丙型肝炎病毒NS3蛋白真核表达载体的构建及其基因免疫研究
作者：范 涛 高建恩 陶其敏
单位：北京医科大学人民医院肝病研究所，北京 100044
关键词：
北京医科大学学报990430 基因免疫是指将编码特异抗原的目的基因重组表达载体直接接种到宿主组织内，在体内表达基因产物，进而激发宿主产生特异性免疫反应。自1990年首次报道发现基因免疫以来，这一新的免疫技术已经在基础免疫学研究和疫苗研制等许多领域得到广泛应用。对许多疾病(如流感)的基因免疫接种，可以产生抵御再次感染的保护性免疫反应[1]。在小鼠体内接种HCV包膜蛋白和核心蛋白的重组质粒可诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫反应[2～4]。本研究中我们构建了HCV NS3区真核表达载体，对其基因免疫效果进行初步探讨。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 材料
BALB/c小鼠购自北京医科大学实验动物部。
pcDNA3质粒购自Invitrogen公司。 JM109大肠杆菌为本所保存。
T4 DNA连接酶、EcoRⅠ与XbaⅠ内切酶、Taq DNA聚合酶、Klenow大片段，核酸纯化试剂盒(Wizard Plus Maxipreps cat.#A7270)为Promega公司产品。HRP羊抗鼠IgG：Sigma公司产品。
1.2 方法
以pKH26质粒为模板，应用PCR方法扩增NS3基因，其引物为：5′-CAGGAATTCATGGTTGCGAAGGCGGTG-3′;5′-GCGTCTAGATTAACATGTGTTGCAGTC-3′。在片段侧翼分别引入EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点及起始密码子和终止密码子。扩增程序为：94℃ 1 min，55℃ 1.5 min，72℃ 2 min，共30个循环，最后72℃ 延伸10 min，扩增产物在60 g.L-1PAGE凝胶中电泳，EB染色，紫外灯下观察，阳性扩增产物用于克隆。
, 百拇医药
扩增的目的基因产物经Klenow大片段补平后，与pcDNA3质粒分别以EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切消化，电泳回收目的基因片段和载体片段，在T4连接酶作用下，于16 ℃反应20 h。转化JM109感受态细胞，以含Amp的LB培养基选择培养，次日挑选阳性菌落，小量提取质粒，酶切鉴定重组子。大量提取质粒，以核酸纯化试剂盒纯化，操作方法参照使用说明书。样品以TE溶解，紫外分光光度计确定样品的浓度和纯度，-20℃冻存备用。
取8只6～8周BALB/c小鼠，分别在0、2、6周按每次每只小鼠100 μg DNA在股四头肌注射接种。按上述剂量和方法以pcDNA3空载体接种4只小鼠作为对照。同时设4只阴性对照，在同等条件下喂养。在第3次接种后的第1、2、4周分别从小鼠尾静脉取血，-20℃冻存血清，统一检测抗NS3抗体。
抗NS3抗体的检测，根据我所已经建立的用于临床血清检测的ELISA法稍加改进。即以pH 9.6的0.01 mol.L-1碳酸盐缓冲液稀释NS3抗原，按每孔0.1 μg包被96孔Nunk板，4℃过夜，次日弃包被液，用含30%(体积分数)小牛血清的封闭液，在37℃封闭1 h后，加入1∶20(体积比)稀释的血清样本，37℃ 2 h，PBST洗4次，加入HPR-羊抗鼠IgG，37℃ 1 h，洗涤后加底物显色，测定495 nm波长处的光密度值。
, 百拇医药
2 结果
2.1 目的基因的扩增
pKH26质粒由本室构建，它是将II型中国株HCVNS3 a.a.3894～4700 (HCV-J参考位置)cDNA克隆至pKPL-3a载体，在温控调节下高效表达NS3重组蛋白，其表达产物经纯化鉴定，已应用于临床对丙型肝炎病人血清抗体的检测[5]。通过PCR反应扩增出一段长约820 bp的DNA条带，与预期片段大小相符。
2.2 重组载体的构建和鉴定
将扩增的特异条带电泳回收，Klenow大片段补平后，限制性内切酶处理，克隆至pcDNA3载体多克隆位点EcoRⅠ和XbaⅠ之间，构建重组载体pcDNA-NS3。重组载体以EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定，结果载体和NS3基因片段大小与预期一致。
, 百拇医药 2.3 NS3体液免疫反应
在第3次DNA接种后的第1、2和4周采血，ELISA检测，结果表明，8只接种pcDNA-NS3质粒的小鼠中，有3只产生了明显的抗原-抗体反应，随着时间的推移，其抗体滴度有所提高，但增加不显著。另5只小鼠在3个时间段内一直保持阴性，所有接种pcDNA3空载体的4只小鼠均为阴性。
3 讨论
DNA免疫是一种新的行之有效的免疫方法，DNA免疫不仅可诱导保护性抗体的产生，而且，可激发机体保护性细胞免疫反应。HCV感染后，机体的免疫反应，包括抗体的产生、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞(CTL)的增殖反应，是HCV感染后导致病毒清除或疾病发生、发展的重要因素。 应用HCV各区的重组蛋白或合成肽进行HCV抗原表位分析表明，C、E1、E2、NS3、NS4、NS5蛋白均含优势T细胞表位和B细胞抗原表位。天然NS3蛋白具有良好的抗原性，临床检测HCV感染者，NS3区抗体检出率高，抗体出现早。HCV基因组序列T、B淋巴细胞表位预测，以及临床和基础研究都提示，NS3区内有多个B淋巴细胞表位和T淋巴细胞表位，NS3区的细胞和体液反应，与HCV致病性和疾病的转归有密切关系。研究显示，HCV急性感染如对NS3蛋白产生较强的CD4+增殖反应，疾病多恢复，反之则易发展为慢性丙型肝炎[6]。因此NS3蛋白作为治疗性疫苗的候选区域更具重要意义。
, 百拇医药
本研究结果显示，NS3区基因接种小鼠后产生了明显的抗NS3的体液免疫反应，表明我们构建的表达载体在小鼠体内能产生NS3蛋白，并诱导特异的体液免疫反应。但同时我们也观察到，在8只小鼠中仅3只产生了特异性免疫反应，而且与纯化的NS3 蛋白直接免疫相比，其抗体滴度低(本文资料未显示)。由于基因免疫中许多技术如载体的选择、接种方法、接种途径、核酸用量、接种次数及间隔时间，预处理过程等仍处于探索阶段，无标准方案可供参考，DNA接种后产生免疫反应的机制也不清楚，如何提高接种反应的阳性率及抗体反应强度，尚需进一步探讨。
美国中华医学基金会(CMB-93-582)资助课题。
参考文献
1 Ulmer JB, Donnelly JJ, Parker SE, et al. Heterogeneous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science, 1993, 259:1745-1749
, 百拇医药
2 Major ME, Vitvitski L, Mink MA, et al. DNA-based immunization with chimeric vectors for the induction of immune responses against the hepatitis C virus nucleocapsid. J Virol, 1995, 69: 5798-5805
3 Saito T, Sherman GJ, Kurokohchi K, et al. Plasmid DNA-based immunization for hepatitis C virus structural proteins: immuned responses in mice. Gastroentorology, 1997, 112:1321-1330
4 Tokushige K, Wakita T, Pachuk C, et al. Expression and immune response to hepatitis C virus core DNA-based vaccine constructs. Hepatology, 1996, 24: 14-20
5 郭建平，高建恩，陶其敏，等.丙型肝炎病毒NS3区优势表位基因的克隆和高效表达研究.中华医学检验杂志，1994,17:71-74
6 Diepolder HM, Zachoval R, Hoffmann RM, et al. Possible mechanism involving T-lymphocyte response to nonstructural protein 3 in viral clearance in acute hepatitis C virus infection. Lancet, 1995, 346: 1006-1007
(1998-08-26收稿), http://www.100md.com
单位：北京医科大学人民医院肝病研究所，北京 100044
关键词：
北京医科大学学报990430 基因免疫是指将编码特异抗原的目的基因重组表达载体直接接种到宿主组织内，在体内表达基因产物，进而激发宿主产生特异性免疫反应。自1990年首次报道发现基因免疫以来，这一新的免疫技术已经在基础免疫学研究和疫苗研制等许多领域得到广泛应用。对许多疾病(如流感)的基因免疫接种，可以产生抵御再次感染的保护性免疫反应[1]。在小鼠体内接种HCV包膜蛋白和核心蛋白的重组质粒可诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫反应[2～4]。本研究中我们构建了HCV NS3区真核表达载体，对其基因免疫效果进行初步探讨。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 材料
BALB/c小鼠购自北京医科大学实验动物部。
pcDNA3质粒购自Invitrogen公司。 JM109大肠杆菌为本所保存。
T4 DNA连接酶、EcoRⅠ与XbaⅠ内切酶、Taq DNA聚合酶、Klenow大片段，核酸纯化试剂盒(Wizard Plus Maxipreps cat.#A7270)为Promega公司产品。HRP羊抗鼠IgG：Sigma公司产品。
1.2 方法
以pKH26质粒为模板，应用PCR方法扩增NS3基因，其引物为：5′-CAGGAATTCATGGTTGCGAAGGCGGTG-3′;5′-GCGTCTAGATTAACATGTGTTGCAGTC-3′。在片段侧翼分别引入EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点及起始密码子和终止密码子。扩增程序为：94℃ 1 min，55℃ 1.5 min，72℃ 2 min，共30个循环，最后72℃ 延伸10 min，扩增产物在60 g.L-1PAGE凝胶中电泳，EB染色，紫外灯下观察，阳性扩增产物用于克隆。
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扩增的目的基因产物经Klenow大片段补平后，与pcDNA3质粒分别以EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切消化，电泳回收目的基因片段和载体片段，在T4连接酶作用下，于16 ℃反应20 h。转化JM109感受态细胞，以含Amp的LB培养基选择培养，次日挑选阳性菌落，小量提取质粒，酶切鉴定重组子。大量提取质粒，以核酸纯化试剂盒纯化，操作方法参照使用说明书。样品以TE溶解，紫外分光光度计确定样品的浓度和纯度，-20℃冻存备用。
取8只6～8周BALB/c小鼠，分别在0、2、6周按每次每只小鼠100 μg DNA在股四头肌注射接种。按上述剂量和方法以pcDNA3空载体接种4只小鼠作为对照。同时设4只阴性对照，在同等条件下喂养。在第3次接种后的第1、2、4周分别从小鼠尾静脉取血，-20℃冻存血清，统一检测抗NS3抗体。
抗NS3抗体的检测，根据我所已经建立的用于临床血清检测的ELISA法稍加改进。即以pH 9.6的0.01 mol.L-1碳酸盐缓冲液稀释NS3抗原，按每孔0.1 μg包被96孔Nunk板，4℃过夜，次日弃包被液，用含30%(体积分数)小牛血清的封闭液，在37℃封闭1 h后，加入1∶20(体积比)稀释的血清样本，37℃ 2 h，PBST洗4次，加入HPR-羊抗鼠IgG，37℃ 1 h，洗涤后加底物显色，测定495 nm波长处的光密度值。
, 百拇医药
2 结果
2.1 目的基因的扩增
pKH26质粒由本室构建，它是将II型中国株HCVNS3 a.a.3894～4700 (HCV-J参考位置)cDNA克隆至pKPL-3a载体，在温控调节下高效表达NS3重组蛋白，其表达产物经纯化鉴定，已应用于临床对丙型肝炎病人血清抗体的检测[5]。通过PCR反应扩增出一段长约820 bp的DNA条带，与预期片段大小相符。
2.2 重组载体的构建和鉴定
将扩增的特异条带电泳回收，Klenow大片段补平后，限制性内切酶处理，克隆至pcDNA3载体多克隆位点EcoRⅠ和XbaⅠ之间，构建重组载体pcDNA-NS3。重组载体以EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定，结果载体和NS3基因片段大小与预期一致。
, 百拇医药 2.3 NS3体液免疫反应
在第3次DNA接种后的第1、2和4周采血，ELISA检测，结果表明，8只接种pcDNA-NS3质粒的小鼠中，有3只产生了明显的抗原-抗体反应，随着时间的推移，其抗体滴度有所提高，但增加不显著。另5只小鼠在3个时间段内一直保持阴性，所有接种pcDNA3空载体的4只小鼠均为阴性。
3 讨论
DNA免疫是一种新的行之有效的免疫方法，DNA免疫不仅可诱导保护性抗体的产生，而且，可激发机体保护性细胞免疫反应。HCV感染后，机体的免疫反应，包括抗体的产生、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞(CTL)的增殖反应，是HCV感染后导致病毒清除或疾病发生、发展的重要因素。 应用HCV各区的重组蛋白或合成肽进行HCV抗原表位分析表明，C、E1、E2、NS3、NS4、NS5蛋白均含优势T细胞表位和B细胞抗原表位。天然NS3蛋白具有良好的抗原性，临床检测HCV感染者，NS3区抗体检出率高，抗体出现早。HCV基因组序列T、B淋巴细胞表位预测，以及临床和基础研究都提示，NS3区内有多个B淋巴细胞表位和T淋巴细胞表位，NS3区的细胞和体液反应，与HCV致病性和疾病的转归有密切关系。研究显示，HCV急性感染如对NS3蛋白产生较强的CD4+增殖反应，疾病多恢复，反之则易发展为慢性丙型肝炎[6]。因此NS3蛋白作为治疗性疫苗的候选区域更具重要意义。
, 百拇医药
本研究结果显示，NS3区基因接种小鼠后产生了明显的抗NS3的体液免疫反应，表明我们构建的表达载体在小鼠体内能产生NS3蛋白，并诱导特异的体液免疫反应。但同时我们也观察到，在8只小鼠中仅3只产生了特异性免疫反应，而且与纯化的NS3 蛋白直接免疫相比，其抗体滴度低(本文资料未显示)。由于基因免疫中许多技术如载体的选择、接种方法、接种途径、核酸用量、接种次数及间隔时间，预处理过程等仍处于探索阶段，无标准方案可供参考，DNA接种后产生免疫反应的机制也不清楚，如何提高接种反应的阳性率及抗体反应强度，尚需进一步探讨。
美国中华医学基金会(CMB-93-582)资助课题。
参考文献
1 Ulmer JB, Donnelly JJ, Parker SE, et al. Heterogeneous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science, 1993, 259:1745-1749
, 百拇医药
2 Major ME, Vitvitski L, Mink MA, et al. DNA-based immunization with chimeric vectors for the induction of immune responses against the hepatitis C virus nucleocapsid. J Virol, 1995, 69: 5798-5805
3 Saito T, Sherman GJ, Kurokohchi K, et al. Plasmid DNA-based immunization for hepatitis C virus structural proteins: immuned responses in mice. Gastroentorology, 1997, 112:1321-1330
4 Tokushige K, Wakita T, Pachuk C, et al. Expression and immune response to hepatitis C virus core DNA-based vaccine constructs. Hepatology, 1996, 24: 14-20
5 郭建平，高建恩，陶其敏，等.丙型肝炎病毒NS3区优势表位基因的克隆和高效表达研究.中华医学检验杂志，1994,17:71-74
6 Diepolder HM, Zachoval R, Hoffmann RM, et al. Possible mechanism involving T-lymphocyte response to nonstructural protein 3 in viral clearance in acute hepatitis C virus infection. Lancet, 1995, 346: 1006-1007
(1998-08-26收稿), http://www.100md.com