采用二甲基亚砜和右旋糖酐冻存脐血造血细胞的研究
作者：刘斌 廖灿 辜少玲 许遵鹏
单位：刘斌(510180 广州市妇婴医院)；廖灿(510180 广州市妇婴医院)；辜少玲(510180 广州市妇婴医院)；许遵鹏(510180 广州市妇婴医院)
关键词：
中华儿科杂志001016 脐血移植已被广泛地用于治疗各种血液性疾病和恶性肿瘤，临床上主要采用同胞脐血移植和无关供者脐血移植两种形式[1]。前者往往直接将整份脐血冻存，后者供者来源于脐血库，多为经羟乙基淀粉(HES)分离后的有核细胞(NC)[2]。对于保存方法，单用一种冷冻保护剂即使加大剂量也不会增加冷冻效果，反而加大毒性[3]。我们采用合用两种冷冻保护剂冻存整份脐血和分离后有核细胞，以探讨理想的冻存方法来建立脐血库和保存同胞脐血。
材料和方法
, http://www.100md.com
选取足月健康新生儿采集脐血。冷冻保护剂甲为20%二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)、4%人白蛋白，余为RPM重叠640培养液；冷冻保护剂乙为纯DMSO与等体积10%右旋糖酐(Dextran，分子量40 000，美国Baxter公司)混合液[2]。配好后置于冰箱预冷。取20 ml脐血平均分装于20个冷冻管，10管加1 ml保护液甲(方法A)；另10管加0.25 ml保护液乙(方法B， DMSO终浓度10%)。将脐血与1/4体积的60 g/L HES(美国，Dupont Phama公司)混合，分别离心去红细胞和血浆，将体积浓缩至20 ml。[4]平均分装于20个冷冻管，分别加1 ml保护液甲(方法C)和0.25 ml保护液乙(方法D)。标本置于冷冻盒中，在Cryo-10程控降温仪上(英国，Planner公司)以-1℃/min降温至-40℃，而后以-5℃/min降温至-100℃，置于液氮保存。在保存1～10个月后，每月各方法复温1个冷冻管。方法A和C每管依次加入RPMI 1640培养液并混匀[5]，加入量依次为2、4、8和2 ml。 培养液含5%人白蛋白，最后离心去DMSO。方法B和D每管加1.25 ml预冷液体(等体积10%Dextran和5%人白蛋白)，平衡 5min后离心去上清液[2]。
, 百拇医药
检测指标：锥虫蓝拒染法测细胞活率。CD+34细胞的检测[6]：抗体为荧光素藻红蛋白(PE)标记的抗人CD34抗体和荧光素异硫氰酸(FITC)标记的抗人CD45抗体(美国，Pharmigen公司)，用量为10 μl/106细胞，采用FACScan型流式细胞仪(美国，BectonDickshon公司) 检测，将CD+45细胞群设为gate。造血祖细胞体外培养[4]：采用甲基纤维素半固体培养基，包括粒细胞集落刺激因子(200 ng/ ml)、红细胞生成素(1U/ ml)、白细胞介素3(10 ng/ ml)、干细胞因子(50 ng/ ml)。在2 ml体系中加入2×105个活细胞，于37℃、5%CO2条件下培养14 d，分别计数粒单系祖细胞(CFU-GM)、早期红系祖细胞(BFU-E)和混合性集落形成单位(CFU-Mix)，计算CFCs(为三者总和)。
, 百拇医药
采用方差分析和配对t检验分析结果。
结果
冷冻前细胞活率为(96.89±2.59)%，复温后细胞活率均>90%，无明显变化(P>0.05)。方法A～D冷冻前后NC无明显损失(P均>0.05)。四方法冷冻前后CFCs，P>0.05，CD+34细胞，P>0.05。比较方法A和B，在10个月中NC回收率的情况P1～P10均>0.05；同样的方法A、B之间CD+34细胞和CFCs回收率间差异无显著性。检验方法C和D，未发现差异有显著性。
讨论
由于脐血移植易找到供者，移植中只有移植物抗宿主病(GVHD)发生率低且程度低等优点，因而自1989年第1例脐血移植治疗成功以来，共报道了500多例患者接受脐血输注[1]。在输注脐血前必须将采集的脐血冷冻保存，冻存和复温的效果如何直接关系到移植的成败。因此在保存过程中一定要尽量避免造血干、祖细胞的丢失。此外，冻存方法也需经济、简便，这样才利于脐血移植术的推广应用。
, 百拇医药
任何生物细胞、组织的深低温保存都要克服降温过程的损伤。这种损伤主要来自于细胞形成冰晶造成的细胞损伤[3]。目前应用的冷冻保护剂有两种：一种是渗透性试剂，如DMSO等可渗入细胞内，使水份大量溢出细胞；一种是非渗透性试剂，如Dextran等，在细胞外形成高渗，使细胞脱水，从而保护细胞不受冰晶形成的损伤。
保护造血干细胞一般均使用DMSO。而单用DMSO，虽然也有较好的保存效果，但DMSO用量大。一方面DMSO常温下对组织细胞有毒性，须尽可能减少其回输量；另一方面大量使用DMSO成本亦较高。为此有人研究合用DMSO及非渗透性试剂冻存造血干细胞，而HES、Dextran等多是无毒的。经证实DMSO及HES在低温保存骨髓是有效的[7]，Rubstein等[2]应用DMSO及Dextran保存分离后脐血也收到良好的效果，证明合用两类保护剂是可行的。
本组采用DMSO+Dextran两种保护剂保护脐血，经HES分离的NC，该方法有效、成本小，利于建立脐血库，与Rubinstein的结果相似。对整份脐血，除可减少成本外，也利于简化操作。对于一份体积80 ml的脐血，若单用DMSO，保护剂共需80 ml，若合用DMSO、Dextran只需20 ml保护液。对于要严格操作温度和速度的加保护液过程，体积的锐减势必会简化操作过程，同时也缩短复温时间，有利于临床移植。
, 百拇医药
基金项目：广东省科委、广州市科委重点课题，广东省卫生厅“五个一”工程重点课题
参考文献
1，Gluckman E, Rocha V, Boyer-Chammard A, et al.Outcome of cord-blood transplantation from related and unrelated donners. N Engl J Med,1997,337:373-381.
2，Rubinstein P, Dobrila L, Rosenfield RE, et al. Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution. Proc Natl Acad Sci, 1995, 92: 10119-10122.
, 百拇医药
3，刘金刚，刘作斌.低温医学.人民卫生出版社,1993.153-171.
4，刘斌，廖灿，魏佳雪，等.三种不同方法分离脐血造血细胞的比较.中华血液学杂志,1999，5：271.
5，Gluckman E, Broxmeyer HA, Auerbach AD, et al. Hematopoitoietic reconstieution in a patient with Faconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling.N Engl J Med,1989, 321:1174-1178.
6，裴雪涛，王立生，徐黎，等.造血因子对脐血CD+34细胞的体外扩增作用.中华血液学杂志,1996，17：304-307.
7，范华骅，马庆，柏乃庆，等.骨髓、脐血、外周血干细胞-80℃保存研究.中国输血杂志,1998，11：8-9.
收稿日期：1999-07-30, 百拇医药
单位：刘斌(510180 广州市妇婴医院)；廖灿(510180 广州市妇婴医院)；辜少玲(510180 广州市妇婴医院)；许遵鹏(510180 广州市妇婴医院)
关键词：
中华儿科杂志001016 脐血移植已被广泛地用于治疗各种血液性疾病和恶性肿瘤，临床上主要采用同胞脐血移植和无关供者脐血移植两种形式[1]。前者往往直接将整份脐血冻存，后者供者来源于脐血库，多为经羟乙基淀粉(HES)分离后的有核细胞(NC)[2]。对于保存方法，单用一种冷冻保护剂即使加大剂量也不会增加冷冻效果，反而加大毒性[3]。我们采用合用两种冷冻保护剂冻存整份脐血和分离后有核细胞，以探讨理想的冻存方法来建立脐血库和保存同胞脐血。
材料和方法
, http://www.100md.com
选取足月健康新生儿采集脐血。冷冻保护剂甲为20%二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)、4%人白蛋白，余为RPM重叠640培养液；冷冻保护剂乙为纯DMSO与等体积10%右旋糖酐(Dextran，分子量40 000，美国Baxter公司)混合液[2]。配好后置于冰箱预冷。取20 ml脐血平均分装于20个冷冻管，10管加1 ml保护液甲(方法A)；另10管加0.25 ml保护液乙(方法B， DMSO终浓度10%)。将脐血与1/4体积的60 g/L HES(美国，Dupont Phama公司)混合，分别离心去红细胞和血浆，将体积浓缩至20 ml。[4]平均分装于20个冷冻管，分别加1 ml保护液甲(方法C)和0.25 ml保护液乙(方法D)。标本置于冷冻盒中，在Cryo-10程控降温仪上(英国，Planner公司)以-1℃/min降温至-40℃，而后以-5℃/min降温至-100℃，置于液氮保存。在保存1～10个月后，每月各方法复温1个冷冻管。方法A和C每管依次加入RPMI 1640培养液并混匀[5]，加入量依次为2、4、8和2 ml。 培养液含5%人白蛋白，最后离心去DMSO。方法B和D每管加1.25 ml预冷液体(等体积10%Dextran和5%人白蛋白)，平衡 5min后离心去上清液[2]。
, 百拇医药
检测指标：锥虫蓝拒染法测细胞活率。CD+34细胞的检测[6]：抗体为荧光素藻红蛋白(PE)标记的抗人CD34抗体和荧光素异硫氰酸(FITC)标记的抗人CD45抗体(美国，Pharmigen公司)，用量为10 μl/106细胞，采用FACScan型流式细胞仪(美国，BectonDickshon公司) 检测，将CD+45细胞群设为gate。造血祖细胞体外培养[4]：采用甲基纤维素半固体培养基，包括粒细胞集落刺激因子(200 ng/ ml)、红细胞生成素(1U/ ml)、白细胞介素3(10 ng/ ml)、干细胞因子(50 ng/ ml)。在2 ml体系中加入2×105个活细胞，于37℃、5%CO2条件下培养14 d，分别计数粒单系祖细胞(CFU-GM)、早期红系祖细胞(BFU-E)和混合性集落形成单位(CFU-Mix)，计算CFCs(为三者总和)。
, 百拇医药
采用方差分析和配对t检验分析结果。
结果
冷冻前细胞活率为(96.89±2.59)%，复温后细胞活率均>90%，无明显变化(P>0.05)。方法A～D冷冻前后NC无明显损失(P均>0.05)。四方法冷冻前后CFCs，P>0.05，CD+34细胞，P>0.05。比较方法A和B，在10个月中NC回收率的情况P1～P10均>0.05；同样的方法A、B之间CD+34细胞和CFCs回收率间差异无显著性。检验方法C和D，未发现差异有显著性。
讨论
由于脐血移植易找到供者，移植中只有移植物抗宿主病(GVHD)发生率低且程度低等优点，因而自1989年第1例脐血移植治疗成功以来，共报道了500多例患者接受脐血输注[1]。在输注脐血前必须将采集的脐血冷冻保存，冻存和复温的效果如何直接关系到移植的成败。因此在保存过程中一定要尽量避免造血干、祖细胞的丢失。此外，冻存方法也需经济、简便，这样才利于脐血移植术的推广应用。
, 百拇医药
任何生物细胞、组织的深低温保存都要克服降温过程的损伤。这种损伤主要来自于细胞形成冰晶造成的细胞损伤[3]。目前应用的冷冻保护剂有两种：一种是渗透性试剂，如DMSO等可渗入细胞内，使水份大量溢出细胞；一种是非渗透性试剂，如Dextran等，在细胞外形成高渗，使细胞脱水，从而保护细胞不受冰晶形成的损伤。
保护造血干细胞一般均使用DMSO。而单用DMSO，虽然也有较好的保存效果，但DMSO用量大。一方面DMSO常温下对组织细胞有毒性，须尽可能减少其回输量；另一方面大量使用DMSO成本亦较高。为此有人研究合用DMSO及非渗透性试剂冻存造血干细胞，而HES、Dextran等多是无毒的。经证实DMSO及HES在低温保存骨髓是有效的[7]，Rubstein等[2]应用DMSO及Dextran保存分离后脐血也收到良好的效果，证明合用两类保护剂是可行的。
本组采用DMSO+Dextran两种保护剂保护脐血，经HES分离的NC，该方法有效、成本小，利于建立脐血库，与Rubinstein的结果相似。对整份脐血，除可减少成本外，也利于简化操作。对于一份体积80 ml的脐血，若单用DMSO，保护剂共需80 ml，若合用DMSO、Dextran只需20 ml保护液。对于要严格操作温度和速度的加保护液过程，体积的锐减势必会简化操作过程，同时也缩短复温时间，有利于临床移植。
, 百拇医药
基金项目：广东省科委、广州市科委重点课题，广东省卫生厅“五个一”工程重点课题
参考文献
1，Gluckman E, Rocha V, Boyer-Chammard A, et al.Outcome of cord-blood transplantation from related and unrelated donners. N Engl J Med,1997,337:373-381.
2，Rubinstein P, Dobrila L, Rosenfield RE, et al. Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution. Proc Natl Acad Sci, 1995, 92: 10119-10122.
, 百拇医药
3，刘金刚，刘作斌.低温医学.人民卫生出版社,1993.153-171.
4，刘斌，廖灿，魏佳雪，等.三种不同方法分离脐血造血细胞的比较.中华血液学杂志,1999，5：271.
5，Gluckman E, Broxmeyer HA, Auerbach AD, et al. Hematopoitoietic reconstieution in a patient with Faconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling.N Engl J Med,1989, 321:1174-1178.
6，裴雪涛，王立生，徐黎，等.造血因子对脐血CD+34细胞的体外扩增作用.中华血液学杂志,1996，17：304-307.
7，范华骅，马庆，柏乃庆，等.骨髓、脐血、外周血干细胞-80℃保存研究.中国输血杂志,1998，11：8-9.
收稿日期：1999-07-30, 百拇医药