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编号:10284487
两种不同来源的EBV LMP1基因在Balb/c 3T3细胞中的表达
http://www.100md.com 《中山大学学报(医学科学版)》 2000年第3期
     作者:陈元 郭辉玉 方丹云 晏辉钧

    单位:中山医科大学微生物学教研室,广东 广州 510089

    关键词:Epstein-Barr病毒;潜代膜蛋白1基因;鼻咽肿瘤

    中山医科大学学报000314

    摘 要:【目的】研究来源于鼻咽癌细胞株SUNE1及EBV标准株B95-8细胞中两种EBV LMP1基因在真核细胞Balb/c 3T3中的表达,为进一步研究EBV LMP1基因的核酸疫苗打基础。【方法】将两种不同来源EBV LMP1基因的真核表达质粒,经脂质体法转染Balb/c 3T3细胞后,用Western blot、免疫组化及PCR的方法检测不同转染细胞中EBV LMP1蛋白的表达及核酸片段。【结果】PCR结果表明在两种不同来源LMP1转染细胞中均有EBV LMP1基因序列,并均能表达63 ku的蛋白质,经Western blot和免疫组化结果证实均为EBV LMP1蛋白。【结论】来源于B95-8细胞及鼻咽癌细胞SUNE1的两种EBV LMP1基因均能在真核细胞Balb/c 3T3中表达。
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    中图分类号:R 373.3 文献标识码:A 文章编号:1000-257X(2000)03-0205-04

    The Expression of EBV LMP1 Isolated from Two Different Origins in Balb/c 3T3 Cell Line

    CHEN Yuan,GUO Hui-yu,FANG Dan-yun,YAN Hui-jun

    (Department of Microbiology,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089,China)

    Abstract:【Objective】To study the expression of two EBV LMP1 genes isolated from nasopharyngeal carcinoma cell line SUNE1 and EBV standard cell line B95-8 in the eukaryotic cells for further EBV LMP1 DNA immunization.【Methods】Transfected two diffierent origins LMP1 eukaryotic expression plasmid vector into Balb/c 3T3 cells by lipofectamin method and identified the expression of EBV LMP1 proteins in transfected cells by Western blot and immunohistochemistry.The polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the EBV LMP1 fragment in the transfected cells.【Results】A 63 ku protein was observed by Western blot analysis and the positive staining of specific EBV LMP1 protein was detectable by immunohistochemical staining in both of the two LMP1 genetransfected cells.The EBV LMP1 fragment was detected in PCR products in both of these two transfected cells.【Conclusion】Both EBV LMP1 genes from two different origins can express in Balb/c 3T3 cell lines.
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    Key words:Epstein-Barr virus; latent membrane protein 1 gene; nasopharyngeal carcinoma

    EBV LMP1是Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)潜伏感染细胞及某些EBV相关肿瘤细胞中表达的一个主要EBV相关蛋白。现已发现,LMP1能诱导宿主细胞bcl-2、A20等基因的表达,具有激活B细胞表面粘附因子LFA-1、LFA-3、ICAM-1的表达,使B细胞聚集等生物学活性[1]。通过对LMP1基因转染细胞的实验表明,LMP1具有改变成纤维细胞形态、降低细胞对血清依赖性以及导致接触抑制丧失能力,转染了LMP1基因的细胞具有使裸鼠致瘤的能力,还能影响上皮细胞的生长、分化[2],这些结果均表明LMP1在一定的作用环境下具有致瘤能力,可能是一种癌基因。EBV的感染被认为是鼻咽癌(NPC)在发生发展过程中具有重要作用的一个关键因素。有报道NPC细胞中EBV LMP1基因与标准株相比在序列上有一定的差异[3]。因此,有必要对NPC来源的EBV LMP1基因在真核细胞中的表达情况作进一步研究。本实验通过脂质体转染的方法将两种不同来源的EBV LMP1基因导入Balb/c 3T3细胞中,并用Western blot及免疫组化的方法,探讨不同来源的EBV LMP1基因在真核细胞中的表达情况。
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    1 材料和方法

    1.1 细胞来源

    EBV标准株B95-8细胞系由香港大学微生物学系惠赠;广东地区低分化鼻咽癌体外传代细胞株SUNE1由中山医科大学肿瘤研究所提供;Balb/c 3T3小鼠成纤维细胞系由中山医科大学附属第一医院神经科陈国俊博士后提供。

    1.2 主要试剂

    脂质体转染试剂盒:LipofectamineTM reagent kit (Gibco BRL公司);免疫组化试剂盒:LSAB Kit (Dako公司);EBV LMP1单克隆抗体:CS1-4 (Dako公司);pcDNA3真核细胞克隆表达质粒(Invitrogen公司);G418(Sigma公司)。

    1.3 EBV LMP1真核细胞表达载体的构建
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    将标准株B95-8细胞及鼻咽癌SUNE1细胞株中EBV LMP1基因定向克隆至真核表达载体pcDNA3质粒中,得到两种不同来源EBV LMP1的真核细胞表达质粒pcDNA3-BLMP1(B95-8来源)及pcDNA3-SLMP1(SUNE1细胞来源),并通过测序鉴定。方法及结果见文献[4]。

    1.4 脂质体法转染

    将构建好的EBV LMP1表达质粒pcDNA3-BLMP1,pcDNA3-SLMP1及空质粒载体pcDNA3按LipofectamineTM reagent试剂盒说明转染Balb/c 3T3细胞。细胞置6孔培养板中,48 h后用G418筛选。15 d后见有克隆形成,挑取克隆,扩大培养,收集细胞。

    1.5 转染细胞中总蛋白提取及Western blot检测

    Balb/c 3T3转染细胞总蛋白提取参照文献[5]。提取的蛋白质行SDS-PAGE后,按常规方法转移至硝酸纤维素膜。用1∶20稀释的EBV LMP1单克隆抗体CS1-4为第一抗体,1∶50稀释的辣根过氧化酶标记的抗羊鼠IgG为第二抗体进行酶联反应,DAB显色。用未转染的Balb/c 3T3细胞作对照。
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    1.6 转染细胞中LMP1蛋白免疫组化检测

    收集转染细胞并制成悬液,滴于无菌玻片上,37 ℃ φ=5% CO2培养36 h后,经PBS洗涤,冷丙酮固定,微波处理后备用。将做好的细胞滴片按LSAB试剂盒的方法用CS1-4为第一抗体进行免疫组化染色后,显微镜下观察结果。

    1.7 转染细胞中EBV LMP1基因检测

    根据EBV LMP1标准株B95-8中EBV LMP1基因序列,设计一对引物:

    P1 5′CCTACATAAGCCTCTCACACTG 3′

    (169 548 nt~169 527 nt)22 bp

    P2 5′CAGTAAATGGAGGGAGAG 3′
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    (168 094 nt~168 111 nt)18 bp

    提取转染细胞DNA为模板,按常规PCR的方法扩增,产物于10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测结果。

    2 结 果

    2.1 两种不同来源EBV LMP1基因在转染细胞中Western blot检测结果

    用未转染的Balb/c 3T3细胞为空白对照,转染载体质粒pcDNA3的Balb/c 3T3为阴性对照,将两种不同来源的EBV LMP1基因转染细胞后,经G418筛选,克隆,提取细胞总蛋白,将蛋白质量调整一致后,进行Western blot分析发现,在63 ku处,两株转染有EBV LMP1基因的转染细胞总蛋白中有明显的阳性条带,而其他细胞则为阴性(图1)。t20601.gif (9844 bytes)
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    图1 不同转染细胞LMP1基因表达Western blot分析

    Fig.1 Western blot analysis of expressed LMP1 in different transfected cells

    Lane 1:low molecular protein marker,lane 2:SUNE1 LMP1 transfected cell,lane 3: B95-8 LMP1 transfected cell,lane 4: pcDNA3 vector transfected cell,lane 5: Balb/c 3T3 cell

    2.2 转染细胞中EBV LMP1蛋白免疫组化检测

    将转染有EBV LMP1基因的细胞及转染有载体质粒的细胞制成滴片,用LSAB免疫组化方法检测显示,在两株EBV LMP1基因转染的细胞浆及细胞膜上均有EBV LMP1蛋白的稳定表达,而空载体转染的细胞则为阴性(图2)。t20701.gif (15092 bytes)
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    图2 不同转染细胞LMP1基因表达免疫组化染色

    Fig.2 Immunohistochemical staining results of LMP1 protein expression in different transfected cells (LSAB×100)

    A: SUNE1 LMP1 transfected cells,B:B95-8 LMP1 transfected cells,C:pcDNA3 vector transfected cells

    2.3 转染细胞中EBV LMP1基因的检测

    对3种转染细胞PCR分析表明,在两种转染有EBV LMP1基因的细胞DNA中可以扩增出1.4 kb的特异性EBV LMP1基因片段,与预计的片段大小(169 548 nt~168 094 nt)相符,而空载体转染细胞中则无(图3)。t20702.gif (3540 bytes)
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    图3 不同转染细胞中LMP1基因片段PCR扩增

    Fig.3 PCR detection of LMP1 fragment in different transfected cells

    Lane 1:pcDNA3 transfected cells,Lane 2: B95-8 LMP1 transfected cell,lane 3: SUNE1 LMP1 transfected cell,lane 4:DNA marker (λ DNA/HindⅢ+EcoRⅠ)

    3 讨 论

    EBV LMP1是EBV潜伏感染细胞及某些EBV相关肿瘤细胞中表达的一个主要EBV相关蛋白,其ORF为EBV基因组BamHⅠ Nhet片段中左向读码框架BNLF-1,包括3个外显子与2个内含子,是一种完整的跨膜蛋白。已有资料证明,LMP1在EBV转化细胞以及在其转染细胞的致瘤过程中起重要作用[6,7],而在NPC组织中LMP1又是EBV表达的一种最主要的蛋白质[1]。对不同来源的EBV LMP1基因诱导细胞转化的研究发现,来自于NPC患者中的EBV LMP1似乎具有更强的转化细胞活性[8]。SUNE是从广东地区NPC病人组织中分离的NPC细胞株,多项研究均已证实它携带有EBV,将其EBV LMP1基因转染人胚肾上皮细胞后接种于裸鼠体内,可以诱发肿瘤的形成,而且这种成瘤能力比B95-8细胞的LMP1成瘤能力强[9,10]。我们前期的实验结果表明,虽然SUNE1与B95-8的EBV LMP1在核苷酸序列上有20个碱基的差异,但并无较早前国外报道的东南亚地区NPC来源的EBV LMP1中所存在的C末端30个碱基的缺失[11],它们核苷酸的同源性为98.5%,氨基酸序列上的同源性为96%[4]。本实验的结果表明,这两种不同来源的EBV LMP1基因在转染小鼠成纤维细胞后,均可在转染细胞的细胞膜及细胞浆中表达。因此我们认为,SUNE1中EBV LMP1的强致瘤性可能与其核苷酸变异后导致其蛋白质在二维或三维空间构象的某些改变,从而诱导了特异性的转录调控因子的表达有关。
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    本研究结果还证实,NPC来源的LMP1与标准株来源的LMP1基因均可在哺乳动物真核细胞中表达,这为发展EBV LMP1核酸疫苗以控制机体EBV感染及相关肿瘤的发生发展提供了另一条新思路。有关工作,本实验室正在研究中。

    基金项目:中山医科大学科研基金项目(5221116301035)

    作者简介:陈 元(1969-),男,江苏兴化人,博士,讲师.

    参考文献:

    [1]Rickinson A B,Kieff E.Epstein-Barr virus.In Field′s Virology[M].Philadelphia: Lippincott-Raven,1996.2397.

    [2]Zheng N,Yuan F,Chen L F,et al.Effect of a B-lymphocyte and NPC derived EBV-LMP1 gene expression on in vitro growth and differentiation of human epithelial cells[J].Int J Cancer,1994,57(5):747.
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    [3]Siu T C,Leung S F,Lo K W,et al.Specific latent membrane proteinl gene sequences in type 1 and type 2 Epstein-Barr virus from nasopharyngeal carcinoma in Hongkong[J].Int J Cancer,1998,76(3):399.

    [4]陈 元,郭辉玉,曹 虹,等.鼻咽癌细胞株SUNE1中EBV LMP1基因克隆及部分序列分析[J].中华实验与临床病毒学杂志,1999,13(4):217.

    [5]Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.金冬雁, 黎孟枫,译.分子克隆实验指南[M].第2版.北京:科学出版社,1995.873~891.

    [6]Wang D.An EBV membrane protein expressed in immortalized lymphocytes transforms established rodent cells[J].Cell,1985,43(4):831.
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    [7]Kevin H,Susan F,Mary H,et al.A membrane protein encoded by Epstein-Barr virus in latent growth-transforming infection[J].Proc Natl Acad Sci USA,1984,81(7):7207.

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    [9]吴荫棠,汪慧民,杨小平,等.鼻咽癌裸鼠移植瘤及其相应体外细胞株的建立与特性研究[J].癌症,1995,14(2):83.

    [10]陈宜芳,郭辉玉,汪慧民,等.鼻咽癌细胞系SUNE中EBV LMP1基因对永生化人胚肾上皮细胞生长特性的影响[J].中华肿瘤杂志,1998,20(5):330.

    [11]Suet Y L,Siu T Y,Lap P C,et al.Prevalence of mutations and 30-bp deletion in the C-terminal region of Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 oncogene in reactive lymphoid tissue and non-nasopharyngeal EBV-associated carcinomas in Hongkong Chinese[J].Int J Cancer,1997,72(2):225.

    收稿日期:1999-11-01, 百拇医药