反相高效液相色谱法测定8-氯腺苷含量
作者：孙 昕
单位：安徽医科大学第一附属医院，肿瘤实验室，合肥 230022
关键词：抗肿瘤药；腺苷；色谱法；高压液相
安徽医科大学学报990331 中国图书资料分类法分类号 R979.1
8-氯腺苷(8-Cl-A)作为一种新型有效的抗肿瘤药物而越来越受到人们的重视，它可选择性地作用于肿瘤细胞，抑制其生长而达到抗肿瘤目的〔1〕。本文进行了方法学探索，建立了测定8-Cl-A药物含量的反相高效液相色谱法。
1 实验
1.1 仪器及试剂 Waters高效液相色谱仪，包括：510双泵，U 6 K进样器，484紫外可变波长检测器，810数据工作站。8-Cl-A对照品、8-Cl-A注射液(批号971119，971120，971121)均由南京生物工程医药科技发展有限公司提供。内标物：茶碱Sigma公司产品。甲醇为HPLC级(上海化学试剂站中心化工厂出品)，磷酸二氢钠为GR级。
, 百拇医药
1.2 色谱条件 色谱柱：μBondapak C18(3.9 mm×300 mm)；流动相：0.02 mol.L-1磷酸二氢钠-甲醇(760∶240)，使用前以0.45 μm滤膜过滤；柱温：室温；检测波长：263 nm；0.05AUFS；进样量10 μl。
1.3 实验方法和方法学考查
1.3.1 系统适应性试验 分别取8-Cl-A、内标物茶碱、8-氯腺嘌呤(为8-Cl-A的降解产物)溶液各1.0 ml置同一个10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，进样10 μl，各峰的分离度均大于1.5，理论塔板数按8-Cl-A计算大于2 000。见图1。
1.3.2 线性关系 以8-Cl-A贮备液用流动相配或浓度为2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg.L-1(含内标60 mg.L-1)，取10 μl注入色谱仪，以8-Cl-A与内标的峰面积比值为纵坐标，8-Cl-A浓度为横坐标作标准曲线。回归方程为
=0.0236+1.999 X，r=0.9993
, 百拇医药
1.3.3 精密度、稳定性、回收率试验 精密吸取对照品溶液，重复进样5次，被测物峰面积与内标物峰面积积分比值的RSD为0.88%；于4、8、16、24、48 h对批号为971120测定。计算日内、日间误差，日内<1.28%，日间<2.38%。同时每隔3个月对同一批号针剂测定计算其RSD<3.89%，在批号为971119制得试液中加入8-Cl-A对照品，测定5次，以平均结果计算回收率为99.05%，RSD为2.83%。
图1 8-氯腺苷RP-HPLC色谱分离图
1： 8-氯腺嘌岭， 2： 内标， 3： 8-Cl-A
1.4 测定与结果
1.4.1 对照品和内标物的制备 精密称取经干燥至恒重的8-Cl-A对照品30 mg于50 ml量瓶中，以流动相溶解并稀释至刻度，此液为0.6 g.L-1的8-Cl-A标准贮备液；精取纯茶碱60.0 mg置100 ml量瓶中，以流动相制得0.6 g.L-1内标液。
, 百拇医药
1.4.2 供试品溶液制备 以砂轮锯刀切开安瓿精密量取1.0 ml待测针剂置50 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度摇匀，精取该溶液与内标液各1.0 ml置10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀供测定，同理制备供测的标准系列样品。
1.4.3 测定 分别取对照品及供测品试液10 μl注入色谱仪测定，结果见表1。
含量测定结果(
±s, n=3) 批号
含量(%)
971119
98.66±2.18
971120
99.31±1.66
, http://www.100md.com
971121
99.18±1.88
2 讨论
2.1 最大吸收波长 经紫外全波段扫描，8-Cl-A在254和263处有最大吸收。本方法选择263 nm为测定波长，干扰少且峰形好。
2.2 流动相 甲醇—水，甲醇—0.02 mol.L-1磷酸缓冲液，甲醇—0.174 mol.L-1 HAc。选用甲醇—磷酸盐缓冲体系，峰形尖锐，无拖尾，被测组分与内标物分离度大于2.0。
2.3 取样与样品保存 8-Cl-A针剂样品为一种粘稠状液体，故在精密取样时，建议缓慢操作，以确保分取精确而减少误差。在室温下8-Cl-A的水溶液较不稳定，放置5天，分解约7%～8%，放置10天分解可达15%以上(其中主要分解代谢产物为8-氯腺嘌呤和8-氯肌苷)[2]。故提倡样品保存在冰箱中，我们实验样品日间误差RSD<2.38%。
作者简介：孙 昕，男，38岁，工程师
参考文献
1 方家椿，石永进，彭 敬等.8-氯腺苷的抗肿瘤作用研究，中华肿瘤杂志，1995；17(1)：5～9
2 张慰青，朱卫国，苏玉玲等.RP-HPLC测定血清中8-氯腺苷的浓度.见：卢佩章，张玉奎主编.第十次全国色谱学术报告会文集. 北京：中国化学色谱委员会，1995：422～423
1998-12-24收稿，1999-04-07修回, 百拇医药
单位：安徽医科大学第一附属医院，肿瘤实验室，合肥 230022
关键词：抗肿瘤药；腺苷；色谱法；高压液相
安徽医科大学学报990331 中国图书资料分类法分类号 R979.1
8-氯腺苷(8-Cl-A)作为一种新型有效的抗肿瘤药物而越来越受到人们的重视，它可选择性地作用于肿瘤细胞，抑制其生长而达到抗肿瘤目的〔1〕。本文进行了方法学探索，建立了测定8-Cl-A药物含量的反相高效液相色谱法。
1 实验
1.1 仪器及试剂 Waters高效液相色谱仪，包括：510双泵，U 6 K进样器，484紫外可变波长检测器，810数据工作站。8-Cl-A对照品、8-Cl-A注射液(批号971119，971120，971121)均由南京生物工程医药科技发展有限公司提供。内标物：茶碱Sigma公司产品。甲醇为HPLC级(上海化学试剂站中心化工厂出品)，磷酸二氢钠为GR级。
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1.2 色谱条件 色谱柱：μBondapak C18(3.9 mm×300 mm)；流动相：0.02 mol.L-1磷酸二氢钠-甲醇(760∶240)，使用前以0.45 μm滤膜过滤；柱温：室温；检测波长：263 nm；0.05AUFS；进样量10 μl。
1.3 实验方法和方法学考查
1.3.1 系统适应性试验 分别取8-Cl-A、内标物茶碱、8-氯腺嘌呤(为8-Cl-A的降解产物)溶液各1.0 ml置同一个10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，进样10 μl，各峰的分离度均大于1.5，理论塔板数按8-Cl-A计算大于2 000。见图1。
1.3.2 线性关系 以8-Cl-A贮备液用流动相配或浓度为2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg.L-1(含内标60 mg.L-1)，取10 μl注入色谱仪，以8-Cl-A与内标的峰面积比值为纵坐标，8-Cl-A浓度为横坐标作标准曲线。回归方程为
=0.0236+1.999 X，r=0.9993, 百拇医药
1.3.3 精密度、稳定性、回收率试验 精密吸取对照品溶液，重复进样5次，被测物峰面积与内标物峰面积积分比值的RSD为0.88%；于4、8、16、24、48 h对批号为971120测定。计算日内、日间误差，日内<1.28%，日间<2.38%。同时每隔3个月对同一批号针剂测定计算其RSD<3.89%，在批号为971119制得试液中加入8-Cl-A对照品，测定5次，以平均结果计算回收率为99.05%，RSD为2.83%。
图1 8-氯腺苷RP-HPLC色谱分离图
1： 8-氯腺嘌岭， 2： 内标， 3： 8-Cl-A
1.4 测定与结果
1.4.1 对照品和内标物的制备 精密称取经干燥至恒重的8-Cl-A对照品30 mg于50 ml量瓶中，以流动相溶解并稀释至刻度，此液为0.6 g.L-1的8-Cl-A标准贮备液；精取纯茶碱60.0 mg置100 ml量瓶中，以流动相制得0.6 g.L-1内标液。
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1.4.2 供试品溶液制备 以砂轮锯刀切开安瓿精密量取1.0 ml待测针剂置50 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度摇匀，精取该溶液与内标液各1.0 ml置10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀供测定，同理制备供测的标准系列样品。
1.4.3 测定 分别取对照品及供测品试液10 μl注入色谱仪测定，结果见表1。
含量测定结果(
±s, n=3) 批号含量(%)
971119
98.66±2.18
971120
99.31±1.66
, http://www.100md.com
971121
99.18±1.88
2 讨论
2.1 最大吸收波长 经紫外全波段扫描，8-Cl-A在254和263处有最大吸收。本方法选择263 nm为测定波长，干扰少且峰形好。
2.2 流动相 甲醇—水，甲醇—0.02 mol.L-1磷酸缓冲液，甲醇—0.174 mol.L-1 HAc。选用甲醇—磷酸盐缓冲体系，峰形尖锐，无拖尾，被测组分与内标物分离度大于2.0。
2.3 取样与样品保存 8-Cl-A针剂样品为一种粘稠状液体，故在精密取样时，建议缓慢操作，以确保分取精确而减少误差。在室温下8-Cl-A的水溶液较不稳定，放置5天，分解约7%～8%，放置10天分解可达15%以上(其中主要分解代谢产物为8-氯腺嘌呤和8-氯肌苷)[2]。故提倡样品保存在冰箱中，我们实验样品日间误差RSD<2.38%。
作者简介：孙 昕，男，38岁，工程师
参考文献
1 方家椿，石永进，彭 敬等.8-氯腺苷的抗肿瘤作用研究，中华肿瘤杂志，1995；17(1)：5～9
2 张慰青，朱卫国，苏玉玲等.RP-HPLC测定血清中8-氯腺苷的浓度.见：卢佩章，张玉奎主编.第十次全国色谱学术报告会文集. 北京：中国化学色谱委员会，1995：422～423
1998-12-24收稿，1999-04-07修回, 百拇医药