血浆中游离梭曼的电鳐乙酰胆碱酯酶抑制测定法
作者：应翔宇 阮金秀
单位：北京毒物药物研究所，100850
关键词：
卫生毒理学杂志000426 梭曼是一种对体内乙酰胆碱酯酶(AChE)有强烈抑制作用的有机磷化合物。由于梭曼毒性强且在体内降解迅速，国外目前主要通过大进样量气相色谱或气-质联用方法来检测[1，2]，其优点是：(1)灵敏度较高，如检测下限可达1.5 pg/ml血浆；(2)可以将梭曼的4个异构体分开，以便研究各异构体在体内的动力学过程。不足之处是：检测设备价格昂贵，样本的预处理过程比较繁琐，检测时间较长，不适合临床上对毒剂浓度的快速检测。基于AChE活性抑制测定有机磷毒剂浓度的文献也有报道，优点是灵敏、简便[3]。然而，该法在检测血浆中残留梭曼时是否准确可靠，以及如何处理样本及控制检测条件，还有待于进一步研究。我们以李凤珍[4]所建的微量羟胺法为基础，建立了一种灵敏、快速的梭曼检测方法。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验材料 Model 550酶标仪是美国BIO-RAD公司产品，TLL-C台式高速冷冻离心机由北京四环科学仪器厂生产。
电鳐AChE由北京毒物药物研究所郭崇志博士提供，溴化乙酰胆碱(ACh-Br)由军事医学科学院药材供应站提供，盐酸羟胺为丹东化工二厂产品，三氯化铁为北京朝阳区通惠化工厂产品，高氯酸由北京南尚乐化工厂生产，其余试剂均为分析纯。
电鳐AChE用1/15 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2～7.4)按1∶300(V/V)稀释，现用现配；溴化乙酰胆碱，以pH 4.0HCl配成0.14 mol母液，冻结保存，临用前以缓冲液按1∶10稀释后置于冰浴中；2 mol/L盐酸羟胺保存于4 ℃冰箱中；碱羟胺溶液是将2 mol/L盐酸羟胺及3.5 mol NaOH在临用前以等容积混合配成：0.197 mol/L FeCl3，以0.1 mol HCl配制而成，过滤至清后室温保存；梭曼由本所二室提供，纯度约为97%，现用现配。
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1.2 实验动物 昆明种小鼠，♀，18～22 g；大鼠，♀，180～220 g；均由军事医学科学院实验动物中心提供。
1.3 原理 测定经电鳐AChE水解后的剩余底物(ACh*Br)量，与ACh加入量相比，其差量代表酶活力。剩余的ACh与羟胺在碱性溶液中作用，生成乙酰羟肟酸，后者在酸性溶液中与高铁离子生成稳定的紫红色络合物，颜色强度与ACh量成正比。在一定范围内，梭曼浓度与电鳐AChE的抑制程度具有线性关系，梭曼浓度愈高，对酶的抑制力就愈强，呈色就愈深；反之，对酶的抑制则愈弱，呈色也愈浅；根据A值的变化可以求得梭曼浓度的高低。
1.4 实验方法
1.4.1 微量羟胺法测定电鳐AChE活性 样品管：将10 μl电鳐AChE取10 μl经1.4.2处理后的上清液及30 μl 1/15 mol/L 磷酸盐缓冲液在37 ℃气浴中反应10 min后，加入0.014 mol/L ACh50 μl，反应总容积100 μl，37 ℃反应30 min后加入200 μl碱羟胺终止反应，然后加入2 mol HCl200 μl混匀，最后加0.197 mol/L FeCL3300 μl显色。显色后离心1 min(1 760 g)，吸取上清液300 μl，于492 nm处比色。正常酶管：将10 μl电鳐AChE及40 μl缓冲液在37 ℃气浴中孵温10 min，其余步骤皆同样品管。非酶水解对照管加50 μl缓冲液及50 μl 0.014 mol/LACh，在37 ℃气浴中同步孵温30 min，然后加入碱羟胺，1 min后再加入酶样品，反应总容积100 μl。ACh标准管加样与非酶水解对照管相同，置于冰浴中。试剂空白管只加缓冲液。
, 百拇医药
已知每管中ACh加量为0.7 μmol，故电鳐AChE在37 ℃1min内水解ACh的μmol为：
AChE活力(μmol ACh-min-1*μl-1)=(非酶水解对照管吸光度-样品管吸光度)*0.7/标准管吸光/30/10
1.4.2 梭曼浓度-电鳐AChE抑制标准曲线
1.4.2.1 绝对标准曲线 50 μl生理盐水+10 μl高氯酸(1 mol/L)，加入50 μl不同浓度梭曼(终浓度：10-9.5～108.2 mol/L)，混匀，-4 ℃离心2.5 min(10?100 g)，取出上清液10 μl，微量羟胺法测定酶活性，根据梭曼浓度-电鳐AChE抑制关系求出回归方程。
1.4.2.2 相对标准曲线 用小鼠血浆替代生理盐水，其余方法同1.4.2.1。
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1.4.3 回收率及方法重现性评估 重复实验，并据所测得的梭曼浓度与加入梭曼浓度相比，求出回收率。
1.4.4 大鼠血液中梭曼残留浓度的测定 大鼠按415 μg/kg(5LD50)尾静脉注射梭曼(约0.2 ml)后15、30 s、1、1.5、2、3、4、6、8、10 min分别从眼球取血50 μl，并立即加入18 μl高氯酸(1 mol/L)终止梭曼与血液中解毒酶继续反应，充分混匀后，-4 ℃离心2.5 min(10?100 g)，上清液按1∶85(V/V)稀释后取出10 μl，羟胺法测定酶活性，并根据梭曼-电鳐AChE抑制相对标准曲线换算成血液中的梭曼浓度。
2 结果
2.1 电鳐AChE浓度与活力的关系 电鳐AChE按1∶300稀释后，观察电鳐AChE用量与反应速度的相互关系。电鳐AChE稀释液在2～10 μl范围内，酶用量与活力有较好的线性关系，故将酶用量定为10 μl。经计算求得，该酶在37 ℃可分解乙酰胆碱的量1.87 nmol ACh*min-1*μl-1。
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2.2 梭曼与电鳐AChE抑制的量-效关系 图1表明，梭曼浓度在10-9.7～10-8.0 mol/L溶液范围内，梭曼-电鳐AChE抑制具有较好的线性关系，超出该范围，梭曼对电鳐AChE的抑制作用分别趋于平台。
图1 梭曼与电鳐AChE抑制的量-效关系
2.3 梭曼-电鳐AChE抑制绝对标准曲线 当梭曼浓度在10-9.5～10-8.2 mol/L溶液时，梭曼浓度与AChE抑制线性关系良好，回归方程为，Y=557-57X，相关系数r>0.999。
2.4 梭曼-电鳐AChE抑制相对标准曲线 图2表明，当梭曼浓度在10-9.5～10-8.2 mol/L血浆时，梭曼浓度与AChE抑制线性关系良好，回归方程为Y=559-56X，相关系数r>0.998。
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图2 梭曼抑制电鳐AChE的相对标准曲线
2.5 梭曼检测方法的回收率及重现性
2.5.1 日内重现性 一日内重复4次实验，计算出回收率及日内变异系数(表1)。
表1 梭曼检测方法的日内重现性(
±s,n=4) 梭曼浓度(mol/L)
回收率(%)
变异系数(%)
10-9.5
65.6±4.88
7.44
, 百拇医药
10-9.3
78.7±4.93
6.26
10-9.0
98.5±2.88
2.92
10-8.8
117.9±2.91
2.47
10-8.2
104.9±6.97
, 百拇医药
6.64
2.5.2 日间重现性 每日重复1次实验，连续4 d，求出回收率，同时判断出方法的日间变异情况(表2)。
表2 梭曼检测方法的日间重现性(±s,n=4) 梭曼浓度(mol/L)
回收率(%)
变异系数(%)
10-9.5
76.1±6.57
8.63
10-9.3
, 百拇医药
79.2±7.04
8.89
10-9.0
98.1±8.48
8.64
10-8.8
108.2±9.92
9.17
10-8.2
96.7±6.63
6.85
, 百拇医药 2.6 电鳐AChE抑制法测定大鼠血液中的梭曼残留浓度
为进一步验证本方法的可靠性，我们测定了大鼠血液中的梭曼残留浓度，结果表明，该法能反映出梭曼在大鼠血液中的消除过程(图3)，重复性较好，提示用酶法检测血液中的游离梭曼是可行的。
图3 梭曼在大鼠血液中的浓度-时间曲线
3 讨论
梭曼与解毒酶作用迅速，那么要想准确定量生物样本中的梭曼残留浓度，就要求在终止血浆中解毒酶与梭曼继续反应时，终止剂必须具备以下几个条件：终止反应迅速，对梭曼无明显的降解作用，对后续的羟胺法测量系统，尤其是对外加电鳐AChE活性没有明显影响。梭曼易溶解于有机溶剂，故可以考虑用有机溶剂来提取血浆中游离梭曼，但在提取后要加以浓缩，在蒸发溶剂的过程中，梭曼有可能也随之挥发掉，从而降低回收率；另一个思路就是考虑用蛋白质沉淀剂来终止酶与梭曼的进一步反应，预实验阶段，我们先用1 mol/L高氯酸终止反应，然后再加入等当量的氢氧化钾(1 mol/L)将反应系统的pH值调至6～8，由于反应系统酸碱度接近于中性，可能导致了某些蛋白质重新复性，并结合了更多的梭曼，使得回收率仅为40%～60%，明显低于高氯酸单独使用时的回收率，这一点Loke[6]的报道不同于我们的实验结果，因此我们认为，高氯酸自身在沉淀蛋白时，具有终止反应迅速，且没有明显降解梭曼的作用，符合本实验目的要求。实验中，我们还试着用三氯乙酸、乙醇、甲醇等沉淀蛋白手段，以及瞬间高热和超滤等方式来终止反应，但存在终止反应慢及对电鳐AChE活性有明显的抑制作用等缺点。
, http://www.100md.com
参考文献
[1] Degenhardt-Langelaan CEAM,Kientz CE.Capillary gas chromatographic analysis of nerve agents using large volume injections.J Chroma,1996,723:210-214.
[2] Karlsson B,Fredriksson SA,Sellstrom A,et al.The protective effect of nimodipine,a clalcium antagonist,and its influence on soman clearance in the anaesthetized rabbit.J Pharm Pharmacol,1994,46:123-127.
[3] Hammond PS,Forster JS.A microassay-based procedure for measuing low levels of toxic organophosphorus compounds through acetylcholinesterase inhibition.Analy Biochem,1989,180:380-383.
, http://www.100md.com
[4] 李凤珍，孙曼霁.微量羟胺比色法测量胆碱酯酶活性.军事医学科学院院刊，1986，10：211-214.
[5] Benschop HP,Konings CAG，Genderen J,et al.Isolation,in vitro activity,and acute toxicity in mice of the four stereosiomers of soman.Fundam Appl Toxicol，1984，4:S84-95.
[6] Loke WK,Karlsson B,Waara L,et al.Enzyme-based microassay for accurate determination of soman in blood samples.Analy Biochem,1998，257:12-19.
(收稿日期：1999-07-02), 百拇医药
单位：北京毒物药物研究所，100850
关键词：
卫生毒理学杂志000426 梭曼是一种对体内乙酰胆碱酯酶(AChE)有强烈抑制作用的有机磷化合物。由于梭曼毒性强且在体内降解迅速，国外目前主要通过大进样量气相色谱或气-质联用方法来检测[1，2]，其优点是：(1)灵敏度较高，如检测下限可达1.5 pg/ml血浆；(2)可以将梭曼的4个异构体分开，以便研究各异构体在体内的动力学过程。不足之处是：检测设备价格昂贵，样本的预处理过程比较繁琐，检测时间较长，不适合临床上对毒剂浓度的快速检测。基于AChE活性抑制测定有机磷毒剂浓度的文献也有报道，优点是灵敏、简便[3]。然而，该法在检测血浆中残留梭曼时是否准确可靠，以及如何处理样本及控制检测条件，还有待于进一步研究。我们以李凤珍[4]所建的微量羟胺法为基础，建立了一种灵敏、快速的梭曼检测方法。
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1 材料与方法
1.1 实验材料 Model 550酶标仪是美国BIO-RAD公司产品，TLL-C台式高速冷冻离心机由北京四环科学仪器厂生产。
电鳐AChE由北京毒物药物研究所郭崇志博士提供，溴化乙酰胆碱(ACh-Br)由军事医学科学院药材供应站提供，盐酸羟胺为丹东化工二厂产品，三氯化铁为北京朝阳区通惠化工厂产品，高氯酸由北京南尚乐化工厂生产，其余试剂均为分析纯。
电鳐AChE用1/15 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2～7.4)按1∶300(V/V)稀释，现用现配；溴化乙酰胆碱，以pH 4.0HCl配成0.14 mol母液，冻结保存，临用前以缓冲液按1∶10稀释后置于冰浴中；2 mol/L盐酸羟胺保存于4 ℃冰箱中；碱羟胺溶液是将2 mol/L盐酸羟胺及3.5 mol NaOH在临用前以等容积混合配成：0.197 mol/L FeCl3，以0.1 mol HCl配制而成，过滤至清后室温保存；梭曼由本所二室提供，纯度约为97%，现用现配。
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1.2 实验动物 昆明种小鼠，♀，18～22 g；大鼠，♀，180～220 g；均由军事医学科学院实验动物中心提供。
1.3 原理 测定经电鳐AChE水解后的剩余底物(ACh*Br)量，与ACh加入量相比，其差量代表酶活力。剩余的ACh与羟胺在碱性溶液中作用，生成乙酰羟肟酸，后者在酸性溶液中与高铁离子生成稳定的紫红色络合物，颜色强度与ACh量成正比。在一定范围内，梭曼浓度与电鳐AChE的抑制程度具有线性关系，梭曼浓度愈高，对酶的抑制力就愈强，呈色就愈深；反之，对酶的抑制则愈弱，呈色也愈浅；根据A值的变化可以求得梭曼浓度的高低。
1.4 实验方法
1.4.1 微量羟胺法测定电鳐AChE活性 样品管：将10 μl电鳐AChE取10 μl经1.4.2处理后的上清液及30 μl 1/15 mol/L 磷酸盐缓冲液在37 ℃气浴中反应10 min后，加入0.014 mol/L ACh50 μl，反应总容积100 μl，37 ℃反应30 min后加入200 μl碱羟胺终止反应，然后加入2 mol HCl200 μl混匀，最后加0.197 mol/L FeCL3300 μl显色。显色后离心1 min(1 760 g)，吸取上清液300 μl，于492 nm处比色。正常酶管：将10 μl电鳐AChE及40 μl缓冲液在37 ℃气浴中孵温10 min，其余步骤皆同样品管。非酶水解对照管加50 μl缓冲液及50 μl 0.014 mol/LACh，在37 ℃气浴中同步孵温30 min，然后加入碱羟胺，1 min后再加入酶样品，反应总容积100 μl。ACh标准管加样与非酶水解对照管相同，置于冰浴中。试剂空白管只加缓冲液。
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已知每管中ACh加量为0.7 μmol，故电鳐AChE在37 ℃1min内水解ACh的μmol为：
AChE活力(μmol ACh-min-1*μl-1)=(非酶水解对照管吸光度-样品管吸光度)*0.7/标准管吸光/30/10
1.4.2 梭曼浓度-电鳐AChE抑制标准曲线
1.4.2.1 绝对标准曲线 50 μl生理盐水+10 μl高氯酸(1 mol/L)，加入50 μl不同浓度梭曼(终浓度：10-9.5～108.2 mol/L)，混匀，-4 ℃离心2.5 min(10?100 g)，取出上清液10 μl，微量羟胺法测定酶活性，根据梭曼浓度-电鳐AChE抑制关系求出回归方程。
1.4.2.2 相对标准曲线 用小鼠血浆替代生理盐水，其余方法同1.4.2.1。
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1.4.3 回收率及方法重现性评估 重复实验，并据所测得的梭曼浓度与加入梭曼浓度相比，求出回收率。
1.4.4 大鼠血液中梭曼残留浓度的测定 大鼠按415 μg/kg(5LD50)尾静脉注射梭曼(约0.2 ml)后15、30 s、1、1.5、2、3、4、6、8、10 min分别从眼球取血50 μl，并立即加入18 μl高氯酸(1 mol/L)终止梭曼与血液中解毒酶继续反应，充分混匀后，-4 ℃离心2.5 min(10?100 g)，上清液按1∶85(V/V)稀释后取出10 μl，羟胺法测定酶活性，并根据梭曼-电鳐AChE抑制相对标准曲线换算成血液中的梭曼浓度。
2 结果
2.1 电鳐AChE浓度与活力的关系 电鳐AChE按1∶300稀释后，观察电鳐AChE用量与反应速度的相互关系。电鳐AChE稀释液在2～10 μl范围内，酶用量与活力有较好的线性关系，故将酶用量定为10 μl。经计算求得，该酶在37 ℃可分解乙酰胆碱的量1.87 nmol ACh*min-1*μl-1。
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2.2 梭曼与电鳐AChE抑制的量-效关系 图1表明，梭曼浓度在10-9.7～10-8.0 mol/L溶液范围内，梭曼-电鳐AChE抑制具有较好的线性关系，超出该范围，梭曼对电鳐AChE的抑制作用分别趋于平台。
图1 梭曼与电鳐AChE抑制的量-效关系
2.3 梭曼-电鳐AChE抑制绝对标准曲线 当梭曼浓度在10-9.5～10-8.2 mol/L溶液时，梭曼浓度与AChE抑制线性关系良好，回归方程为，Y=557-57X，相关系数r>0.999。
2.4 梭曼-电鳐AChE抑制相对标准曲线 图2表明，当梭曼浓度在10-9.5～10-8.2 mol/L血浆时，梭曼浓度与AChE抑制线性关系良好，回归方程为Y=559-56X，相关系数r>0.998。
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图2 梭曼抑制电鳐AChE的相对标准曲线
2.5 梭曼检测方法的回收率及重现性
2.5.1 日内重现性 一日内重复4次实验，计算出回收率及日内变异系数(表1)。
表1 梭曼检测方法的日内重现性(
±s,n=4) 梭曼浓度(mol/L)回收率(%)
变异系数(%)
10-9.5
65.6±4.88
7.44
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10-9.3
78.7±4.93
6.26
10-9.0
98.5±2.88
2.92
10-8.8
117.9±2.91
2.47
10-8.2
104.9±6.97
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2.5.2 日间重现性 每日重复1次实验，连续4 d，求出回收率，同时判断出方法的日间变异情况(表2)。
表2 梭曼检测方法的日间重现性(
±s,n=4) 梭曼浓度(mol/L)回收率(%)
变异系数(%)
10-9.5
76.1±6.57
8.63
10-9.3
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79.2±7.04
8.89
10-9.0
98.1±8.48
8.64
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108.2±9.92
9.17
10-8.2
96.7±6.63
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为进一步验证本方法的可靠性，我们测定了大鼠血液中的梭曼残留浓度，结果表明，该法能反映出梭曼在大鼠血液中的消除过程(图3)，重复性较好，提示用酶法检测血液中的游离梭曼是可行的。
图3 梭曼在大鼠血液中的浓度-时间曲线
3 讨论
梭曼与解毒酶作用迅速，那么要想准确定量生物样本中的梭曼残留浓度，就要求在终止血浆中解毒酶与梭曼继续反应时，终止剂必须具备以下几个条件：终止反应迅速，对梭曼无明显的降解作用，对后续的羟胺法测量系统，尤其是对外加电鳐AChE活性没有明显影响。梭曼易溶解于有机溶剂，故可以考虑用有机溶剂来提取血浆中游离梭曼，但在提取后要加以浓缩，在蒸发溶剂的过程中，梭曼有可能也随之挥发掉，从而降低回收率；另一个思路就是考虑用蛋白质沉淀剂来终止酶与梭曼的进一步反应，预实验阶段，我们先用1 mol/L高氯酸终止反应，然后再加入等当量的氢氧化钾(1 mol/L)将反应系统的pH值调至6～8，由于反应系统酸碱度接近于中性，可能导致了某些蛋白质重新复性，并结合了更多的梭曼，使得回收率仅为40%～60%，明显低于高氯酸单独使用时的回收率，这一点Loke[6]的报道不同于我们的实验结果，因此我们认为，高氯酸自身在沉淀蛋白时，具有终止反应迅速，且没有明显降解梭曼的作用，符合本实验目的要求。实验中，我们还试着用三氯乙酸、乙醇、甲醇等沉淀蛋白手段，以及瞬间高热和超滤等方式来终止反应，但存在终止反应慢及对电鳐AChE活性有明显的抑制作用等缺点。
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参考文献
[1] Degenhardt-Langelaan CEAM,Kientz CE.Capillary gas chromatographic analysis of nerve agents using large volume injections.J Chroma,1996,723:210-214.
[2] Karlsson B,Fredriksson SA,Sellstrom A,et al.The protective effect of nimodipine,a clalcium antagonist,and its influence on soman clearance in the anaesthetized rabbit.J Pharm Pharmacol,1994,46:123-127.
[3] Hammond PS,Forster JS.A microassay-based procedure for measuing low levels of toxic organophosphorus compounds through acetylcholinesterase inhibition.Analy Biochem,1989,180:380-383.
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[4] 李凤珍，孙曼霁.微量羟胺比色法测量胆碱酯酶活性.军事医学科学院院刊，1986，10：211-214.
[5] Benschop HP,Konings CAG，Genderen J,et al.Isolation,in vitro activity,and acute toxicity in mice of the four stereosiomers of soman.Fundam Appl Toxicol，1984，4:S84-95.
[6] Loke WK,Karlsson B,Waara L,et al.Enzyme-based microassay for accurate determination of soman in blood samples.Analy Biochem,1998，257:12-19.
(收稿日期：1999-07-02), 百拇医药