狂犬病毒糖蛋白及核蛋白在非复制型痘苗病毒天坛株中的共同表达
作者：李萍 朱家鸿 严家新 郭斐 胡巧玲 王继麟 刘碧芬 阮力
单位：李萍 朱家鸿 严家新 胡巧玲 王继麟 刘碧芬(卫生部武汉生物制品研究所基因工程室)；郭斐 阮力(中国预防医学科学院病毒学研究所)
关键词：狂犬病毒糖蛋白；狂犬病毒核蛋白；非复制型重组痘苗病毒载体
中华微生物学和免疫学杂志000534 【 摘要 】 目的 提高重组痘苗病毒狂犬疫苗的有效性和安全性。 方法 利用TK区表达狂犬病毒糖蛋白(RG)的重组痘苗病毒作为亲本株，通过两步同源重组，删除痘苗病毒基因组CK片段间与毒力和宿主范围相关的核酸片段，同时将狂犬病毒核蛋白(RN)基因插入C-K片段之间，获得了含有RG基因和RN基因的非复制型重组痘苗病毒VTKRGΔCKLacZRN。 结果 经PCR鉴定，RN基因已插入CK区；Western blot结果显示，该株病毒能同时表达RG和RN，相对分子质量(Mr)分别为65×103和50.5×103。VTKRGΔCKLacZRN在人源细胞如TK-143细胞中不能正常繁殖，在鸡胚成纤维细胞(CEF)中能正常复制。与非复制型重组病毒VTKRGΔCK相比，VTKRGΔCKLacZRN免疫小鼠后能更快地诱生较高滴度的中和抗体，效果相当于复制型重组病毒VTKRG免疫组；它们均能保护小鼠针对致死剂量狂犬病毒国际标准攻击毒株(CVS)的攻击。 结论 VTKRGΔCKLacZRN具有良好的免疫效果和安全性。
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Co-expressing of rabies virus glycoprotein and nucleoprotein in the non-replicating vaccinia virus Tiantan strain
LI Ping ,ZHU Jiahong, YAN Jiaxin, et al.
(Department of Genetic Engineering, Wuhan Institute of Biological Products, Wuhan 430060, P.R.China)
【 Abstract 】 Objective To improve the efficacy and safety of recombinant vaccinia rabies vaccine, the non-replicating recombinants co-expressing rabies virus glycoprotein and nucleoprotein were constructed. Methods
, 百拇医药
According to the strategy of transient dominant selection, the rabies virus nucleoprotein (RN) gene was introduced into recombinant vaccinia virus(VTKRG) which expresses rabies virus glycoprotein (RG) gene in the TK locus by homologous recombinant. Results A fragment between fragment C and fragment K associated with the virulence and host range of vaccinia virus was substituted by RN gene, resulting in the VTKRGΔCKLacZRN. Western blot showed that VTKRGΔCKLacZRN expressed G protein and N protein with molecular weights of 65×103 and 50.5×103 respectively. The genetically modified VTKRGΔCKLacZRN possessed a highly attenuated phenotype, attributed to a decreased replicative capacity when grown in human cell lines. Compared with the non-replicating recombinant vaccinia virus VTKRGΔCK expressing G protein only, VTKRGΔCKLacZRN, similar to VTKRG, were able to induce higher virus-neutralizing antibody titers faster in mice. Mice inoculated with all of the recombinants were protected from a lethal intramuscularly (i.m.) challenge of rabies virus CVS strain which killed all control mice. Conclusion VTKRGΔCKLacZRN possesses excellent immunogenicity and improved safety in view of clinical application.
, 百拇医药
【 Subject words 】 Rabies virus glycoprotein; Rabies virus nucleoprotein; Non-replicating vaccinia virus vector
狂犬病是一种人畜共患的恶性传染病，病死率为100%。狂犬病疫苗可有效地控制该病的发生。利用基因工程载体表达狂犬病毒保护性抗原是狂犬疫苗研究的重要内容。在狂犬病毒5种结构蛋白中，狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein，RG)可诱生中和抗体，为研制基因工程疫苗的首选成分。近年来，越来越多的资料显示，位于病毒内部的狂犬病毒核蛋白(rabies virus nucleoprotein，RN)可促进中和抗体的产生，并在细胞免疫中发挥重要作用。RN抗体还能抑制狂犬病毒在细胞间的传播和细胞内的繁殖〔1〕。
我们以非复制型痘苗病毒为载体成功地表达了RG，该载体的有效性和安全性已在小量动物实验中得到证实〔2〕。为了使其涵盖有效的抗原成分，更接近天然病毒的感染，从多个途径激活免疫系统，进一步提高免疫效果，我们构建了同时表达RG及RN的非复制型重组痘苗病毒，并对重组体中外源基因的表达及免疫效果进行了研究。
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材料与方法
质粒与菌株：pGEM-3ZRN为本室构建〔3〕。pNeoC′-11LacZ75K′由中国预防医学科学院病毒所提供，用于构建含有RN基因的重组质粒pNeoC′-11LacZ75RNK′，将LacZ与RN基因送至CK片段间，同时删除C、K片段间与毒力和宿主范围相关的基因。E.coli MC1061由中国预防医学科学院病毒所遗传室提供。
病毒和细胞：痘苗病毒VTKRG，其TK区含有中国狂犬病毒疫苗株5aG株的RG基因，由本室构建〔4〕。痘苗病毒VTKRN，其TK区含有狂犬病毒CVS株的RN基因，由本室构建〔5〕。人TK-143细胞由中国预防医学科学院病毒所遗传室提供。原代鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast, CEF)用9日龄鸡胚，按常规方法制备。
酶与试剂：限制性核酸内切酶，T4 DNA连接酶，Lipofectin转染试剂盒均购自Gibco BRL公司; Taq酶购自华美生物工程公司; G418购自Sigma公司; RG单克隆抗体由美国CDC Dr.Smith惠赠; RN单克隆抗体由本室徐葛林教授提供; HRP标记羊抗鼠IgG购自Sigma公司; 引物1和引物2由中国预防医学科学院病毒所遗传室提供, 分别为痘苗病毒C和K片段的同源序列(该缺失载体正在申请专利，引物序列暂略)。其它试剂均为国产AR级。
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重组质粒pNeoC′-11LacZ75RNK′的构建：用XbaⅠ，HindⅢ双酶切pGEM-3ZRN，回收RN基因, Klenow补平后，连入pNeoC′-11LacZ75K′ /BamHⅠ(先经Klenow补平位点)。经酶切鉴定，筛选正向克隆，使RN基因的表达受P7.5启动子的控制，构建成pNeoC′-11LacZ75RNK′。
双表达RG、RN的非复制型重组痘苗病毒VTKRG△CKLacZRN的构建与鉴定：重组病毒VTKRG以0.01PFU/cell感染90%成片的CEF细胞，37℃吸附1?h后，利用Lipofectin将质粒pNeoC′-11LacZ75RNK′导入细胞，37℃培养5?h，换含2%小牛血清的Eagle′s液，置37℃继续培养48?h后，收获病毒。原瓶冻融3次，取部分重组液在含G418 400μg/ml的CEF中传3代；然后，在无G418的CEF中传2～3代。将如此处理的重组液对数稀释后感染CEF，37℃培养72?h后，铺入含X-gal和中性红的营养琼脂，随机挑取孤立的蓝斑于2%小牛血清的Eagle′s液中冻融3次。根据在CEF细胞中生长，在TK-143细胞中不生长的特性筛选重组病毒。将筛选出的可形成蓝斑的病毒扩增后提取其DNA〔7〕，以PCR方法进行鉴定。循环参数为95℃预变性5?min，95℃ 1?min，55℃ 1?min，72℃ 2?min，共30个循环，再72℃ 10?min。
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VTKRG△CKLacZRN表达产物的检测：间接免疫荧光法和Western blot按常规方法进行〔7〕。
小鼠中和抗体测定和攻击保护实验：于0?d、7?d以0.3ml(108 PFU/ml)VTKRG△CKLacZRN肌肉免疫小鼠。于7?d，14?d，21?d，28?d采血，以小鼠中和实验(mouse neutralizing test，MNT)测定其中和抗体〔8,9〕；第14天以10LD50 CVS株狂犬病毒肌肉攻击小鼠，连续观察14?d，计算存活率。同时以VTKRG△CK、VTKRG及痘苗病毒天坛株(VTT)分别免疫小鼠作为对照。
结果
1.重组质粒pNeoC′-11LacZ75RNK′的构建：pNeoC′-11LacZ75RNK′的结构图及酶切鉴定图分别见图1、图2。
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2.重组病毒VTKRG△CKLacZRN的筛选及鉴定：选择在CEF中繁殖而在TK 143细胞中不繁殖的8株能产生蓝斑的病毒，提取其DNA作模板，进行PCR扩增、鉴定。引物1与引物2分别针对痘苗病毒基因组的C和K片段设计。PCR结果显示，8株蓝斑病毒中有5株病毒能扩增出2.0kb的条带，与从阳性对照pNeoC′-11LacZ75RNK′中扩增出的条带大小相同，而对照痘苗病毒天坛株未能扩增出特异性条带(见图3)，说明这5株病毒的CK片段间整合有RN基因。故我们获得了TK区含有RG基因、CK区含有RN基因的非复制型重组痘苗病毒。
3.VTKRG△CKLacZRN表达产物的检测：间接免疫荧光的结果显示, VTKRG△CKLacZRN在CEF细胞中能有效地表达RG和RN。VTKRG△CKLacZRN在鸡胚细胞中连续传15代，将第15代病毒感染的细胞裂解后，进行Western blot检测。同时设立表达RG的重组痘苗病毒VTKRG、表达RN的重组痘苗病毒VTKRN及痘苗病毒天坛株作为对照。一抗为抗RG的单克隆抗体和抗RN的单克隆抗体的混合物。VTKRG△CKLacZRN在Mr为65×103和50.5×103处各有一酶染条带，分别为RG和RN，与文献报道一致，表明VTKRG△CKLacZRN可有效、稳定地表达RG和RN。
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图1 表达RN的重组质粒pNeoC′-11LacZ75RNK′的构建
Fig 1. Construction of pNeoC′-11LacZ75RNK′ expressing rabies virus nucleoprotein
图2 质粒pNeoC′-11LacZ75RNK′的酶切鉴定结果
Fig 2. Restriction enzyme digestion result of pNeoC′-11LacZ75RNK′
1. λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ marker
2. pNeoC′-11LacZ75RNK′ digested with EcoRⅠ
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3. pNeoC′-11LacZ75RNK′digested with SalⅠ
4.VTKRG△CKLacZRN的免疫效果
(1) 免疫小鼠血清中和抗体测定：由表1可见，3株重组病毒免疫小鼠第7天，各组小鼠血清中病毒中和抗体(VNA)的滴度均较低，加强免疫后，VNA很快上升。双表达RG和RN的非复制型重组病毒诱生的VNA水平在第14天和第21天明显高于单独表达RG的非复制型重组病毒，与单独表达RG的复制型重组病毒相当。对照组VTT不能诱导特异性VNA的产生。
图3 PCR对非复制型重组痘苗病毒VTKRG△CKLacZRN的鉴定
Fig 3. Identification of non-replicating recombinant vaccinia virus VTKRG△CKLacZRN by PCR analysis
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1. λDNA/HindⅢ marker；2. Positive control：pNeoC′-11LacZ75RNK′；3-10. Recombinant virus；11. Negative control：vaccinia virus Tiantan strain
表1 重组病毒免疫小鼠血清中和抗体测定
Table 1. Detection of VNA titers in vaccinated mice with different recombinants Recombinants
Viral neutralizing antibody(IU/ml)
Post-prime vaccination time(day)
7
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14
21
28
VTKRGΔCK
1∶0.3
1∶5.4
1∶10.0
1∶14.4
VTKRGΔCKLacZRN
1∶0.9
1∶12.0
1∶17.7
1∶17.3
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VTKRG
1∶1.4
1∶14.4
1∶17.3
1∶15.1
VTT
<1∶0.3
<1∶0.3
<1∶0.3
<1∶0.3
Actual neutralizing virulence of MNT is 214 LD50 VTT：vaccinia virus Tiantan strain
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(2) 攻击保护实验：3株重组病毒免疫小鼠后，均能保护小鼠针对致死剂量狂犬病毒CVS株的攻击，保护率为100%，表明非复制型重组病毒的免疫效果与复制型重组病毒相同。对照组小鼠全部死亡。结果见表2。
表2 重组病毒的免疫保护效果的比较
Table 2. Comparison of immune protection effects induced by different recmbinants Recombinants
Survival rate after challenge(%)*
VTKRGΔCK
100(8/8)**
VTKRGΔCKLacZRN
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100(8/8)**
VTKRG
100(8/8)**
VTT
0(0/8)**
*：Dose of CVS challenged i.m. is 10 LD50 VTT：vaccinia virus Tiantan strain
**: No. of survivors / No. of challenged
讨论
经基因重组改造的非复制型痘苗病毒是当今制备预防性疫苗和治疗性疫苗理想载体〔10,11〕之一。这类载体基因组中部分与毒力及宿主范围有关的基因已被删除。它们感染细胞后或不复制或仅产生流产性复制，却保留了表达外源抗原的能力。该载体的出现使困扰人们多年的痘苗病毒的安全问题基本得到解决。
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我们以非复制型痘苗病毒天坛株为载体，构建了表达RG的重组病毒VTKRGΔCK，其有效性和安全性在动物实验中已被证实。尽管针对RG的VNA是评价狂犬疫苗免疫原性的主要指标，但RG并非是唯一的保护性抗原。有资料表明，RN亦能诱导保护性免疫反应。
本研究构建了同时表达RG和RN的非复制型重组病毒VTKRGΔCKLacZRN，RG基因及RN基因分别位于痘苗病毒的TK区和CK区，均受痘苗病毒早晚期启动子P7.5的控制。理论上，该类启动子控制表达的外源基因为诱生良好的细胞免疫提供了条件〔12〕。我们的研究表明，VTKRGΔCKLacZRN能稳定、有效地表达RG和RN。该病毒免疫小鼠后，诱生的VNA在免疫早期明显高于单独表达RG的重组病毒VTKRGΔCK，与VTKRG诱生的VNA水平相当，并能保护小鼠针对致死剂量狂犬病毒的攻击。推测RN参与保护性免疫反应的机理为：其一，重组病毒表达的RN可诱生CTL和TH′，并通过TH激活产生VNA的B细胞，直接或间接参与细胞免疫和体液免疫；其二，通过RN抗体的Fc段与吞噬细胞的Fc受体结合，发挥免疫粘附作用。当狂犬病毒进入体内后，激活吞噬细胞产生细胞因子抑制病毒的繁殖。
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经查新证明，利用非复制型痘苗病毒构建RG、RN双表达的重组病毒，这在国际上属首次报道。我们还将扩大实验动物例数，摸索最佳免疫方案，建立检测细胞免疫的细胞毒实验，以进一步评价其有效性和安全性，为将其开发为经济实用的基因工程狂犬疫苗提供实验依据。
基金项目：国家863高科技生物领域及国家自然科学基金部分资助项目(39525001)；湖北省科委重点资助项目(981P0904)
参考文献
1，Fekadu M, Sumner JW, Shaddock JH, et al. Sickness and recovery of dogs challenged with a street rabies virus after vaccination with a vaccinia virus recombinant expressing rabies virus N protein. J Virol, 1992, 66(5):2601-2604.
, 百拇医药
2，李萍，胡巧玲，孙朝晖，等. 表达狂犬病毒糖蛋白的非复制型重组痘苗病毒的构建与鉴定. 中华实验和临床病毒学杂志，1999, 13(2):170-174.
3，欧阳沁春，唐彩华, 郑坚, 等. 狂犬病毒5aG株核蛋白基因的克隆及序列分析. 中华实验和临床病毒学杂志, 1997, 11(1):14-16.
4，蔡兵, 朱家鸿, 胡巧玲, 等. 构建以痘苗病毒为载体的人用狂犬病基因工程疫苗株的研究. 中华实验和临床病毒学杂志, 1994, 8(2):105-108.
5，赵卫国，应保龄，王继麟, 等. 表达狂犬病毒N蛋白重组痘苗病毒株的建立及免疫效果观察. 中华实验和临床病毒学杂志, 1993, 7(1):60-64.
6，阮力, 郑浩强, 徐水婵, 等. 呼吸道合胞病毒糖蛋白F和G在同一个重组痘苗病毒中的表达. 病毒学报, 1992, 8(2):101-109.
, 百拇医药
7，林枫, 朱家鸿, 陈乃民, 等. 表达狂犬病毒糖蛋白的痘苗病毒的构建和鉴定. 病毒学报, 1992, 8(3):210-214.
8，Zhu JH, Wang JL, Cai B, et al. Immunogenicity and relative attenuation of different vaccinia-rabies virus recombinants. Arch Virol, 1996, 141:1055-1065.
9，中华人民共和国卫生部. 中国生物制品规程(一部，一九九五年版)，北京：中国人口出版社，1996, P201.
10，朱家鸿，严家新. 痘病毒科. 见：闻玉梅主编现代医学微生物学. 上海：上海医科大学出版社，1999，P872-885.
11，严家新, 朱家鸿. 高度减毒的痘病毒表达载体的研究进展. 中国生物制品学杂志, 1997, 10(2):119-122.
12，Moss B. Genetically engineered pox viruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety. Proc Natl Sci USA, 1996, 93:11341-11384.
(收稿日期：1999-04-19), 百拇医药
单位：李萍 朱家鸿 严家新 胡巧玲 王继麟 刘碧芬(卫生部武汉生物制品研究所基因工程室)；郭斐 阮力(中国预防医学科学院病毒学研究所)
关键词：狂犬病毒糖蛋白；狂犬病毒核蛋白；非复制型重组痘苗病毒载体
中华微生物学和免疫学杂志000534 【 摘要 】 目的 提高重组痘苗病毒狂犬疫苗的有效性和安全性。 方法 利用TK区表达狂犬病毒糖蛋白(RG)的重组痘苗病毒作为亲本株，通过两步同源重组，删除痘苗病毒基因组CK片段间与毒力和宿主范围相关的核酸片段，同时将狂犬病毒核蛋白(RN)基因插入C-K片段之间，获得了含有RG基因和RN基因的非复制型重组痘苗病毒VTKRGΔCKLacZRN。 结果 经PCR鉴定，RN基因已插入CK区；Western blot结果显示，该株病毒能同时表达RG和RN，相对分子质量(Mr)分别为65×103和50.5×103。VTKRGΔCKLacZRN在人源细胞如TK-143细胞中不能正常繁殖，在鸡胚成纤维细胞(CEF)中能正常复制。与非复制型重组病毒VTKRGΔCK相比，VTKRGΔCKLacZRN免疫小鼠后能更快地诱生较高滴度的中和抗体，效果相当于复制型重组病毒VTKRG免疫组；它们均能保护小鼠针对致死剂量狂犬病毒国际标准攻击毒株(CVS)的攻击。 结论 VTKRGΔCKLacZRN具有良好的免疫效果和安全性。
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Co-expressing of rabies virus glycoprotein and nucleoprotein in the non-replicating vaccinia virus Tiantan strain
LI Ping ,ZHU Jiahong, YAN Jiaxin, et al.
(Department of Genetic Engineering, Wuhan Institute of Biological Products, Wuhan 430060, P.R.China)
【 Abstract 】 Objective To improve the efficacy and safety of recombinant vaccinia rabies vaccine, the non-replicating recombinants co-expressing rabies virus glycoprotein and nucleoprotein were constructed. Methods
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According to the strategy of transient dominant selection, the rabies virus nucleoprotein (RN) gene was introduced into recombinant vaccinia virus(VTKRG) which expresses rabies virus glycoprotein (RG) gene in the TK locus by homologous recombinant. Results A fragment between fragment C and fragment K associated with the virulence and host range of vaccinia virus was substituted by RN gene, resulting in the VTKRGΔCKLacZRN. Western blot showed that VTKRGΔCKLacZRN expressed G protein and N protein with molecular weights of 65×103 and 50.5×103 respectively. The genetically modified VTKRGΔCKLacZRN possessed a highly attenuated phenotype, attributed to a decreased replicative capacity when grown in human cell lines. Compared with the non-replicating recombinant vaccinia virus VTKRGΔCK expressing G protein only, VTKRGΔCKLacZRN, similar to VTKRG, were able to induce higher virus-neutralizing antibody titers faster in mice. Mice inoculated with all of the recombinants were protected from a lethal intramuscularly (i.m.) challenge of rabies virus CVS strain which killed all control mice. Conclusion VTKRGΔCKLacZRN possesses excellent immunogenicity and improved safety in view of clinical application.
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【 Subject words 】 Rabies virus glycoprotein; Rabies virus nucleoprotein; Non-replicating vaccinia virus vector
狂犬病是一种人畜共患的恶性传染病，病死率为100%。狂犬病疫苗可有效地控制该病的发生。利用基因工程载体表达狂犬病毒保护性抗原是狂犬疫苗研究的重要内容。在狂犬病毒5种结构蛋白中，狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein，RG)可诱生中和抗体，为研制基因工程疫苗的首选成分。近年来，越来越多的资料显示，位于病毒内部的狂犬病毒核蛋白(rabies virus nucleoprotein，RN)可促进中和抗体的产生，并在细胞免疫中发挥重要作用。RN抗体还能抑制狂犬病毒在细胞间的传播和细胞内的繁殖〔1〕。
我们以非复制型痘苗病毒为载体成功地表达了RG，该载体的有效性和安全性已在小量动物实验中得到证实〔2〕。为了使其涵盖有效的抗原成分，更接近天然病毒的感染，从多个途径激活免疫系统，进一步提高免疫效果，我们构建了同时表达RG及RN的非复制型重组痘苗病毒，并对重组体中外源基因的表达及免疫效果进行了研究。
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材料与方法
质粒与菌株：pGEM-3ZRN为本室构建〔3〕。pNeoC′-11LacZ75K′由中国预防医学科学院病毒所提供，用于构建含有RN基因的重组质粒pNeoC′-11LacZ75RNK′，将LacZ与RN基因送至CK片段间，同时删除C、K片段间与毒力和宿主范围相关的基因。E.coli MC1061由中国预防医学科学院病毒所遗传室提供。
病毒和细胞：痘苗病毒VTKRG，其TK区含有中国狂犬病毒疫苗株5aG株的RG基因，由本室构建〔4〕。痘苗病毒VTKRN，其TK区含有狂犬病毒CVS株的RN基因，由本室构建〔5〕。人TK-143细胞由中国预防医学科学院病毒所遗传室提供。原代鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast, CEF)用9日龄鸡胚，按常规方法制备。
酶与试剂：限制性核酸内切酶，T4 DNA连接酶，Lipofectin转染试剂盒均购自Gibco BRL公司; Taq酶购自华美生物工程公司; G418购自Sigma公司; RG单克隆抗体由美国CDC Dr.Smith惠赠; RN单克隆抗体由本室徐葛林教授提供; HRP标记羊抗鼠IgG购自Sigma公司; 引物1和引物2由中国预防医学科学院病毒所遗传室提供, 分别为痘苗病毒C和K片段的同源序列(该缺失载体正在申请专利，引物序列暂略)。其它试剂均为国产AR级。
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重组质粒pNeoC′-11LacZ75RNK′的构建：用XbaⅠ，HindⅢ双酶切pGEM-3ZRN，回收RN基因, Klenow补平后，连入pNeoC′-11LacZ75K′ /BamHⅠ(先经Klenow补平位点)。经酶切鉴定，筛选正向克隆，使RN基因的表达受P7.5启动子的控制，构建成pNeoC′-11LacZ75RNK′。
双表达RG、RN的非复制型重组痘苗病毒VTKRG△CKLacZRN的构建与鉴定：重组病毒VTKRG以0.01PFU/cell感染90%成片的CEF细胞，37℃吸附1?h后，利用Lipofectin将质粒pNeoC′-11LacZ75RNK′导入细胞，37℃培养5?h，换含2%小牛血清的Eagle′s液，置37℃继续培养48?h后，收获病毒。原瓶冻融3次，取部分重组液在含G418 400μg/ml的CEF中传3代；然后，在无G418的CEF中传2～3代。将如此处理的重组液对数稀释后感染CEF，37℃培养72?h后，铺入含X-gal和中性红的营养琼脂，随机挑取孤立的蓝斑于2%小牛血清的Eagle′s液中冻融3次。根据在CEF细胞中生长，在TK-143细胞中不生长的特性筛选重组病毒。将筛选出的可形成蓝斑的病毒扩增后提取其DNA〔7〕，以PCR方法进行鉴定。循环参数为95℃预变性5?min，95℃ 1?min，55℃ 1?min，72℃ 2?min，共30个循环，再72℃ 10?min。
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VTKRG△CKLacZRN表达产物的检测：间接免疫荧光法和Western blot按常规方法进行〔7〕。
小鼠中和抗体测定和攻击保护实验：于0?d、7?d以0.3ml(108 PFU/ml)VTKRG△CKLacZRN肌肉免疫小鼠。于7?d，14?d，21?d，28?d采血，以小鼠中和实验(mouse neutralizing test，MNT)测定其中和抗体〔8,9〕；第14天以10LD50 CVS株狂犬病毒肌肉攻击小鼠，连续观察14?d，计算存活率。同时以VTKRG△CK、VTKRG及痘苗病毒天坛株(VTT)分别免疫小鼠作为对照。
结果
1.重组质粒pNeoC′-11LacZ75RNK′的构建：pNeoC′-11LacZ75RNK′的结构图及酶切鉴定图分别见图1、图2。
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2.重组病毒VTKRG△CKLacZRN的筛选及鉴定：选择在CEF中繁殖而在TK 143细胞中不繁殖的8株能产生蓝斑的病毒，提取其DNA作模板，进行PCR扩增、鉴定。引物1与引物2分别针对痘苗病毒基因组的C和K片段设计。PCR结果显示，8株蓝斑病毒中有5株病毒能扩增出2.0kb的条带，与从阳性对照pNeoC′-11LacZ75RNK′中扩增出的条带大小相同，而对照痘苗病毒天坛株未能扩增出特异性条带(见图3)，说明这5株病毒的CK片段间整合有RN基因。故我们获得了TK区含有RG基因、CK区含有RN基因的非复制型重组痘苗病毒。
3.VTKRG△CKLacZRN表达产物的检测：间接免疫荧光的结果显示, VTKRG△CKLacZRN在CEF细胞中能有效地表达RG和RN。VTKRG△CKLacZRN在鸡胚细胞中连续传15代，将第15代病毒感染的细胞裂解后，进行Western blot检测。同时设立表达RG的重组痘苗病毒VTKRG、表达RN的重组痘苗病毒VTKRN及痘苗病毒天坛株作为对照。一抗为抗RG的单克隆抗体和抗RN的单克隆抗体的混合物。VTKRG△CKLacZRN在Mr为65×103和50.5×103处各有一酶染条带，分别为RG和RN，与文献报道一致，表明VTKRG△CKLacZRN可有效、稳定地表达RG和RN。
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图1 表达RN的重组质粒pNeoC′-11LacZ75RNK′的构建
Fig 1. Construction of pNeoC′-11LacZ75RNK′ expressing rabies virus nucleoprotein
图2 质粒pNeoC′-11LacZ75RNK′的酶切鉴定结果
Fig 2. Restriction enzyme digestion result of pNeoC′-11LacZ75RNK′
1. λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ marker
2. pNeoC′-11LacZ75RNK′ digested with EcoRⅠ
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3. pNeoC′-11LacZ75RNK′digested with SalⅠ
4.VTKRG△CKLacZRN的免疫效果
(1) 免疫小鼠血清中和抗体测定：由表1可见，3株重组病毒免疫小鼠第7天，各组小鼠血清中病毒中和抗体(VNA)的滴度均较低，加强免疫后，VNA很快上升。双表达RG和RN的非复制型重组病毒诱生的VNA水平在第14天和第21天明显高于单独表达RG的非复制型重组病毒，与单独表达RG的复制型重组病毒相当。对照组VTT不能诱导特异性VNA的产生。
图3 PCR对非复制型重组痘苗病毒VTKRG△CKLacZRN的鉴定
Fig 3. Identification of non-replicating recombinant vaccinia virus VTKRG△CKLacZRN by PCR analysis
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1. λDNA/HindⅢ marker；2. Positive control：pNeoC′-11LacZ75RNK′；3-10. Recombinant virus；11. Negative control：vaccinia virus Tiantan strain
表1 重组病毒免疫小鼠血清中和抗体测定
Table 1. Detection of VNA titers in vaccinated mice with different recombinants Recombinants
Viral neutralizing antibody(IU/ml)
Post-prime vaccination time(day)
7
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14
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VTKRGΔCK
1∶0.3
1∶5.4
1∶10.0
1∶14.4
VTKRGΔCKLacZRN
1∶0.9
1∶12.0
1∶17.7
1∶17.3
, http://www.100md.com
VTKRG
1∶1.4
1∶14.4
1∶17.3
1∶15.1
VTT
<1∶0.3
<1∶0.3
<1∶0.3
<1∶0.3
Actual neutralizing virulence of MNT is 214 LD50 VTT：vaccinia virus Tiantan strain
, http://www.100md.com
(2) 攻击保护实验：3株重组病毒免疫小鼠后，均能保护小鼠针对致死剂量狂犬病毒CVS株的攻击，保护率为100%，表明非复制型重组病毒的免疫效果与复制型重组病毒相同。对照组小鼠全部死亡。结果见表2。
表2 重组病毒的免疫保护效果的比较
Table 2. Comparison of immune protection effects induced by different recmbinants Recombinants
Survival rate after challenge(%)*
VTKRGΔCK
100(8/8)**
VTKRGΔCKLacZRN
, 百拇医药
100(8/8)**
VTKRG
100(8/8)**
VTT
0(0/8)**
*：Dose of CVS challenged i.m. is 10 LD50 VTT：vaccinia virus Tiantan strain
**: No. of survivors / No. of challenged
讨论
经基因重组改造的非复制型痘苗病毒是当今制备预防性疫苗和治疗性疫苗理想载体〔10,11〕之一。这类载体基因组中部分与毒力及宿主范围有关的基因已被删除。它们感染细胞后或不复制或仅产生流产性复制，却保留了表达外源抗原的能力。该载体的出现使困扰人们多年的痘苗病毒的安全问题基本得到解决。
, 百拇医药
我们以非复制型痘苗病毒天坛株为载体，构建了表达RG的重组病毒VTKRGΔCK，其有效性和安全性在动物实验中已被证实。尽管针对RG的VNA是评价狂犬疫苗免疫原性的主要指标，但RG并非是唯一的保护性抗原。有资料表明，RN亦能诱导保护性免疫反应。
本研究构建了同时表达RG和RN的非复制型重组病毒VTKRGΔCKLacZRN，RG基因及RN基因分别位于痘苗病毒的TK区和CK区，均受痘苗病毒早晚期启动子P7.5的控制。理论上，该类启动子控制表达的外源基因为诱生良好的细胞免疫提供了条件〔12〕。我们的研究表明，VTKRGΔCKLacZRN能稳定、有效地表达RG和RN。该病毒免疫小鼠后，诱生的VNA在免疫早期明显高于单独表达RG的重组病毒VTKRGΔCK，与VTKRG诱生的VNA水平相当，并能保护小鼠针对致死剂量狂犬病毒的攻击。推测RN参与保护性免疫反应的机理为：其一，重组病毒表达的RN可诱生CTL和TH′，并通过TH激活产生VNA的B细胞，直接或间接参与细胞免疫和体液免疫；其二，通过RN抗体的Fc段与吞噬细胞的Fc受体结合，发挥免疫粘附作用。当狂犬病毒进入体内后，激活吞噬细胞产生细胞因子抑制病毒的繁殖。
, 百拇医药
经查新证明，利用非复制型痘苗病毒构建RG、RN双表达的重组病毒，这在国际上属首次报道。我们还将扩大实验动物例数，摸索最佳免疫方案，建立检测细胞免疫的细胞毒实验，以进一步评价其有效性和安全性，为将其开发为经济实用的基因工程狂犬疫苗提供实验依据。
基金项目：国家863高科技生物领域及国家自然科学基金部分资助项目(39525001)；湖北省科委重点资助项目(981P0904)
参考文献
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, 百拇医药
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(收稿日期：1999-04-19), 百拇医药