质粒DNA对大鼠骨骼肌肌质网Ca2＋转运的影响
作者：赵 文 李载权 姜志胜 汤 健 贾弘 刘乃奎 唐朝枢
单位：赵 文 姜志胜 汤 健 刘乃奎 北京医科大学心血管基础研究所；贾弘 生物化学与分子生物学系，北京 100083；唐朝枢 李载权 第一医院心血管研究所
关键词：质粒；DNA结合蛋白质类；钙；代谢；肌肉骨骼系统
北京医科大学学报990403 摘 要 目的：观察DNA与骨骼肌肌质网蛋白结合后对肌质网功能的影响。方法：应用差速离心分离大鼠骨骼肌肌质网，并用45CaCl2作为示踪剂，观察质粒DNA pcDNA3和pcDNA3/ANF对肌质网钙转运功能的影响。结果：两种质粒均可明显增加肌质网Ca2+摄取，呈明显的量效关系，并且也可促进肌质网钙释放。结论：外源质粒DNA可影响肌质网钙转运功能。
中国图书资料分类法分类号 R337.1-332
, 百拇医药
Effects of plasmid DNA on sarcoplasmic reticulum Ca2+ transport in rat skeletal muscle
ZHAO Wen#， LI Zai-Quan， JIANG Zhi-Sheng， TANG Jian ， JIA Hong-Ti， LIU Nai-Kui， TANG Chao-Shu
(#Institute of Cardiovascular Research， Beijing Medical University, Beijing 100083)
ABSTRACT Objective: To observe the effect of plasmid DNA binding to sarcoplasmic reticulum (SR) non-nuclear DNA binding proteins on SR function. Methods: SR vesicles of rat skeletal muscle were prepared by differential centrifuge. Effects of plasmids pcDNA3 and pcDNA3/ANF on SR Ca2+ transport were investigated by using 45CaCl2 as tracer. Results: Both plasmids could increase SR Ca2+ uptake significantly, which had significant dose-dependent relation and increased SR Ca2+ release. Conclusion: Plasmid DNA could influence SR Ca2+ transport.
, 百拇医药
MeSH Plasmids DNA-binding proteins Calcium/metab Musculoskeletal system
机体组织细胞内广泛存在DNA结合蛋白，主要分布于核内，作为转录调控因子调节核内基因的转录和表达。最近，Hagstrom等[1]研究发现，在分离的家兔骨骼肌肌质网(sarcoplasmic reticulum, SR)上存在DNA结合蛋白，相对分子质量分别为95 000、60 000和28 000，称为非核DNA结合蛋白。本实验室在分离的大鼠骨骼肌SR中也发现了两种非核DNA结合蛋白，相对分子质量为83 000和58 000[2]。但是肌质网上存在的这类非核DNA结合蛋白的生物学意义目前尚不清楚。本实验在分离的大鼠骨骼肌肌质网上，观察了2种质粒DNA(即pcDNA3和pcDNA3/ANF)与蛋白结合后对肌质网Ca2+摄取及释放的影响，以探讨非核DNA结合蛋白的功能意义。
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1 材料与方法
1.1 动物及试剂
雄性Wistar大鼠，体重150～250 g，由北京医科大学动物部提供；45CaCl2为Amersham公司产品；其余试剂均为国产或进口分析纯试剂。
1.2 大鼠骨骼肌肌质网囊泡的制备
参照Ohlendieck等[3]的方法，取Wistar大鼠后肢骨骼肌组织20 g，冰浴中剪碎后匀浆，差速离心10 000 r.min-1,15 min；16 000 r.min-1,30 min；30 000 r.min-1,30 min。4 ℃,沉淀即为SR膜囊泡粗提物，考马斯亮蓝法进行蛋白定量，并贮存于-80 ℃备用。
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1.3 质粒DNA的制备
质粒pcDNA3，购自Invitrogen公司。质粒pcDNA3/ANF为本室构建，即在pcDNA3的多克隆位点插入心钠素(atrial natriuretic peptide, ANF)全长cDNA，质粒经转化大肠杆菌进行扩增，用聚乙二醇纯化，获得闭合环状DNA，-20 ℃贮存备用。
1.4 大鼠骨骼肌肌质网Ca2+摄取功能测定
参照Ortega等[4]的方法测定SR Ca2+ 摄入，反应体系每管200 μl，反应混合液组成(mmol.L-1)：KCl 100，MgCl2 5, CaCl2 0.05，HEPES 10，pH 7.1， 含200 μg SR蛋白，3.7×104 Bq(1 μCi) 45 CaCl2。加入5 mmol.L-1 Na2-ATP 37 ℃ 启动Ca2+摄取反应, 反应时间30 min,经微孔滤膜抽滤后液闪测定
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45 Ca2+放射强度。质粒DNA处理组分别应用pcDNA3及pcDNA3/ANF 10、20、30 μg预先与肌质网蛋白共同孵育30 min，然后测定SR Ca2+摄取功能。
1.5 大鼠骨骼肌肌质网Ca2+释放功能测定[4]
大鼠骨骼肌SR主动负载45Ca2+反应体系及反应过程同上，37 ℃孵育30 min后，离心12 000 r.min-1，5 min，弃上清，沉淀洗涤后，每管加入释放液(mmol.L-1: KCl 80, Tris-HCl 20，pH6.8, caffeine 10) 400 μl，并分别于1，3和5 min各取100 μl，测定45Ca2+放射活性。质粒DNA处理组分别应用20 μg pcDNA3及pcDNA3/ANF与肌质网膜蛋白共同孵育30 min, 而后测定SR Ca2+释放功能。
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1.6 统计学处理
所有数据均用
±s表示，两组之间比较用t检验，多组之间比较用方差分析，P<0.05认为差异具有显著性。
2 结果
2.1 质粒pcDNA3及pcDNA3/ANF对大鼠骨骼肌肌质网Ca2+摄入的影响
大鼠骨骼肌SR Ca2+摄入作用呈时间及蛋白浓度依赖性，结果分别见图1A及1B所示。质粒DNA预先孵育后的SR Ca2+摄入明显增加，且与质粒DNA呈剂量依赖关系；pcDNA3 10、20和30 μg预孵育后，SR Ca2+摄入分别较对照增加18%，54%和72%(均P<0.01)；同样，pcDNA3/ANF 10、20和30 μg预孵育后，SR Ca2+摄入分别较正常增加34%、50%和79%(均P<0.01)，两种质粒之间比较无显著性差异(P>0.05)，结果如图2所示。
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2.2 质粒pcDNA3及pcDNA3/ANF对大鼠骨骼肌肌质网Ca2+释放的影响
在对照组，预先负载45Ca2+的骨骼肌SR Ca2+释放随时间而增加，1、3和5 min释放量分别为每mg蛋白(0.31±0.03)、(0.65±0.04)和(1.27±0.07) nmol, 约为负载量的25%±9.2%、52%±5.3%和100%,5 min时几乎全部释放。实验组加入20 μg质粒DNA pcDNA3及pcDNA3/ANF与SR预孵育后SR Ca2+释放速度较对照组均明显增快，其中质粒pcDNA3处理组，1 min及3 min45Ca2+释放量为负载量的85%±6%及90%±8%，与对照组相比差异显著(均P<0.01); 质粒pcDNA3/ANF处理组，1 min及3 min 45Ca2+释放量为负载量的83%±11%及92%±7%，较对照组明显加快(均P<0.01); 但两种质粒之间比较无显著性差异(P>0.05)，结果如图3所示。
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A， time-course curve； B， dose-dependent curve； n=5.
图1 正常大鼠骨骼肌SR 钙摄入的时效曲线和量效曲线
Figure 1 The time-course curve and dose-dependent curve
of SR calcium uptake in normal rat skeletal muscle
3 讨论
1996年Hagstrom等[1]首次报道，家兔骨骼肌SR上存在有DNA结合蛋白，相对分子质量分别为95 000，60 000和28 000，称为非核DNA结合蛋白。本室在大鼠骨骼肌SR上也发现存在DNA结合蛋白，相对分子质量为83 000和58 000，并证实SR上存在的这类DNA结合蛋白与双链线状、环状及单链DNA的结合均无选择性，因此称为DNA序列非依赖性的非核DNA结合蛋白[2]。本工作在分离的大鼠骨骼肌SR上发现，质粒DNA pcDNA3及pcDNA3/ANF预先与SR上DNA结合蛋白结合后，SR Ca2+的摄入与释放功能均明显增强，即turnover加快，随机选用pcDNA3作为真核表达空载体代表，pcDNA3/ANF作为携带外源目的基因的嵌合质粒代表，结果显示两者对SR Ca2+转运作用类似，提示这一作用亦表现为非DNA序列依赖性。
, 百拇医药
**P<0.01, compared with control, n=5.
图2 质粒pcDNA3和pcDNA3/ANF对肌质网钙摄取的作用
Figure 2 Effect of plasmid pcDNA3 and pcDNA3/ANF
on SR calcium uptake
** P<0.01, compared with control, n=5.
图3 质粒pcDNA3及pcDNA3/ANF
对大鼠骨骼肌肌质网钙释放的影响
, 百拇医药
Figure 3 Effect of pcDNA3 and pcDNA3/ANF
on SR calcium release in rat skeletal muscle
骨骼肌SR在肌肉兴奋收缩耦联及维持胞浆Ca2+稳态方面起重要作用，其中起关键作用的环节就是SR对Ca2+的主动摄取与被动释放，肌质网对Ca2+的摄取主要依赖其膜上的Ca2+-ATPase的作用，Ca2+-ATPase的活性受到酶蛋白磷酸化/去磷酸化，膜脂质微环境的影响[5]，在重组的骨骼肌SR Ca2+-ATPase上发现负电荷磷脂是其强激活剂[5]。由于DNA本身携带有大量负电荷，因此推测质粒DNA与SR蛋白结合后使SR膜负电荷量显著增加，此膜环境的改变，可能促进SR 对Ca2+摄取。
, 百拇医药
SR上存在有两类钙释放通道，即IP3受体通道及ryanodine受体通道。IP3通过与SR上IP3特异性的受体结合开放离子通道，使Ca2+释放入胞浆中[6]；ryanodine受体通道位于SR终末池上，它可与一种中性植物碱ryanodine特异性结合，SR释放Ca2+不需耗能，而与终末池钙释放通道的变化有关[7]。DNA与SR上蛋白结合后对离子通道的影响尚不清楚，Hagstrom等[1]认为，存在SR上的DNA结合蛋白实际上就是SR上固有的一种蛋白triadin。我们推测质粒DNA可能通过与此蛋白的作用影响钙释放通道以促进SR钙释放。
本实验结果提示,DNA与SR上非核DNA结合蛋白结合后可以影响SR的Ca2+转运，进而可能参与胞浆钙稳态的调节，影响肌细胞的功能。骨骼肌因其容量大，血流量丰富等优势被作为直接基因转移并进行基因治疗的主要靶器官，但是到目前为止,有关直接基因转移并表达的机制以及DNA转染细胞后对细胞功能和代谢的影响仍不太清楚。本实验结果也提示，细胞在转基因处理后可能还存在有非目的基因表达的生物学意义，这些改变对细胞的生物学行为的影响值得重视和研究。
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国家“八六三”高技术项目基因治疗重大课题(BH-03)。
参考文献
1 Hagstrom JE, Rybakova IN, Wolff JA, et al. Nonnucleaer DNA binding proteins in striated muscle. Biochem Mol Med, 1996,58:113-121
2 赵 文，汤 健，贾弘
.序列非依赖性的骨骼肌膜DNA结合蛋白.北京医科大学学报, 1999，31(1):5-8
3 Ohlendieck K, Ervasti JM, Snook JB, et al. Dystrophin-glycoprotein complex is highly enriched in isolated skeletal muscle sarcolemma. J Cell Biol ,1991,112:135-1480
, http://www.100md.com
4 Ortega A,Gonzalez-Serratos H, Lepock JR. Effect of the organic Ca2+ channel blocker D-600 of sarcoplasmic reticulum Ca2+ uptake in skeletal muscle. Am J Physiol,1997,272:C310-C317
5 Suzuke T, Wang TH. The phosphorylation of purified phospholamban by cyclic AMP-dependent protein kinase is stimulated by phosphatidylinositol. J Biol Chem,1987,262:3880-3885
6 Hiromichi Y. Release of intracellularly stored Ca2+ by inositol 1,4,5-trisphosphate-an overview. Gen Pharmacol, 1990,21:387-393
7 Ogawa Y. Role of ryanodine receptors. Cri Rev Biochem Mol Biol, 1994,29:229-274
(1998-08-31收稿), http://www.100md.com
单位：赵 文 姜志胜 汤 健 刘乃奎 北京医科大学心血管基础研究所；贾弘 生物化学与分子生物学系，北京 100083；唐朝枢 李载权 第一医院心血管研究所
关键词：质粒；DNA结合蛋白质类；钙；代谢；肌肉骨骼系统
北京医科大学学报990403 摘 要 目的：观察DNA与骨骼肌肌质网蛋白结合后对肌质网功能的影响。方法：应用差速离心分离大鼠骨骼肌肌质网，并用45CaCl2作为示踪剂，观察质粒DNA pcDNA3和pcDNA3/ANF对肌质网钙转运功能的影响。结果：两种质粒均可明显增加肌质网Ca2+摄取，呈明显的量效关系，并且也可促进肌质网钙释放。结论：外源质粒DNA可影响肌质网钙转运功能。
中国图书资料分类法分类号 R337.1-332
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Effects of plasmid DNA on sarcoplasmic reticulum Ca2+ transport in rat skeletal muscle
ZHAO Wen#， LI Zai-Quan， JIANG Zhi-Sheng， TANG Jian ， JIA Hong-Ti， LIU Nai-Kui， TANG Chao-Shu
(#Institute of Cardiovascular Research， Beijing Medical University, Beijing 100083)
ABSTRACT Objective: To observe the effect of plasmid DNA binding to sarcoplasmic reticulum (SR) non-nuclear DNA binding proteins on SR function. Methods: SR vesicles of rat skeletal muscle were prepared by differential centrifuge. Effects of plasmids pcDNA3 and pcDNA3/ANF on SR Ca2+ transport were investigated by using 45CaCl2 as tracer. Results: Both plasmids could increase SR Ca2+ uptake significantly, which had significant dose-dependent relation and increased SR Ca2+ release. Conclusion: Plasmid DNA could influence SR Ca2+ transport.
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MeSH Plasmids DNA-binding proteins Calcium/metab Musculoskeletal system
机体组织细胞内广泛存在DNA结合蛋白，主要分布于核内，作为转录调控因子调节核内基因的转录和表达。最近，Hagstrom等[1]研究发现，在分离的家兔骨骼肌肌质网(sarcoplasmic reticulum, SR)上存在DNA结合蛋白，相对分子质量分别为95 000、60 000和28 000，称为非核DNA结合蛋白。本实验室在分离的大鼠骨骼肌SR中也发现了两种非核DNA结合蛋白，相对分子质量为83 000和58 000[2]。但是肌质网上存在的这类非核DNA结合蛋白的生物学意义目前尚不清楚。本实验在分离的大鼠骨骼肌肌质网上，观察了2种质粒DNA(即pcDNA3和pcDNA3/ANF)与蛋白结合后对肌质网Ca2+摄取及释放的影响，以探讨非核DNA结合蛋白的功能意义。
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1 材料与方法
1.1 动物及试剂
雄性Wistar大鼠，体重150～250 g，由北京医科大学动物部提供；45CaCl2为Amersham公司产品；其余试剂均为国产或进口分析纯试剂。
1.2 大鼠骨骼肌肌质网囊泡的制备
参照Ohlendieck等[3]的方法，取Wistar大鼠后肢骨骼肌组织20 g，冰浴中剪碎后匀浆，差速离心10 000 r.min-1,15 min；16 000 r.min-1,30 min；30 000 r.min-1,30 min。4 ℃,沉淀即为SR膜囊泡粗提物，考马斯亮蓝法进行蛋白定量，并贮存于-80 ℃备用。
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1.3 质粒DNA的制备
质粒pcDNA3，购自Invitrogen公司。质粒pcDNA3/ANF为本室构建，即在pcDNA3的多克隆位点插入心钠素(atrial natriuretic peptide, ANF)全长cDNA，质粒经转化大肠杆菌进行扩增，用聚乙二醇纯化，获得闭合环状DNA，-20 ℃贮存备用。
1.4 大鼠骨骼肌肌质网Ca2+摄取功能测定
参照Ortega等[4]的方法测定SR Ca2+ 摄入，反应体系每管200 μl，反应混合液组成(mmol.L-1)：KCl 100，MgCl2 5, CaCl2 0.05，HEPES 10，pH 7.1， 含200 μg SR蛋白，3.7×104 Bq(1 μCi) 45 CaCl2。加入5 mmol.L-1 Na2-ATP 37 ℃ 启动Ca2+摄取反应, 反应时间30 min,经微孔滤膜抽滤后液闪测定
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45 Ca2+放射强度。质粒DNA处理组分别应用pcDNA3及pcDNA3/ANF 10、20、30 μg预先与肌质网蛋白共同孵育30 min，然后测定SR Ca2+摄取功能。
1.5 大鼠骨骼肌肌质网Ca2+释放功能测定[4]
大鼠骨骼肌SR主动负载45Ca2+反应体系及反应过程同上，37 ℃孵育30 min后，离心12 000 r.min-1，5 min，弃上清，沉淀洗涤后，每管加入释放液(mmol.L-1: KCl 80, Tris-HCl 20，pH6.8, caffeine 10) 400 μl，并分别于1，3和5 min各取100 μl，测定45Ca2+放射活性。质粒DNA处理组分别应用20 μg pcDNA3及pcDNA3/ANF与肌质网膜蛋白共同孵育30 min, 而后测定SR Ca2+释放功能。
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1.6 统计学处理
所有数据均用
±s表示，两组之间比较用t检验，多组之间比较用方差分析，P<0.05认为差异具有显著性。2 结果
2.1 质粒pcDNA3及pcDNA3/ANF对大鼠骨骼肌肌质网Ca2+摄入的影响
大鼠骨骼肌SR Ca2+摄入作用呈时间及蛋白浓度依赖性，结果分别见图1A及1B所示。质粒DNA预先孵育后的SR Ca2+摄入明显增加，且与质粒DNA呈剂量依赖关系；pcDNA3 10、20和30 μg预孵育后，SR Ca2+摄入分别较对照增加18%，54%和72%(均P<0.01)；同样，pcDNA3/ANF 10、20和30 μg预孵育后，SR Ca2+摄入分别较正常增加34%、50%和79%(均P<0.01)，两种质粒之间比较无显著性差异(P>0.05)，结果如图2所示。
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2.2 质粒pcDNA3及pcDNA3/ANF对大鼠骨骼肌肌质网Ca2+释放的影响
在对照组，预先负载45Ca2+的骨骼肌SR Ca2+释放随时间而增加，1、3和5 min释放量分别为每mg蛋白(0.31±0.03)、(0.65±0.04)和(1.27±0.07) nmol, 约为负载量的25%±9.2%、52%±5.3%和100%,5 min时几乎全部释放。实验组加入20 μg质粒DNA pcDNA3及pcDNA3/ANF与SR预孵育后SR Ca2+释放速度较对照组均明显增快，其中质粒pcDNA3处理组，1 min及3 min45Ca2+释放量为负载量的85%±6%及90%±8%，与对照组相比差异显著(均P<0.01); 质粒pcDNA3/ANF处理组，1 min及3 min 45Ca2+释放量为负载量的83%±11%及92%±7%，较对照组明显加快(均P<0.01); 但两种质粒之间比较无显著性差异(P>0.05)，结果如图3所示。
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A， time-course curve； B， dose-dependent curve； n=5.
图1 正常大鼠骨骼肌SR 钙摄入的时效曲线和量效曲线
Figure 1 The time-course curve and dose-dependent curve
of SR calcium uptake in normal rat skeletal muscle
3 讨论
1996年Hagstrom等[1]首次报道，家兔骨骼肌SR上存在有DNA结合蛋白，相对分子质量分别为95 000，60 000和28 000，称为非核DNA结合蛋白。本室在大鼠骨骼肌SR上也发现存在DNA结合蛋白，相对分子质量为83 000和58 000，并证实SR上存在的这类DNA结合蛋白与双链线状、环状及单链DNA的结合均无选择性，因此称为DNA序列非依赖性的非核DNA结合蛋白[2]。本工作在分离的大鼠骨骼肌SR上发现，质粒DNA pcDNA3及pcDNA3/ANF预先与SR上DNA结合蛋白结合后，SR Ca2+的摄入与释放功能均明显增强，即turnover加快，随机选用pcDNA3作为真核表达空载体代表，pcDNA3/ANF作为携带外源目的基因的嵌合质粒代表，结果显示两者对SR Ca2+转运作用类似，提示这一作用亦表现为非DNA序列依赖性。
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**P<0.01, compared with control, n=5.
图2 质粒pcDNA3和pcDNA3/ANF对肌质网钙摄取的作用
Figure 2 Effect of plasmid pcDNA3 and pcDNA3/ANF
on SR calcium uptake
** P<0.01, compared with control, n=5.
图3 质粒pcDNA3及pcDNA3/ANF
对大鼠骨骼肌肌质网钙释放的影响
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Figure 3 Effect of pcDNA3 and pcDNA3/ANF
on SR calcium release in rat skeletal muscle
骨骼肌SR在肌肉兴奋收缩耦联及维持胞浆Ca2+稳态方面起重要作用，其中起关键作用的环节就是SR对Ca2+的主动摄取与被动释放，肌质网对Ca2+的摄取主要依赖其膜上的Ca2+-ATPase的作用，Ca2+-ATPase的活性受到酶蛋白磷酸化/去磷酸化，膜脂质微环境的影响[5]，在重组的骨骼肌SR Ca2+-ATPase上发现负电荷磷脂是其强激活剂[5]。由于DNA本身携带有大量负电荷，因此推测质粒DNA与SR蛋白结合后使SR膜负电荷量显著增加，此膜环境的改变，可能促进SR 对Ca2+摄取。
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SR上存在有两类钙释放通道，即IP3受体通道及ryanodine受体通道。IP3通过与SR上IP3特异性的受体结合开放离子通道，使Ca2+释放入胞浆中[6]；ryanodine受体通道位于SR终末池上，它可与一种中性植物碱ryanodine特异性结合，SR释放Ca2+不需耗能，而与终末池钙释放通道的变化有关[7]。DNA与SR上蛋白结合后对离子通道的影响尚不清楚，Hagstrom等[1]认为，存在SR上的DNA结合蛋白实际上就是SR上固有的一种蛋白triadin。我们推测质粒DNA可能通过与此蛋白的作用影响钙释放通道以促进SR钙释放。
本实验结果提示,DNA与SR上非核DNA结合蛋白结合后可以影响SR的Ca2+转运，进而可能参与胞浆钙稳态的调节，影响肌细胞的功能。骨骼肌因其容量大，血流量丰富等优势被作为直接基因转移并进行基因治疗的主要靶器官，但是到目前为止,有关直接基因转移并表达的机制以及DNA转染细胞后对细胞功能和代谢的影响仍不太清楚。本实验结果也提示，细胞在转基因处理后可能还存在有非目的基因表达的生物学意义，这些改变对细胞的生物学行为的影响值得重视和研究。
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国家“八六三”高技术项目基因治疗重大课题(BH-03)。
参考文献
1 Hagstrom JE, Rybakova IN, Wolff JA, et al. Nonnucleaer DNA binding proteins in striated muscle. Biochem Mol Med, 1996,58:113-121
2 赵 文，汤 健，贾弘
.序列非依赖性的骨骼肌膜DNA结合蛋白.北京医科大学学报, 1999，31(1):5-83 Ohlendieck K, Ervasti JM, Snook JB, et al. Dystrophin-glycoprotein complex is highly enriched in isolated skeletal muscle sarcolemma. J Cell Biol ,1991,112:135-1480
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4 Ortega A,Gonzalez-Serratos H, Lepock JR. Effect of the organic Ca2+ channel blocker D-600 of sarcoplasmic reticulum Ca2+ uptake in skeletal muscle. Am J Physiol,1997,272:C310-C317
5 Suzuke T, Wang TH. The phosphorylation of purified phospholamban by cyclic AMP-dependent protein kinase is stimulated by phosphatidylinositol. J Biol Chem,1987,262:3880-3885
6 Hiromichi Y. Release of intracellularly stored Ca2+ by inositol 1,4,5-trisphosphate-an overview. Gen Pharmacol, 1990,21:387-393
7 Ogawa Y. Role of ryanodine receptors. Cri Rev Biochem Mol Biol, 1994,29:229-274
(1998-08-31收稿), http://www.100md.com