NO和iNOS在内毒素诱导的大鼠急性肺损伤的作用及大黄对其影响
作者：李春盛 桂培春 何新华 杨红
单位：李春盛(北京军区总医院急诊科，100700)；桂培春(北京军区总医院急诊科，100700)；何新华(北京军区总医院急诊科，100700)；杨红(北京军区总医院急诊科，100700)
关键词：一氧化氮(NO)；诱导型一氧化氮合酶(iNOS)；急性肺损伤；内毒素；大黄；地塞米松
摘 要摘 要：目的 主要探讨一氧化氮(NO)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在内毒素(LPS)诱导的大鼠急性肺损伤(ALI)的作用机制及大黄对其影响。方法 在雄性Wistar大鼠利用舌下静脉注射LPS复制ALI动物模型，动物分为4组：LPS组、对照组、大黄治疗组、地塞米松组。观察大体标本，组织病理以及生物学标志：肺湿/干重比、肺泡灌洗液中性粒细胞比、蛋白含量、肺血管通透性和肺泡通透性指数。同时测定血浆NO和肺组织匀浆iNOS活性。结果 LPS组与对照组相比，肺组织病理显示肺间质及肺泡明显损伤和细胞浸润。其生物学标志均显著升高(P<0.01)，NO和iNOS也显著升高(P<0.01)，地塞米松和大黄干预治疗组则表现组织病理明显减轻。上述肺损伤生物标记物及NO、iNOS也相应下降(P<0.05)。结论 在LPS诱导的ALI大鼠动物模型中证明NO和iNOS在ALI的发病过程中起到较为关键性的作用，用地塞米松、大黄进行干预治疗，可使损伤减轻相应地也使NO、iNOS浓度下降，表明这2种药物对LPS诱导的ALI具有保护作用，其机制可能是通过抑制NO和iNOS活性实现。
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中图分类号：R 563；R 28 文献标识码：A
文章编号：1002-1949(2000)02-0065-04
Actions of NO and iNOS on endotoxin induced rat acute lung injury and affection of rhubarb on them
LI Chun-sheng
(Beijing General Hospital of PLA,Beijing 100700,China)
GUI Pei-chun
(Beijing General Hospital of PLA,Beijing 100700,China)
, 百拇医药
HE Xin-hua
(Beijing General Hospital of PLA,Beijing 100700,China)
Abstract：Objective To approach mainly the actions of nitric oxide(NO)and inducible nitric oxide synthase (iNOS) on endotoxin (lipopolysaccharidePaO2<6.7kPa,LPS)induced rat acute lung injury (ALI) and the affeciton of rhubarb on them.Methods LPS was injected into the subingual vein of male Wistar rats to prepare ALI animal models.The rats were divided into the 4 groups:LPS group,control group,rhubarb group and dexamethasone group.Macroscopic and histopathological examinations were performed and biological indexes were measured for the lung specimens.The indexes included lung wet weight/dry weight,the rats of neutrophils and protein content in the pulmonary alveolar lavage fluid,pulmonary vascular permeability and pulmonary alveolar permeability index.In the mean time,the activities of serum NO and lung tissue homogenate iNOS were measured.Results In the comparison of the lung histopathological examination between the LPS group and control group,the injury and cellular infiltration in the pulmonary stroma and alveoli were more prominent in the LPS group than in the control group.Lung wet weight/dry weight,rat of neutrophils,protein content,pulmonary alveolar permeability index,pulmonary vascular permeability were significantly increased (P<0.01);NO and iNOS were also markedly elevated (P<0.01).In the groups with dexamethasone and rhubarb intering treatment,the histopathological changes were singnificantly milder,and the above biological indexes of lung injury and the contents of NO and iNOS were correspondingly decreased (P<0.05).Conclusions From the LPS induced ALI rat models,it is demonstrated that NO and iNOS play important roles in the onset of ALI:dexamethasone and rhubarb interfering treatment can ameliorate,the lung injury and decrease the concentrations of NO and iNOS,showing that these 2 agents have protective effect on LPS induced ALI and their therapeutic mecharnism is possibly through inhibiting the activities of NO and iNOS.
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Key words：Nitric oxide(NO)； lnducible nitric oxide synthase (iNOS)； Acute lung injury (ALI)； Endotoxin； Rhubarb； Dexamethasone▲
目前，感染、创伤、术后等疾病的并发症和致死原因主要为急性肺损伤(ALI)，进而发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，而革兰氏阴性杆菌所产生的内毒素(LPS)介导的炎性细胞如吞噬细胞、中性粒细胞以及致伤内皮细胞产生释放的大量促炎因子(proinf lammatory cytokines)、炎性介质、趋化因子、生长因子在这些过程中起关键的作用[1]。一氧化氮(NO)是内皮依赖性舒张因子的重要活性成分，在炎症反应时，在LPS和细胞因子(如TNF-α)刺激下生成诱导型NO合酶(iNOS)，合成大量的NO[2]。NO具有调节血管张力，调节炎性细胞与内皮细胞间的相互作用，减少血小板聚集，抑制血小板、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞与内皮细胞的粘附，因而NO具有抗炎作用。另外NO还抑制中性粒细胞在肺组织聚集，维护肺血管内皮依赖性舒张功能[1，3，4]。我们的早期研究结果证明，中药大黄对LPS诱导大鼠急性肺损伤(ALI)具有明显的保护作用[5]。为了进一步探讨其机制，本实验目的旨在探讨NO和iNOS在大黄治疗LPS诱导的ALI的作用机制。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物模型 动物雄性Wistar大鼠(200～350 g)共160只，购自中国预防医学科学院流行病研究所实验动物部。称重后，用乌拉坦1.2 g/kg体重腹腔内注射麻醉后，舌下静脉注射LPS 5 mg/kg体重(LPS 055 B5 Sigma Co)，复制ALI模型。动物分组：①对照组(NS)：舌下静脉注射生理盐水(石家庄第四制药厂)，2小时后采集标本。②ALI组：注射LPS后2小时采集标本。③大黄组(H)：腹腔内注射大黄提取液(本院中药制剂室提取，每毫升含生药1 g)20 g/kg体重，1小时后注射LPS，2小时后采集标本。④地塞米松组(D)：腹腔注射地塞米松(连云港正大天晴制药有限公司)70 mg/kg体重，1小时后注射LPS，2小时后采集标本。
1.2 组织学检查 每组各取5只动物肺少许，经10%甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色后用普通光学显微镜观察，并在此基础上再取肺组织制成1 mm3大小，用25%戊二醛溶液固定，然后固定于1%OsO4液中，乙醇、丙酮脱水，经EPON81包埋，制备超薄切片后行轴-铅双重染色，用philips EM 400T型透射电镜观察。
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1.3 肺组织湿重/干重比及肺泡灌洗液中细胞计数比、蛋白含量测定
开胸取出肺脏，称湿重后，置烤箱(80℃，20 h)烤至恒重，称干重，计算湿/干重比，另一批大鼠开胸后行肺泡灌洗，灌洗液在显微镜下计数细胞总数，细胞分类。用Lowry法测定蛋白含量。计算肺通透指数(肺泡灌洗液蛋白/血浆蛋白，LPI)。
1.4 肺血管通透性变化
各组动物在给药后，均在注射LPS同时股静脉注Evans蓝(50 mg/kg)，将动物开胸后取出肺脏，剪去周围组织，将肺浸泡于甲酰胺溶液中(甲酰胺用量按动物体重20 mg/100 g)，置45～50℃温箱中温育72小时，待组织中色素全部浸出，取出组织，离心，取上清液，用72型分光光度计入620 nm进行比色，根据标准曲线计算Evans蓝含量来测定肺血管通透性的变化。
1.5 NO测定
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NO测试盒购自邦定公司。取血清或血浆0.1 ml加0.6 ml试剂混匀，加双蒸水0.4 ml，混匀，加0.1 ml D试剂(4%氢氧化钠)混匀，冰上孵育60分钟，12 000转离心2分钟，取上清0.6 ml加0.4 ml双蒸水及0.1 ml A试剂(0.3%磺胺)冰上孵育15分钟，之后加0.1 ml B试剂(6 mmol/L茶乙烯二胺盐酸盐)，室温放置1小时，545 nm比色，读OD值。以亚硝酸钠为标准品，制作标准曲线。根据样品OD值，按标准曲线计算NO含量。
1.6 肺组织iNOS活性的测定
大鼠断头，速取左肺，按1：5(W/V)加入预冷的提取液，冰浴中匀浆，4℃，20 000 g离心60 min，收集上清液，即NOS提取液，用Lawrys测定NOS提取液蛋白浓度，H-精氨酸转化实验测定提取液NOS活性，以每分钟每毫克蛋白生成H-胍氨酸的pmol数表示。
2 结果
, 百拇医药
2.1 大黄和地塞米松对肺湿/干重比、中性粒细胞比、蛋白含量的影响及与LPS致伤组的比较
LPS致伤组肺湿/干重比、中性粒细胞比、蛋白含量均较对照组显著增加(P<0.01)；大黄、地塞米松治疗肺湿/干重比、中性粒细胞比、蛋白含量较LPS致伤组显著降低(P<0.05，P<0.01)。表明LPS可使鼠肺水增多，蛋白含量多，促使中性粒细胞在肺内聚集，符合ALI的病理特征。用大黄和地塞米松干预治疗后使这些指标显著下降，证明这些药物对ALI有治疗作用。
表1 肺湿/干重比和肺泡灌洗液中性粒细胞比、蛋白含量的变化
肺湿/干重比
中性粒细胞比%
蛋白含量μg/mg
n
±s
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n±s
n±s
LPS组
11
4.47±0.14
6
49.21±8.52
6
, 百拇医药
240.33±109.67
NS组
11
4.18±0.28**
6
23.29±9.84**
6
62.17±19.13**
D组
11
4.22±0.16**
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5
30.71±15.66*
5
116.00±38.47*
H组
10
4.24±0.14**
6
37.28±8.72*
5
83.20±45.6**
, 百拇医药
*P<0.05；**P<0.01
2.2 大黄、地塞米松对ALI时肺泡通透指数及血管通透性的影响
LPS致鼠急性肺损伤时肺泡通透指数肺血管通透性显著高于对照组(P<0.01)，表明致伤组肺水增多，肺泡灌洗液蛋白增多是由于肺血管、肺泡通透增加引起，证明LPS可使肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞均受损伤，这亦是ALI的显著病理改变之一。经大黄、地塞米松治疗后，上述两项指标较LPS组明显下降(P<0.05，P<0.01)。表明这2种药物对肺泡通透指数和肺血管通透性这二个病理过程有明显的抑制作用(见表2)。
表2 ALI时肺泡通透指数、血管通透性与NS组、D组、H组的比较
肺泡通透指数(10-3)
肺血管通透性μg/ml
, 百拇医药
n±s
n±s
LPS组
6
4.78±1.90
6
6.08±0.73
NS组
, 百拇医药
6
1.90±0.28**
6
2.7±0.78**
D组
5
2.88±0.19*
6
3.9±0.78**
H组
5
1.59±0.52**
, 百拇医药
5
3.42±1.25**
*P<0.05；**P<0.01
2.3 大黄、地塞米松对ALI血浆NO和肺组织iNOS的影响
研究结果表明，LPS致伤组血清NO和肺组织iNOS浓度明显高于对照组(P<0.05，P<0.01)，说明LPS可刺激NO大量产生并释放进入血循环，并使肺组织产生iNOS增加，这可能是NO升高的原因之一，应用大黄、地塞米松进行治疗干预其血浆NO水平及肺组织的iNOS浓度较LPS组明显降低(P<0.01，P<0.05)，提示这2种药物可能有抑制肺组织iNOS的作用(见表3)。
表3 ALI时NO、iNOS浓度与对照组、D组、H组的比较
, 百拇医药 血浆NO μg/ml
肺组织iNOS活性pmol mg/蛋白/分
n±s
n±s
LPS组
6
3.12±0.88
7
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109.87±50.28
NS组
6
2.10±0.34*
7
37.25±12.10**
D组
7
1.26±0.69**
5
40.77±6.19*
, 百拇医药
H组
7
1.65±0.97*
5
49.50±13.46*
*P<0.05；**P<0.01
2.4 大黄、地塞米松对LPS致ALI的组织病理学改变
大体标本：LPS致伤组整个肺充血，部分可见斑片状坏死。地塞米松和大黄组肺表面充血较LPS组明显减轻，亦无斑片状坏死。
普通光镜观察：LPS组肺间质弥漫性出血，肺泡腔内可见大量红细胞渗出和灶性淋巴细胞浸润。对照组可见肺毛细血管轻度扩张充血，小灶性肺泡萎陷及膨胀。地塞米松组终末细支气管腔内可见少许淡粉染样物，局灶性淋巴细胞聚集，肺泡膨胀，部分形成肺大泡。大黄组仅见散在的肺泡膨胀。
, 百拇医药
3 讨论
NO是一种内皮松驰因子，就其本身而言是一种自由基。现已证明由肺血管内皮细胞产生，是肺血管张力的重要调节物质，故临床用于治疗肺动脉高压、ARDS以及支气管哮喘[2～4]。在正常的肺内，NO作为第二信使主要由一氧化氮合酶(NOS)生成，NOS有三种：原生型(nNOS)、内皮型(enNOS)，主要在气道上皮细胞、肺血管内皮细胞；第三种为诱导型(iNos)，可在许多细胞被诱导以对炎性细胞因子和LPS触发作出反应[2，4]。目前，关于NO和iNOS对ALI的发病作用仍存在着争议。NO能抑制中性粒细胞迁移并在减轻急性肺损伤时起有益作用[4]。Luvone报告[7]NO在体内外抑制LPS诱导的TNF-α释放，从而减轻肺损伤。在ALI时应用iNOS抑制剂使肺水增加，加剧肺损伤，由此证明iNOS是有益的。但是，另有报道指出，在人和动物的脓毒症并发急性肺损伤时，许多类型的肺细胞iNOS表达，产生大量的NO使肺损伤加重或在肺损伤的发病过程中起重要的作用。注入NOS抑制剂可减轻由LPS血症导致的肺损伤和微血管渗漏[7]，因而认为NO和iNOS对肺损伤是有害的。基于以上的争议，我们研究了NO和iNOS在LPS诱导大鼠ALI的作用，结果发现NO和iNOS较对照组显著升高，与之相一致的则是代表肺泡和毛细血管屏障受损所致的肺泡灌洗液中蛋白的浓度和中性粒细胞比例也相应增加，肺湿/干重比、肺血管通透性、肺泡通透性指数均增加，这些肺损伤的标志物的显著增加与组织病理学表现也相一致[8]。提示NO和iNOS在LPS诱导的ALI的发病过程中起着关键性的作用。有证据表明NO可促使中性粒细胞与内皮细胞相互作用，iNOS表达加剧ALI的机制是通过由炎性细胞产生的细胞因子。并且iNOS表达通过影响炎性细胞粘附于肺血管内皮细胞加剧ALI最终导致血管渗漏和肺水肿。Kristo F等[7]证明在缺乏iNOS基因的大鼠显示较轻的肺损伤，由此证明由iNOS表达产生大量的NO是导致肺损伤的主要发病机制。
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另外，为了进一步阐明NO对肺泡及血管内皮的屏障作用的损害，对其相关性进行了分析。结果发现虽然NO与肺血管通透性(r=0.67，P>0.05)，NO与肺泡通透指数(r=0.54，P>0.05)未有显著性差异，这可能是由于例数少的缘故，但已表明一种趋势，NO与肺泡通透指数、肺血管通透性是有一定关系的。这可以说明ALI时毛细血管渗漏、肺水肿白细胞浸润等病理表现是与NO升高有一定关系的。NO与iNOS二者相关系数(r=0.125)较低，这可能是由于NOS有三种结构，除iNOS外还有nNOS、enNOS,NO不仅仅是由iNOS产生的缘故。
应用大黄和地塞米松对LPS诱导的ALI进行了干预治疗，结果显示二种药物均可使ALI的肺湿/干重比、肺泡灌洗液中的中性粒细胞比、蛋白量、肺泡通透指数、肺毛细血管通透性等肺损伤标志均较LPS致伤组明显改善，肺组织病理也相应明显较LPS致伤组显著减轻。与这些变化相适应的是NO和iNOS也较LPS致伤组显著降低。由此可以认为2种药物对LPS导致的ALI具有保护和治疗作用。地塞米松为糖皮质激素，糖皮质激素对LPS诱导的致炎介质释放有强大的抑制作用[9]，有人利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术证明地塞米松对iNOS基因mRNA表达量明显减少，且具有剂量相关性，提示抑制基因转录是地塞米松抑制NO释放的机制之一。同时地塞米松也抑制TNF-α的基因表达[10]，因而在地塞米松治疗组表现为NO iNOS的下降可能与此机制有关。
, 百拇医药
中药大黄具有通里攻下、清热解毒、活血化瘀的作用，中医治疗肺热气喘通常用大黄为主的方剂往往取得较好的疗效，用以大黄为主的制剂治疗重症胰腺炎取得显著疗效[11]，而重症胰腺炎首要的并发症是ALI和ARDS，因此在内毒素诱导的ALI大鼠应用大黄对其进行干预治疗显示大黄不但使ALI的生物标记指标显著下降，NO iNOS也显著下降。由此推测是否大黄具有某种抑制iNOS的作用。关于此问题需要进一步通过分子生物学研究加以证实。
综上所述，研究证明NO和iNOS在LPS诱导的ALI的发病过程中确实起到较为关键性的作用，大黄、地塞米松对LPS诱导的ALI具有保护作用，其机制可能是通过抑制NO和iNOS活性实现的。■
参考文献：
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[11]王浴生，邓文龙，薛春生，主编.中药药理与应用[M].第二版.北京：人民卫生出版社，1998.70-80.
收稿日期：1999-10-13
修回日期：1999-11-25, 百拇医药
单位：李春盛(北京军区总医院急诊科，100700)；桂培春(北京军区总医院急诊科，100700)；何新华(北京军区总医院急诊科，100700)；杨红(北京军区总医院急诊科，100700)
关键词：一氧化氮(NO)；诱导型一氧化氮合酶(iNOS)；急性肺损伤；内毒素；大黄；地塞米松
摘 要摘 要：目的 主要探讨一氧化氮(NO)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在内毒素(LPS)诱导的大鼠急性肺损伤(ALI)的作用机制及大黄对其影响。方法 在雄性Wistar大鼠利用舌下静脉注射LPS复制ALI动物模型，动物分为4组：LPS组、对照组、大黄治疗组、地塞米松组。观察大体标本，组织病理以及生物学标志：肺湿/干重比、肺泡灌洗液中性粒细胞比、蛋白含量、肺血管通透性和肺泡通透性指数。同时测定血浆NO和肺组织匀浆iNOS活性。结果 LPS组与对照组相比，肺组织病理显示肺间质及肺泡明显损伤和细胞浸润。其生物学标志均显著升高(P<0.01)，NO和iNOS也显著升高(P<0.01)，地塞米松和大黄干预治疗组则表现组织病理明显减轻。上述肺损伤生物标记物及NO、iNOS也相应下降(P<0.05)。结论 在LPS诱导的ALI大鼠动物模型中证明NO和iNOS在ALI的发病过程中起到较为关键性的作用，用地塞米松、大黄进行干预治疗，可使损伤减轻相应地也使NO、iNOS浓度下降，表明这2种药物对LPS诱导的ALI具有保护作用，其机制可能是通过抑制NO和iNOS活性实现。
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中图分类号：R 563；R 28 文献标识码：A
文章编号：1002-1949(2000)02-0065-04
Actions of NO and iNOS on endotoxin induced rat acute lung injury and affection of rhubarb on them
LI Chun-sheng
(Beijing General Hospital of PLA,Beijing 100700,China)
GUI Pei-chun
(Beijing General Hospital of PLA,Beijing 100700,China)
, 百拇医药
HE Xin-hua
(Beijing General Hospital of PLA,Beijing 100700,China)
Abstract：Objective To approach mainly the actions of nitric oxide(NO)and inducible nitric oxide synthase (iNOS) on endotoxin (lipopolysaccharidePaO2<6.7kPa,LPS)induced rat acute lung injury (ALI) and the affeciton of rhubarb on them.Methods LPS was injected into the subingual vein of male Wistar rats to prepare ALI animal models.The rats were divided into the 4 groups:LPS group,control group,rhubarb group and dexamethasone group.Macroscopic and histopathological examinations were performed and biological indexes were measured for the lung specimens.The indexes included lung wet weight/dry weight,the rats of neutrophils and protein content in the pulmonary alveolar lavage fluid,pulmonary vascular permeability and pulmonary alveolar permeability index.In the mean time,the activities of serum NO and lung tissue homogenate iNOS were measured.Results In the comparison of the lung histopathological examination between the LPS group and control group,the injury and cellular infiltration in the pulmonary stroma and alveoli were more prominent in the LPS group than in the control group.Lung wet weight/dry weight,rat of neutrophils,protein content,pulmonary alveolar permeability index,pulmonary vascular permeability were significantly increased (P<0.01);NO and iNOS were also markedly elevated (P<0.01).In the groups with dexamethasone and rhubarb intering treatment,the histopathological changes were singnificantly milder,and the above biological indexes of lung injury and the contents of NO and iNOS were correspondingly decreased (P<0.05).Conclusions From the LPS induced ALI rat models,it is demonstrated that NO and iNOS play important roles in the onset of ALI:dexamethasone and rhubarb interfering treatment can ameliorate,the lung injury and decrease the concentrations of NO and iNOS,showing that these 2 agents have protective effect on LPS induced ALI and their therapeutic mecharnism is possibly through inhibiting the activities of NO and iNOS.
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Key words：Nitric oxide(NO)； lnducible nitric oxide synthase (iNOS)； Acute lung injury (ALI)； Endotoxin； Rhubarb； Dexamethasone▲
目前，感染、创伤、术后等疾病的并发症和致死原因主要为急性肺损伤(ALI)，进而发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，而革兰氏阴性杆菌所产生的内毒素(LPS)介导的炎性细胞如吞噬细胞、中性粒细胞以及致伤内皮细胞产生释放的大量促炎因子(proinf lammatory cytokines)、炎性介质、趋化因子、生长因子在这些过程中起关键的作用[1]。一氧化氮(NO)是内皮依赖性舒张因子的重要活性成分，在炎症反应时，在LPS和细胞因子(如TNF-α)刺激下生成诱导型NO合酶(iNOS)，合成大量的NO[2]。NO具有调节血管张力，调节炎性细胞与内皮细胞间的相互作用，减少血小板聚集，抑制血小板、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞与内皮细胞的粘附，因而NO具有抗炎作用。另外NO还抑制中性粒细胞在肺组织聚集，维护肺血管内皮依赖性舒张功能[1，3，4]。我们的早期研究结果证明，中药大黄对LPS诱导大鼠急性肺损伤(ALI)具有明显的保护作用[5]。为了进一步探讨其机制，本实验目的旨在探讨NO和iNOS在大黄治疗LPS诱导的ALI的作用机制。
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1 材料与方法
1.1 动物模型 动物雄性Wistar大鼠(200～350 g)共160只，购自中国预防医学科学院流行病研究所实验动物部。称重后，用乌拉坦1.2 g/kg体重腹腔内注射麻醉后，舌下静脉注射LPS 5 mg/kg体重(LPS 055 B5 Sigma Co)，复制ALI模型。动物分组：①对照组(NS)：舌下静脉注射生理盐水(石家庄第四制药厂)，2小时后采集标本。②ALI组：注射LPS后2小时采集标本。③大黄组(H)：腹腔内注射大黄提取液(本院中药制剂室提取，每毫升含生药1 g)20 g/kg体重，1小时后注射LPS，2小时后采集标本。④地塞米松组(D)：腹腔注射地塞米松(连云港正大天晴制药有限公司)70 mg/kg体重，1小时后注射LPS，2小时后采集标本。
1.2 组织学检查 每组各取5只动物肺少许，经10%甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色后用普通光学显微镜观察，并在此基础上再取肺组织制成1 mm3大小，用25%戊二醛溶液固定，然后固定于1%OsO4液中，乙醇、丙酮脱水，经EPON81包埋，制备超薄切片后行轴-铅双重染色，用philips EM 400T型透射电镜观察。
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1.3 肺组织湿重/干重比及肺泡灌洗液中细胞计数比、蛋白含量测定
开胸取出肺脏，称湿重后，置烤箱(80℃，20 h)烤至恒重，称干重，计算湿/干重比，另一批大鼠开胸后行肺泡灌洗，灌洗液在显微镜下计数细胞总数，细胞分类。用Lowry法测定蛋白含量。计算肺通透指数(肺泡灌洗液蛋白/血浆蛋白，LPI)。
1.4 肺血管通透性变化
各组动物在给药后，均在注射LPS同时股静脉注Evans蓝(50 mg/kg)，将动物开胸后取出肺脏，剪去周围组织，将肺浸泡于甲酰胺溶液中(甲酰胺用量按动物体重20 mg/100 g)，置45～50℃温箱中温育72小时，待组织中色素全部浸出，取出组织，离心，取上清液，用72型分光光度计入620 nm进行比色，根据标准曲线计算Evans蓝含量来测定肺血管通透性的变化。
1.5 NO测定
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NO测试盒购自邦定公司。取血清或血浆0.1 ml加0.6 ml试剂混匀，加双蒸水0.4 ml，混匀，加0.1 ml D试剂(4%氢氧化钠)混匀，冰上孵育60分钟，12 000转离心2分钟，取上清0.6 ml加0.4 ml双蒸水及0.1 ml A试剂(0.3%磺胺)冰上孵育15分钟，之后加0.1 ml B试剂(6 mmol/L茶乙烯二胺盐酸盐)，室温放置1小时，545 nm比色，读OD值。以亚硝酸钠为标准品，制作标准曲线。根据样品OD值，按标准曲线计算NO含量。
1.6 肺组织iNOS活性的测定
大鼠断头，速取左肺，按1：5(W/V)加入预冷的提取液，冰浴中匀浆，4℃，20 000 g离心60 min，收集上清液，即NOS提取液，用Lawrys测定NOS提取液蛋白浓度，H-精氨酸转化实验测定提取液NOS活性，以每分钟每毫克蛋白生成H-胍氨酸的pmol数表示。
2 结果
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2.1 大黄和地塞米松对肺湿/干重比、中性粒细胞比、蛋白含量的影响及与LPS致伤组的比较
LPS致伤组肺湿/干重比、中性粒细胞比、蛋白含量均较对照组显著增加(P<0.01)；大黄、地塞米松治疗肺湿/干重比、中性粒细胞比、蛋白含量较LPS致伤组显著降低(P<0.05，P<0.01)。表明LPS可使鼠肺水增多，蛋白含量多，促使中性粒细胞在肺内聚集，符合ALI的病理特征。用大黄和地塞米松干预治疗后使这些指标显著下降，证明这些药物对ALI有治疗作用。
表1 肺湿/干重比和肺泡灌洗液中性粒细胞比、蛋白含量的变化
肺湿/干重比
中性粒细胞比%
蛋白含量μg/mg
n
±s, http://www.100md.com
n
±sn
±sLPS组
11
4.47±0.14
6
49.21±8.52
6
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240.33±109.67
NS组
11
4.18±0.28**
6
23.29±9.84**
6
62.17±19.13**
D组
11
4.22±0.16**
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5
30.71±15.66*
5
116.00±38.47*
H组
10
4.24±0.14**
6
37.28±8.72*
5
83.20±45.6**
, 百拇医药
*P<0.05；**P<0.01
2.2 大黄、地塞米松对ALI时肺泡通透指数及血管通透性的影响
LPS致鼠急性肺损伤时肺泡通透指数肺血管通透性显著高于对照组(P<0.01)，表明致伤组肺水增多，肺泡灌洗液蛋白增多是由于肺血管、肺泡通透增加引起，证明LPS可使肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞均受损伤，这亦是ALI的显著病理改变之一。经大黄、地塞米松治疗后，上述两项指标较LPS组明显下降(P<0.05，P<0.01)。表明这2种药物对肺泡通透指数和肺血管通透性这二个病理过程有明显的抑制作用(见表2)。
表2 ALI时肺泡通透指数、血管通透性与NS组、D组、H组的比较
肺泡通透指数(10-3)
肺血管通透性μg/ml
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n
±sn
±sLPS组
6
4.78±1.90
6
6.08±0.73
NS组
, 百拇医药
6
1.90±0.28**
6
2.7±0.78**
D组
5
2.88±0.19*
6
3.9±0.78**
H组
5
1.59±0.52**
, 百拇医药
5
3.42±1.25**
*P<0.05；**P<0.01
2.3 大黄、地塞米松对ALI血浆NO和肺组织iNOS的影响
研究结果表明，LPS致伤组血清NO和肺组织iNOS浓度明显高于对照组(P<0.05，P<0.01)，说明LPS可刺激NO大量产生并释放进入血循环，并使肺组织产生iNOS增加，这可能是NO升高的原因之一，应用大黄、地塞米松进行治疗干预其血浆NO水平及肺组织的iNOS浓度较LPS组明显降低(P<0.01，P<0.05)，提示这2种药物可能有抑制肺组织iNOS的作用(见表3)。
表3 ALI时NO、iNOS浓度与对照组、D组、H组的比较
, 百拇医药 血浆NO μg/ml
肺组织iNOS活性pmol mg/蛋白/分
n
±sn
±sLPS组
6
3.12±0.88
7
, http://www.100md.com
109.87±50.28
NS组
6
2.10±0.34*
7
37.25±12.10**
D组
7
1.26±0.69**
5
40.77±6.19*
, 百拇医药
H组
7
1.65±0.97*
5
49.50±13.46*
*P<0.05；**P<0.01
2.4 大黄、地塞米松对LPS致ALI的组织病理学改变
大体标本：LPS致伤组整个肺充血，部分可见斑片状坏死。地塞米松和大黄组肺表面充血较LPS组明显减轻，亦无斑片状坏死。
普通光镜观察：LPS组肺间质弥漫性出血，肺泡腔内可见大量红细胞渗出和灶性淋巴细胞浸润。对照组可见肺毛细血管轻度扩张充血，小灶性肺泡萎陷及膨胀。地塞米松组终末细支气管腔内可见少许淡粉染样物，局灶性淋巴细胞聚集，肺泡膨胀，部分形成肺大泡。大黄组仅见散在的肺泡膨胀。
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3 讨论
NO是一种内皮松驰因子，就其本身而言是一种自由基。现已证明由肺血管内皮细胞产生，是肺血管张力的重要调节物质，故临床用于治疗肺动脉高压、ARDS以及支气管哮喘[2～4]。在正常的肺内，NO作为第二信使主要由一氧化氮合酶(NOS)生成，NOS有三种：原生型(nNOS)、内皮型(enNOS)，主要在气道上皮细胞、肺血管内皮细胞；第三种为诱导型(iNos)，可在许多细胞被诱导以对炎性细胞因子和LPS触发作出反应[2，4]。目前，关于NO和iNOS对ALI的发病作用仍存在着争议。NO能抑制中性粒细胞迁移并在减轻急性肺损伤时起有益作用[4]。Luvone报告[7]NO在体内外抑制LPS诱导的TNF-α释放，从而减轻肺损伤。在ALI时应用iNOS抑制剂使肺水增加，加剧肺损伤，由此证明iNOS是有益的。但是，另有报道指出，在人和动物的脓毒症并发急性肺损伤时，许多类型的肺细胞iNOS表达，产生大量的NO使肺损伤加重或在肺损伤的发病过程中起重要的作用。注入NOS抑制剂可减轻由LPS血症导致的肺损伤和微血管渗漏[7]，因而认为NO和iNOS对肺损伤是有害的。基于以上的争议，我们研究了NO和iNOS在LPS诱导大鼠ALI的作用，结果发现NO和iNOS较对照组显著升高，与之相一致的则是代表肺泡和毛细血管屏障受损所致的肺泡灌洗液中蛋白的浓度和中性粒细胞比例也相应增加，肺湿/干重比、肺血管通透性、肺泡通透性指数均增加，这些肺损伤的标志物的显著增加与组织病理学表现也相一致[8]。提示NO和iNOS在LPS诱导的ALI的发病过程中起着关键性的作用。有证据表明NO可促使中性粒细胞与内皮细胞相互作用，iNOS表达加剧ALI的机制是通过由炎性细胞产生的细胞因子。并且iNOS表达通过影响炎性细胞粘附于肺血管内皮细胞加剧ALI最终导致血管渗漏和肺水肿。Kristo F等[7]证明在缺乏iNOS基因的大鼠显示较轻的肺损伤，由此证明由iNOS表达产生大量的NO是导致肺损伤的主要发病机制。
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另外，为了进一步阐明NO对肺泡及血管内皮的屏障作用的损害，对其相关性进行了分析。结果发现虽然NO与肺血管通透性(r=0.67，P>0.05)，NO与肺泡通透指数(r=0.54，P>0.05)未有显著性差异，这可能是由于例数少的缘故，但已表明一种趋势，NO与肺泡通透指数、肺血管通透性是有一定关系的。这可以说明ALI时毛细血管渗漏、肺水肿白细胞浸润等病理表现是与NO升高有一定关系的。NO与iNOS二者相关系数(r=0.125)较低，这可能是由于NOS有三种结构，除iNOS外还有nNOS、enNOS,NO不仅仅是由iNOS产生的缘故。
应用大黄和地塞米松对LPS诱导的ALI进行了干预治疗，结果显示二种药物均可使ALI的肺湿/干重比、肺泡灌洗液中的中性粒细胞比、蛋白量、肺泡通透指数、肺毛细血管通透性等肺损伤标志均较LPS致伤组明显改善，肺组织病理也相应明显较LPS致伤组显著减轻。与这些变化相适应的是NO和iNOS也较LPS致伤组显著降低。由此可以认为2种药物对LPS导致的ALI具有保护和治疗作用。地塞米松为糖皮质激素，糖皮质激素对LPS诱导的致炎介质释放有强大的抑制作用[9]，有人利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术证明地塞米松对iNOS基因mRNA表达量明显减少，且具有剂量相关性，提示抑制基因转录是地塞米松抑制NO释放的机制之一。同时地塞米松也抑制TNF-α的基因表达[10]，因而在地塞米松治疗组表现为NO iNOS的下降可能与此机制有关。
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中药大黄具有通里攻下、清热解毒、活血化瘀的作用，中医治疗肺热气喘通常用大黄为主的方剂往往取得较好的疗效，用以大黄为主的制剂治疗重症胰腺炎取得显著疗效[11]，而重症胰腺炎首要的并发症是ALI和ARDS，因此在内毒素诱导的ALI大鼠应用大黄对其进行干预治疗显示大黄不但使ALI的生物标记指标显著下降，NO iNOS也显著下降。由此推测是否大黄具有某种抑制iNOS的作用。关于此问题需要进一步通过分子生物学研究加以证实。
综上所述，研究证明NO和iNOS在LPS诱导的ALI的发病过程中确实起到较为关键性的作用，大黄、地塞米松对LPS诱导的ALI具有保护作用，其机制可能是通过抑制NO和iNOS活性实现的。■
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收稿日期：1999-10-13
修回日期：1999-11-25, 百拇医药