型以Ⅱ型为主；HCV基因Ⅲ 型慢性丙型肝炎干扰素的疗效优于Ⅱ型，结果与文献报道一致。HCV基因型可以影响慢性丙 型肝炎α-INF疗效，原因目前尚不清楚，有待进一步的研究去阐明，但HCV基因型可以作为 预测α-INF疗效的重要指标。
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3.2 IL-2对丙型肝炎的影响
IL- 2与干扰素疗效的关系目前研究较少。本文研究表明，慢性丙型肝炎患者血清IL-2水 平，无效组低于其他两组(P<0.05)，结果与文献报道[6]一致，这说明 IL-2 可以影响慢性丙型肝炎干扰素的疗效。本文研究还显示，HCV基因型Ⅱ型组与 Ⅲ型组 IL-2 水平相仿，说明 HCV基因型与慢性丙型肝炎血清 IL-2水平无相关性，HCV基因型并非通过 IL-2影响慢性丙型肝炎α-INF疗效。目前国内外尚无这方面报道。
3.3 TNF对丙型肝炎的影响
TNF在丙型肝炎中的作用及与干扰素疗效的关系，目前尚不十分清楚。本文研究显 示，慢性丙型肝炎患者TNF水平较正常健康人明显为高(P<0.05)，与文献报道[6 ] 一致。本文研究还显示，显效组与无效组之间TNF水平无显著性差异(P>0.05)，与文 献报道[6]一致，提示TNF不影响慢性丙型肝炎干扰素的疗效。
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国家教委资助项目[教外司(1995)806号]，卫生部资助项目[卫科交管(95)第163号]
王平，男，1970年生，医学硕士。现址：武汉市中西医结合医院，武汉 430030
参考文献
1，Michele M P, Patrick M, Michele P et al. Pretreatment serum C vi rus RNA levels and hepatitis C virus Genotype are the main and independent progn ostic factors of sustained response to interferon alfa therapy in chronic hepati tis C. Hepatology,1995, 22:1050
2，Antonelli G, Currenti M, Turriziani O et al. Relative frequency of nonneutralizing antibodies to interferon(IFN) in hepatitis treated with diffe rent IFN-a preparations. The Journal of Infectious Diseases,1992, 165:593
, 百拇医药
3，Giorgio Saracco, Mario Rizzetto.Predictors of response to interfe ron therapy. Digestive Diseases and Science ,1996,41:115s
4，Chemello L. Hepatitis C serotype and response to interferon therapy . N Engl J Med, 1994, 330:143
5，陆志檬,张东华,童葵塘等. HCV基因型及病毒量与干扰素疗效的关系.中华传 染病杂志,1995,13(2):65
6，Juan A Q, Julio M, Margarita P et al. Serum leve ls of soluble immune factors and pathogensis of chronic hepatitis c, and their relation to therapeutic respones to interferon-a. Digestive Diseases and Scienc e, 1994, 39: 2485
(收稿：1998-12-03), http://www.100md.com
单位：同济医科大学附属同济医院传染科，武汉 430030
关键词：慢性丙型肝炎；干扰素；丙肝病毒基因型；IL-2；TNF
同济医科大学学报000228 摘要：应用放射免疫法及HCV-RNA NS5酶切分型法 检测48例慢性丙型肝炎患者血清中IL-2、TNF及 HCV基因型，并以20例健康人为正常对照。 结果显示：HCV基因型 Ⅱ型的慢性丙型肝炎干扰素疗效(显效率 23%)差于 Ⅲ型(显效率8 0%)(P<0.05)；慢性丙型肝炎患者干扰素治疗无效组IL-2水平[(2.53±0.57) n g/m l]低于显效组[(3.68±0.84) ng/ml](P<0.05) ；慢性丙型肝炎患者干扰素治 疗显 效组TNF水平[(3.15±0.77) ng/ml]与无效组[(3.47±1.10) ng/ml]相仿 (P >0.05)。提示：HCV基因型及IL-2可能影响干扰素的疗效；TNF不影响干扰素的疗效。
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中图法分类号：R575.1， R977.6， R392.12， R730.3
The Response to IFN Therapy in CHC Pat ients Varies with Their HCV Genotype and Pretreatment Serum IL-2 and TNF Levels
Wang Ping，Tian Deying，Zhang Dongshen et al
Department of Infectious Diseases, Tongji Hospital, To ngji Medical University, Wuhan 430030
Abstract：The pretreatment serum IL-2 and TNF levels were detec ted by using r adioimmunoassay and HCV genotypes analyzed by digesting HCV RNA NS5 region with restriction enzyme in 48 patients with chronic hepatitis C and 20 healthy subjec ts as control group. After 6-month IFN therapy, a sustained response was obser ved in 23 % patients with genotype Ⅱ and 80 % patients with genotype Ⅲ (P< 0.05). The levels of pretreatment serum IL-2 in the patients with sustained re sponse was significantly higher than those in the patients without sustained res ponse (3.68±0.84 ng/ml vs 2.53±0.07 ng/ml, P<0.05). Mean pretreatment ser um TNF levels were 3.15±0.77 ng /ml and 3.47±1.10 ng/ml in the patients w ith sustained response and without sustained response, respectively (P>0.05 ). No difference in TNF level was found between sustained response group and non sustained response group. The results suggest that pretreatment serum IL-2 lev els and HCV genotype might affect the outcome of IFN therapy, but the pretreatme nt serum TNF levels dit not influence the response to IFN therapy.
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Key words：chronic hepatitis C； interferon； hepatitis C viru s genotype； interleukin-2； tumor necrosis factor
文献报道[1～3,6]丙肝病毒基因型、病毒量、干扰素抗体等多种因素可以影响干扰 素的疗效。本试验应用放射免疫法及HCV-RNA NS5酶切分型法检测48例慢性丙型肝炎患 者 血清IL-2、TNF及 HCV基因型，20例正常人作对照，探讨血清 IL-2、TNF及HCV基因型对干 扰素疗效的影响。
1 材料与方法
1.1 病例选择
48例慢性丙型肝炎患者为同济医院1996年 2月至1998年3月肝病门诊及传染科住院病人，诊 断符合1995年北京第五届全国传染病会议标准。其中男31例，女17例，年龄21～65岁， 平均年龄38.2岁，所有病例HCV-RNA阳性，抗-HCV阳性，ALT为正常值2倍以上。治疗方案 ：α-干扰素，300万单位肌注，隔日一次，共6个月，治疗结束后随访6个月，观察HCV-R NA及ALT的变化情况。疗效判断标准：① 显效：HCV-RNA持续阴转，ALT恢复正常。② 无效 ：HCV-RNA持续阳性或转阴后又转阳;ALT未恢复正常或波动。
, 百拇医药
1.2 标本制备
于治疗开始前取48例慢性丙型肝炎患者外周静脉血7 ml，离心分离血清储存于-70℃备用。
1.3 主要试剂
过筛实验用限制性内切酶：Alu I。确证实验用限制性内切酶：Bal I [供1a(I)确证 实验用]、Mbo I[供2b(IV)确证实验用]、Cfr10 I [供1b(Ⅱ)确证实验用]、Stu I [供1b(Ⅱ)与1b(Ⅱ)混合感染确证实验用]、Apa I [供2a (Ⅲ)确证实验用]。HC V-RNA NS5酶切分型试剂盒由北京医科大学肝病研究所提供。TNF及IL-2试剂盒 (放射免 疫法)均由东亚免疫技术研究所提供。
1.4 实验方法
1.4.1丙型肝炎病毒基因分型：① HCV-RNA NS5的 PCR程序： 具体方法参照试剂 盒说明书。② HCV-RNA NS5 PCR产物的酶切分型：先进行过筛试验，后做确证试验，根 据酶切产物分子量的大小判断基因型。酶切方法：取酶切10×缓冲液2 μl，加灭菌注射用 水16 μl，加内切酶1～4单位/人，加PCR产物2 μl混匀后，置37 ℃ 1 h，聚丙烯酰胺凝胶 电泳检测酶切产物。过筛试验以检测1b(Ⅱ)型为主，经 Al u I 酶切证实具有209、 114 、50、8bp cDNA带的样品可判断为1b(Ⅱ)，不必再进行确证试验。确证实验分别采用限制 性内切酶Bal Ⅰ、Mbo Ⅰ、Cfr10 Ⅰ、Apa Ⅰ及 Stu Ⅰ分别检测1a(Ⅰ)、2b(Ⅳ)、1b(Ⅱ )、2a(Ⅲ)及1b(Ⅱ)与1b(Ⅱ)混合感染。
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1.4.2 血清IL-2的检测(放射免疫法)：具体方法参照试剂盒说明书。
1.4.3 血清肿瘤坏死因子的检测 (放射免疫法)：具体方法参照试剂盒说明书。
1.5 统计学处理
采用F检验、q检验及卡方检验进行差异显著性检验。
2 结果
2.1 慢性丙型肝炎HCV基因型的检测结果
试验中HCV-RNA NS5的PCR产物为381 bp的cDNA，经Alu I酶切后产生209、114、50、8bp 的 cDNA片段为Ⅱ型。当PCR产物经Alu I酶切后为381 bp的cDNA，经Mbo I酶切后为266、115 bp的cDNA时，则为IV型。当PCR产物经Alu I 及Mbo I酶切后均为381 bp的cDNA时，则为Ⅲ 型。本试验共检测48例慢性丙型肝炎患者HCV基因型，其中 43/48例 (89.59%)HCV为 Ⅱ型，5/48例 (10.41%)HCV为Ⅲ型，未测得其他基因型，说明本地区HCV以Ⅱ型为主。48 例接受干扰素治疗的患者，14 例 (29%)显效，34例(71%)无效。HCV基因型Ⅱ型的慢性丙型 肝炎10/43例(23%)显效，33/43例 (77%)无效；HCV基因型Ⅲ型的慢性丙型肝炎4/5例 (80%) 显效，1 /5例(20%)无效。 HCV基因Ⅲ型的慢性丙型肝炎与Ⅱ型比较，干扰素疗效存在显著 差异(P<0.05)，HCV基因Ⅲ型慢性丙型肝炎干扰素的疗效优于 Ⅱ型。
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2.2 慢性丙型肝炎血清IL-2及TNF的检测结果
本试验共检测48例慢性丙型肝炎患者的血清IL-2及 TNF浓度，按疗效分组，其中显效14例 ，无效 34例 ，以 20例正常人作对照，无效组IL-2 [(2.53±0.57) ng/ml]与正常 对照组[(3.72±0.95) ng/ml]及显效组[(3.68±0.84) ng/ml]比较，两者均有 显著差异(P<0.05)，无效组的IL-2水平明显低于其他两组。显效组 IL-2与正常对照 组比较，两组水平无显著性差异 (P>0.05)。显效组TNF [(3.15±0.77) ng/ml] 及无效组TNF[(3.47±1.10) ng/ml]与正常对照组[(1.56±0.47) ng/ml]比较， 存在显著性差异(P<0.05)，慢性丙型肝炎患者的TNF水平较健康人为高，显效组TNF与 无效组比较，两者无显著性差异(P>0.05)。
2.3 HCV基因型与慢性丙型肝炎血清IL-2的关系
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本试验对检测的48例慢性丙型肝炎患者的血清IL - 2浓度 ，按基因型分组 ，其中HCV基因 型Ⅱ型组(43/48例)IL-2为[(2.85±0.88) ng/ml]，Ⅲ型组(5/48例)为[(2.98±0 .36) ng/ml]，两组比较无显著性差异(P>0.05)，两组IL-2水平相仿。
3 讨论
3.1 丙肝病毒基因型对丙型肝炎α-INF疗效的影响
HCV为单股正链RNA病毒，基因结构与黄病毒相似，并具有高度的异源型和显著的变异型，HC V为适应环境和逃避宿主免疫监控作用而发生突变，所以在长期的适应演化过程中，HCV逐渐 形成了众多的突变毒株，即基因型。近来多数学者认为HCV基因型是影响干扰素疗效的重要 原因之一。Chemello[4]等研究证明 HCVⅠ、Ⅱ、Ⅲ的长期应答率分别为29%、 52% 、74%，表明Ⅲ型应答率较高，Ⅰ型则偏低; 国内陆志檬等[5]研究发现，Ⅰ、Ⅲ 型较Ⅱ型病毒易于清除。本文研究显示，武汉地区丙肝病毒基因型以Ⅱ型为主；HCV基因Ⅲ 型慢性丙型肝炎干扰素的疗效优于Ⅱ型，结果与文献报道一致。HCV基因型可以影响慢性丙 型肝炎α-INF疗效，原因目前尚不清楚，有待进一步的研究去阐明，但HCV基因型可以作为 预测α-INF疗效的重要指标。
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3.2 IL-2对丙型肝炎的影响
IL- 2与干扰素疗效的关系目前研究较少。本文研究表明，慢性丙型肝炎患者血清IL-2水 平，无效组低于其他两组(P<0.05)，结果与文献报道[6]一致，这说明 IL-2 可以影响慢性丙型肝炎干扰素的疗效。本文研究还显示，HCV基因型Ⅱ型组与 Ⅲ型组 IL-2 水平相仿，说明 HCV基因型与慢性丙型肝炎血清 IL-2水平无相关性，HCV基因型并非通过 IL-2影响慢性丙型肝炎α-INF疗效。目前国内外尚无这方面报道。
3.3 TNF对丙型肝炎的影响
TNF在丙型肝炎中的作用及与干扰素疗效的关系，目前尚不十分清楚。本文研究显 示，慢性丙型肝炎患者TNF水平较正常健康人明显为高(P<0.05)，与文献报道[6 ] 一致。本文研究还显示，显效组与无效组之间TNF水平无显著性差异(P>0.05)，与文 献报道[6]一致，提示TNF不影响慢性丙型肝炎干扰素的疗效。
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王平，男，1970年生，医学硕士。现址：武汉市中西医结合医院，武汉 430030
参考文献
1，Michele M P, Patrick M, Michele P et al. Pretreatment serum C vi rus RNA levels and hepatitis C virus Genotype are the main and independent progn ostic factors of sustained response to interferon alfa therapy in chronic hepati tis C. Hepatology,1995, 22:1050
2，Antonelli G, Currenti M, Turriziani O et al. Relative frequency of nonneutralizing antibodies to interferon(IFN) in hepatitis treated with diffe rent IFN-a preparations. The Journal of Infectious Diseases,1992, 165:593
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3，Giorgio Saracco, Mario Rizzetto.Predictors of response to interfe ron therapy. Digestive Diseases and Science ,1996,41:115s
4，Chemello L. Hepatitis C serotype and response to interferon therapy . N Engl J Med, 1994, 330:143
5，陆志檬,张东华,童葵塘等. HCV基因型及病毒量与干扰素疗效的关系.中华传 染病杂志,1995,13(2):65
6，Juan A Q, Julio M, Margarita P et al. Serum leve ls of soluble immune factors and pathogensis of chronic hepatitis c, and their relation to therapeutic respones to interferon-a. Digestive Diseases and Scienc e, 1994, 39: 2485
(收稿：1998-12-03), http://www.100md.com