大鼠骨骼肌肌质网序列非依赖性的DNA结合蛋白
作者：赵 文 倪菊华 汤 健 贾弘 薛 琳
单位：赵 文 汤 健北京医科大学心血管基础研究所，北京 100083；倪菊华 贾弘:生物化学与分子生物学系；薛 琳:第一医院心血管研究所
关键词：肌浆网；化学；印迹法；DNA；非核DNA结合蛋白☆
北京医科大学学报990102 摘 要 目的：观察大鼠骨骼肌肌质网上是否存在非核DNA结合蛋白。方法：应用差速离心及蔗糖密度梯度离心法分离大鼠骨骼肌肌质网膜蛋白，用32P-标记的DNA进行Southwestern印记杂交。结果：在大鼠骨骼肌肌质网膜中存在两种DNA结合蛋白，相对分子质量分别是83 000、58 000,这2种蛋白质可与不同的线状双链DNA,环状DNA及单链DNA结合。结论：大鼠骨骼肌肌质网膜中存在两种序列非依赖性DNA结合蛋白。
中国图书资料分类法分类号 Q513
, http://www.100md.com
Sequence-independent DNA binding proteins in rat skeletal muscle sarcoplasmic reticulum
ZHAO Wen#， NI Ju-Hua， TANG Jian， JIA Hong-Ti， XUE Lin
(#Institute of Cardiovascular Research, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Sarcoplasmic reticulum/chem Blotting, Southern Non-nuclear DNA binding proteins☆
ABSTRACT Objective: To observe whether there exist non-nuclear DNA binding proteins in rats skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. Methods: Skeletal muscle sarcoplasmic reticulum proteins were extracted by means of differential centrifuges and sucrose density gradient centrifuges, and southwestern hybridizations were carried out between 32P-labelled DNA and the proteins. Results:There are two DNA binding proteins, whose molecular weights are 83 000 and 58 000,in rat skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. These DNA binding proteins can bind various size and configuration of double-strand DNA, circle DNA and single-strand DNA. Conclusion:There are two sequence-independent DNA binding proteins in rats skeletal muscle sarcoplasmic reticulum.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ, 1999,31:5-8)
正常机体细胞内DNA 结合蛋白主要存在于核内及线粒体内，作为反式作用因子调控基因的转录与表达[1]。Hagstrom等[2]发现家兔骨骼肌肌质网中存在特异的DNA结合蛋白，但其作用及其生物学意义尚不清楚。本实验应用差速及蔗糖密度梯度离心，提取大鼠骨骼肌肌质网(sarcplasmic reticulum,SR)膜蛋白，用Southwestern印迹杂交，发现骨骼肌SR上存在两种DNA结合蛋白。
1 材料与方法
1.1 动物及试剂
实验选用SD大鼠，雄性，体重150～250g，由北京医科大学动物部提供。α-32P-dATP由北京亚辉公司提供，硝酸纤维素膜购自北京天象人公司，其余试剂均为国产及进口分析纯试剂。
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1.2 大鼠骨骼肌肌质网膜蛋白的提取
参照文献[3]方法，取Wistar大鼠后肢骨骼肌组织20g，冰浴中剪碎，以下所有过程均在0～4 ℃进行。加入7.5倍体积的缓冲液A，缓冲液A含20mmol.L-1焦磷酸钠、20mmol.L-1磷酸缓冲液、1mmol.L-1 MgCl2、0.303mol.L-1蔗糖、0.5mmol.L-1 EDTA、76.8nmol.L-1 aprotinin、1.1 μmol.L-1 leupeptin和0.23 mmol.L-1 PMSF。应用贝克曼公司内切式电动匀浆器匀浆3次，每次30 s。离心(10 000 r.min-1,15min)，上清液经6层纱布过滤，沉淀再复溶于5倍体积的上述缓冲液中，再次匀浆和离心(10000 r.min-1,15min)取上清，经6层纱布过滤，合并滤过液，离心(16000 r.min-1,30min)，沉淀用下列溶液孵育30 min,即0.6 mol.L-1 KCl、0.303 mol.L-1蔗糖、50 mmol.L-1 Tris.HCl,pH7.4,离心45000 r.min-1,30 min,沉淀即为肌质网膜囊泡粗提物，用缓冲液B复溶，缓冲液B中含20mmol.L-1 Tris.maleate、0.1 mmol.L-1 PMSF和0.303mol.L-1蔗糖,pH 7.0，应用考马斯亮蓝法进行蛋白定量，并贮存于-80 ℃备用。
, 百拇医药
1.3 DNA的制备[4]
本工作所用质粒DNA包括pCD2/pAdVantage/ADM,pcDNA3/ANF,pCD2/VEGF为本室构建，pBluescript(stratagene)。质粒经转化大肠杆菌进行扩增，应用聚乙二醇纯化，获得闭合环状DNA(close-circle DNA,ccDNA),再分别用BglⅡ,HindⅢ,BamHⅠ,EcoRⅠ酶切获得线状双链DNA(double-strand DNA,dsDNA)。应用煮沸法，热变形15～20min，使双链解链，获得单链DNA(single-strand DNA,ssDNA)。
1.4 32P标记DNA[4]
分别取100～200 ng上述dsDNA,应用111000GBq[32P]-dATP进行随机引物标记，其标记放射比活性大于109min-1。
, http://www.100md.com
1.5 Southwestern印迹杂交[2]
取50 μg纯化的SR膜蛋白进行SDS-PAGE电泳，并转移到硝酸纤维素膜上。先加入含有30g.L-1BSA的缓冲液(10mmol.L-1 Tris.Cl,150 mmol.L-1 NaCl,0.5 mmol.L-1 EDTA,pH7.4)在室温封闭过夜，再加入106min-1随机引物标记的探针，孵育12 h，然后以缓冲液洗膜，每次15 min，共3次，最后进行放射自显影，在竞争实验组，除了标记的探针外，同时还加入50～200倍非标记的ccDNA,dsDNA及ssDNA,同样杂交和洗膜。
1.6 骨骼肌肌质网膜蛋白纯度鉴定
, 百拇医药
应用文献[5]分别测定肌肉匀浆及SR膜制备的Ca2+-ATPase(肌质网标志酶),Na+-K+-ATPase(质膜标志酶) 及azide-ATPase(线粒体标志酶)的活性，以鉴定SR制备的纯度。
2 结果
2. 1 大鼠骨骼肌肌质网膜制备纯度鉴定
SR膜制备的Ca2+-ATPase的含量较骨骼肌组织匀浆升高6.5倍[nmol.mg-1.min-1:300±38(n=6) vs 40±14(n=6),P<0.01];SR膜制备的Na+-K+-ATPase及azide-ATPase的含量与骨骼肌组织匀浆相比含量均较低[nmol.mg-1.min-1: 14±3(n=6) vs 18±6(n=6), P>0.05; 56±14(n=6) vs 115±21(n=6),P<0.05]。提示此制备的SR膜纯度较高。
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2.2 不同长度的32P-dsDNA与骨骼肌肌质网膜蛋白的结合
骨骼肌SR膜蛋白电泳和Southwestern印迹杂交放射自显影后结果如图1和2所示,由图1可以看出，骨骼肌SR膜蛋白电泳后可获得20多个条带，相对分子质量在15 000～50 000之间。应用32P标记的ds pCD2/pAdVantage/ADM(6.7 kb)，dspcDNA3/ANF(5.9kb)及dspBluescript(2.9kb)与骨骼肌SR膜蛋白进行杂交，均可见到2条同样结合带，相对分子质量分别为83000和58000。提示在骨骼肌SR中，具有与DNA结合的蛋白，这种结合蛋白与质粒DNA大小无明显关系。
图1 大鼠骨骼肌肌质网膜蛋白电泳结果(b)
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及蛋白质相对分子质量标准(a)
Figure 1 Electrophoresis analysis of skeletal muscle sarcoplasmic
reticulum proteins in rats(b) and protein molecular weight marker(a)
a,pCD2/pAdVantage/ADM (6.7 kb); b,pcDNA3/ANF (5.9 kb);
c,pBluescript SK(+) (2.9 kb); d,pCD2/pAdVantage/ADM binding
to rat skeletal muscle nuclear proteins, compared with a,b,c.
, 百拇医药
图2 不同的32P-dsDNA与大鼠骨骼肌肌质网膜蛋白的结合Figure
2 Different size of 32P-dsDNA (a,b,c) binding to skeletal
muscle sarcoplasmic reticulum proteins in rats
2.3 不同构型的DNA对pcDNA3/ANF SR膜结合蛋白的竞争性抑制作用
应用100倍非标记的cc,ds和sspcDNA3/ANF对32P标记的dspcDNA3/ANF结合蛋白的竞争性抑制结果如图3所示,可以看出cc,ds和sspcDNA3/ANF均可竞争性抑制32P-dspcDNA3/ANF与骨骼肌SR膜蛋白的结合。提示SR中与DNA结合的蛋白，具有DNA相对特异性，但与质粒DNA的构型无明显关系。
, 百拇医药
a,32P-dspcDNA3/ANF alone; b,32P-dspcDNA3/ANF+colddspcDNA3/ANF; c,32P-dspcDNA3/ANF+cold ccpcDNA3/ANF; d,32P-dspcDNA3/ANF+cold sspcDNA3/ANF.
图3 不同构型的DNA对32P-dspcDNA3/ANF与
大鼠骨骼肌肌质网膜蛋白结合的竞争性抑制作用
Figure 3 The competing inhibition of different structural
, 百拇医药
DNA (b,c,d) on 32P-dspcDNA3/ANF binding proteins(a) of
rats skeletal muscle sarcoplasmic reticulum
2.4 不同的质粒DNA对骨骼肌SR膜DNA结合蛋白的竞争性抑制作用
为了观察不同的质粒DNA对骨骼肌SR膜DNA结合蛋白的作用，选用50～200倍非标记的质粒pCD2/VEGF，观察质粒对32P标记的dspCD2/pAdVantage/ADM,dspcDNA3/ANF及dspBlue-
script结合蛋白的影响，结果发现pCD2/VEGF均可竞争性抑制上述3种dsDNA与骨骼肌SR膜蛋白的结合，其中加入50倍的竞争剂组尚可见微弱的结合带的存在(图4)。提示SR上 DNA结合蛋白与质粒DNA的结合无明显选择性。
, http://www.100md.com
a,32P-dspCD2/pAdVantage/ADM; b,32P-dspCD2/pAdVantage/ADM+50-fold cold pCD2/VEGF; c,32P-dspcDNA3/ANF; d,32P-dspcDNA3/
ANF+100-fold cold pCD2/VEGF; e,32P-dspBluescriptSK(+); f,32P-dspBluescript SK(+)+200-fold cold pCD2/VEGF.
图4 不同的质粒DNA对骨骼肌肌质网膜DNA
结合蛋白的竞争性抑制作用
, 百拇医药
Figuire 4 The competing inhibition of different plasmid DNA on
skeletal muscle sarcoplasmic reticulum DNA binding proteins in rats
3 讨论
最近，Hangstrom等[2]发现在家兔骨骼肌肌浆网膜上存在相对分子质量分别为95 000，60 000，28 000的特异DNA结合蛋白，其与线状双链DNA有较高的亲和力。本实验在大鼠骨骼肌肌质网膜蛋白中也发现了两种DNA结合蛋白质，相对分子质量为83 000及58 000,而且不同的双链DNA均可与之结合，应用非标记的同一线状双链DNA、环状DNA、单链DNA及不同的环状DNA均可竞争性抑制这种结合，提示这两种SR膜DNA结合蛋白与不同的线状、环状及单链DNA结合不具有选择性，即可认为这是一种DNA序列非依赖性的结合。
, 百拇医药
近年研究发现胞浆中也存在一些DNA结合蛋白，例如信号传导子和转录激活子(signal transducers and activators of transcription, STAT)家族，这类蛋白质正常时存在于胞浆中，当细胞受到外界刺激时，可以发生核转位，进入核内作为转录调控因子发挥作用[6]。本实验中所检测到的肌质网非核DNA结合蛋白也属于胞浆DNA结合蛋白，其存在的意义及生物学功能尚不清楚，作者推测它也许可作为一种胞浆转录调控因子在机体细胞受到外界因素刺激时发生核转位，从而调控基因的表达；或许作为肌质网上一种固有的蛋白质，调节肌质网的主要功能——兴奋收缩偶联，有待进一步研究。
最近本实验室的研究还发现，肌肉注射质粒DNA之后可影响肌细胞胞浆cAMP及cGMP水平，提示外源DNA可能作为信息分子影响肌细胞的信号转导[7]。本实验发现外源质粒DNA可与肌质网膜蛋白特异结合，这种结合是否可作为外源DNA转染入细胞之后的一条细胞内通路以及结合之后可否调控外源基因的表达，或者转染基因对肌质网可否发挥非目的基因表达的生物学作用尚不清楚，有待更深入的研究。
, 百拇医药
* 国家“八六三”高技术项目基因治疗重大课题(BH-03)；
☆ 自由词。
参考文献
1 顾天爵主编.基因转录调控元件.生物化学.北京：人民卫生出版社， 1995.289-291
2 Hagstrom JE, Rybakova IN, Wolff JA, et al. Nonnuclear DNA binding proteins in striated muscle. Biochem Mol Med, 1996,58:113-121
3 Ohlendieck K, Ervasti JM, Snook JB, et al. Dystrophin-glycoprotein complex is highly enriched in isolated skeletal muscle sarcolemma. J Cell Biol, 1991,112:135-1480
, 百拇医药
4 萨姆布鲁克，弗里奇，曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟枫译.质粒DNA的提取与纯化.分子克隆.第2版.北京：科学出版社， 1995.16-34
5 Jones LR, Besch HR Jr. Isolation of canine sarcolemmal vesicles. Methods Pharmacol, 1984,5:1-12
6 Darnell JE Jr. STATs and gene regulation. Science, 1997,277:1630-1635
7 赵 文，汤 健，贾弘
.直接肌注射质粒DNA对肌组织cAMP,cGMP含量的影响.基础医学与临床， 1998，6：25-27
(1998-03-25收稿)
(本文编辑：王 蕾), http://www.100md.com
单位：赵 文 汤 健北京医科大学心血管基础研究所，北京 100083；倪菊华 贾弘:生物化学与分子生物学系；薛 琳:第一医院心血管研究所
关键词：肌浆网；化学；印迹法；DNA；非核DNA结合蛋白☆
北京医科大学学报990102 摘 要 目的：观察大鼠骨骼肌肌质网上是否存在非核DNA结合蛋白。方法：应用差速离心及蔗糖密度梯度离心法分离大鼠骨骼肌肌质网膜蛋白，用32P-标记的DNA进行Southwestern印记杂交。结果：在大鼠骨骼肌肌质网膜中存在两种DNA结合蛋白，相对分子质量分别是83 000、58 000,这2种蛋白质可与不同的线状双链DNA,环状DNA及单链DNA结合。结论：大鼠骨骼肌肌质网膜中存在两种序列非依赖性DNA结合蛋白。
中国图书资料分类法分类号 Q513
, http://www.100md.com
Sequence-independent DNA binding proteins in rat skeletal muscle sarcoplasmic reticulum
ZHAO Wen#， NI Ju-Hua， TANG Jian， JIA Hong-Ti， XUE Lin
(#Institute of Cardiovascular Research, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Sarcoplasmic reticulum/chem Blotting, Southern Non-nuclear DNA binding proteins☆
ABSTRACT Objective: To observe whether there exist non-nuclear DNA binding proteins in rats skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. Methods: Skeletal muscle sarcoplasmic reticulum proteins were extracted by means of differential centrifuges and sucrose density gradient centrifuges, and southwestern hybridizations were carried out between 32P-labelled DNA and the proteins. Results:There are two DNA binding proteins, whose molecular weights are 83 000 and 58 000,in rat skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. These DNA binding proteins can bind various size and configuration of double-strand DNA, circle DNA and single-strand DNA. Conclusion:There are two sequence-independent DNA binding proteins in rats skeletal muscle sarcoplasmic reticulum.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ, 1999,31:5-8)
正常机体细胞内DNA 结合蛋白主要存在于核内及线粒体内，作为反式作用因子调控基因的转录与表达[1]。Hagstrom等[2]发现家兔骨骼肌肌质网中存在特异的DNA结合蛋白，但其作用及其生物学意义尚不清楚。本实验应用差速及蔗糖密度梯度离心，提取大鼠骨骼肌肌质网(sarcplasmic reticulum,SR)膜蛋白，用Southwestern印迹杂交，发现骨骼肌SR上存在两种DNA结合蛋白。
1 材料与方法
1.1 动物及试剂
实验选用SD大鼠，雄性，体重150～250g，由北京医科大学动物部提供。α-32P-dATP由北京亚辉公司提供，硝酸纤维素膜购自北京天象人公司，其余试剂均为国产及进口分析纯试剂。
, http://www.100md.com
1.2 大鼠骨骼肌肌质网膜蛋白的提取
参照文献[3]方法，取Wistar大鼠后肢骨骼肌组织20g，冰浴中剪碎，以下所有过程均在0～4 ℃进行。加入7.5倍体积的缓冲液A，缓冲液A含20mmol.L-1焦磷酸钠、20mmol.L-1磷酸缓冲液、1mmol.L-1 MgCl2、0.303mol.L-1蔗糖、0.5mmol.L-1 EDTA、76.8nmol.L-1 aprotinin、1.1 μmol.L-1 leupeptin和0.23 mmol.L-1 PMSF。应用贝克曼公司内切式电动匀浆器匀浆3次，每次30 s。离心(10 000 r.min-1,15min)，上清液经6层纱布过滤，沉淀再复溶于5倍体积的上述缓冲液中，再次匀浆和离心(10000 r.min-1,15min)取上清，经6层纱布过滤，合并滤过液，离心(16000 r.min-1,30min)，沉淀用下列溶液孵育30 min,即0.6 mol.L-1 KCl、0.303 mol.L-1蔗糖、50 mmol.L-1 Tris.HCl,pH7.4,离心45000 r.min-1,30 min,沉淀即为肌质网膜囊泡粗提物，用缓冲液B复溶，缓冲液B中含20mmol.L-1 Tris.maleate、0.1 mmol.L-1 PMSF和0.303mol.L-1蔗糖,pH 7.0，应用考马斯亮蓝法进行蛋白定量，并贮存于-80 ℃备用。
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1.3 DNA的制备[4]
本工作所用质粒DNA包括pCD2/pAdVantage/ADM,pcDNA3/ANF,pCD2/VEGF为本室构建，pBluescript(stratagene)。质粒经转化大肠杆菌进行扩增，应用聚乙二醇纯化，获得闭合环状DNA(close-circle DNA,ccDNA),再分别用BglⅡ,HindⅢ,BamHⅠ,EcoRⅠ酶切获得线状双链DNA(double-strand DNA,dsDNA)。应用煮沸法，热变形15～20min，使双链解链，获得单链DNA(single-strand DNA,ssDNA)。
1.4 32P标记DNA[4]
分别取100～200 ng上述dsDNA,应用111000GBq[32P]-dATP进行随机引物标记，其标记放射比活性大于109min-1。
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1.5 Southwestern印迹杂交[2]
取50 μg纯化的SR膜蛋白进行SDS-PAGE电泳，并转移到硝酸纤维素膜上。先加入含有30g.L-1BSA的缓冲液(10mmol.L-1 Tris.Cl,150 mmol.L-1 NaCl,0.5 mmol.L-1 EDTA,pH7.4)在室温封闭过夜，再加入106min-1随机引物标记的探针，孵育12 h，然后以缓冲液洗膜，每次15 min，共3次，最后进行放射自显影，在竞争实验组，除了标记的探针外，同时还加入50～200倍非标记的ccDNA,dsDNA及ssDNA,同样杂交和洗膜。
1.6 骨骼肌肌质网膜蛋白纯度鉴定
, 百拇医药
应用文献[5]分别测定肌肉匀浆及SR膜制备的Ca2+-ATPase(肌质网标志酶),Na+-K+-ATPase(质膜标志酶) 及azide-ATPase(线粒体标志酶)的活性，以鉴定SR制备的纯度。
2 结果
2. 1 大鼠骨骼肌肌质网膜制备纯度鉴定
SR膜制备的Ca2+-ATPase的含量较骨骼肌组织匀浆升高6.5倍[nmol.mg-1.min-1:300±38(n=6) vs 40±14(n=6),P<0.01];SR膜制备的Na+-K+-ATPase及azide-ATPase的含量与骨骼肌组织匀浆相比含量均较低[nmol.mg-1.min-1: 14±3(n=6) vs 18±6(n=6), P>0.05; 56±14(n=6) vs 115±21(n=6),P<0.05]。提示此制备的SR膜纯度较高。
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2.2 不同长度的32P-dsDNA与骨骼肌肌质网膜蛋白的结合
骨骼肌SR膜蛋白电泳和Southwestern印迹杂交放射自显影后结果如图1和2所示,由图1可以看出，骨骼肌SR膜蛋白电泳后可获得20多个条带，相对分子质量在15 000～50 000之间。应用32P标记的ds pCD2/pAdVantage/ADM(6.7 kb)，dspcDNA3/ANF(5.9kb)及dspBluescript(2.9kb)与骨骼肌SR膜蛋白进行杂交，均可见到2条同样结合带，相对分子质量分别为83000和58000。提示在骨骼肌SR中，具有与DNA结合的蛋白，这种结合蛋白与质粒DNA大小无明显关系。
图1 大鼠骨骼肌肌质网膜蛋白电泳结果(b)
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及蛋白质相对分子质量标准(a)
Figure 1 Electrophoresis analysis of skeletal muscle sarcoplasmic
reticulum proteins in rats(b) and protein molecular weight marker(a)
a,pCD2/pAdVantage/ADM (6.7 kb); b,pcDNA3/ANF (5.9 kb);
c,pBluescript SK(+) (2.9 kb); d,pCD2/pAdVantage/ADM binding
to rat skeletal muscle nuclear proteins, compared with a,b,c.
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图2 不同的32P-dsDNA与大鼠骨骼肌肌质网膜蛋白的结合Figure
2 Different size of 32P-dsDNA (a,b,c) binding to skeletal
muscle sarcoplasmic reticulum proteins in rats
2.3 不同构型的DNA对pcDNA3/ANF SR膜结合蛋白的竞争性抑制作用
应用100倍非标记的cc,ds和sspcDNA3/ANF对32P标记的dspcDNA3/ANF结合蛋白的竞争性抑制结果如图3所示,可以看出cc,ds和sspcDNA3/ANF均可竞争性抑制32P-dspcDNA3/ANF与骨骼肌SR膜蛋白的结合。提示SR中与DNA结合的蛋白，具有DNA相对特异性，但与质粒DNA的构型无明显关系。
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a,32P-dspcDNA3/ANF alone; b,32P-dspcDNA3/ANF+colddspcDNA3/ANF; c,32P-dspcDNA3/ANF+cold ccpcDNA3/ANF; d,32P-dspcDNA3/ANF+cold sspcDNA3/ANF.
图3 不同构型的DNA对32P-dspcDNA3/ANF与
大鼠骨骼肌肌质网膜蛋白结合的竞争性抑制作用
Figure 3 The competing inhibition of different structural
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DNA (b,c,d) on 32P-dspcDNA3/ANF binding proteins(a) of
rats skeletal muscle sarcoplasmic reticulum
2.4 不同的质粒DNA对骨骼肌SR膜DNA结合蛋白的竞争性抑制作用
为了观察不同的质粒DNA对骨骼肌SR膜DNA结合蛋白的作用，选用50～200倍非标记的质粒pCD2/VEGF，观察质粒对32P标记的dspCD2/pAdVantage/ADM,dspcDNA3/ANF及dspBlue-
script结合蛋白的影响，结果发现pCD2/VEGF均可竞争性抑制上述3种dsDNA与骨骼肌SR膜蛋白的结合，其中加入50倍的竞争剂组尚可见微弱的结合带的存在(图4)。提示SR上 DNA结合蛋白与质粒DNA的结合无明显选择性。
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a,32P-dspCD2/pAdVantage/ADM; b,32P-dspCD2/pAdVantage/ADM+50-fold cold pCD2/VEGF; c,32P-dspcDNA3/ANF; d,32P-dspcDNA3/
ANF+100-fold cold pCD2/VEGF; e,32P-dspBluescriptSK(+); f,32P-dspBluescript SK(+)+200-fold cold pCD2/VEGF.
图4 不同的质粒DNA对骨骼肌肌质网膜DNA
结合蛋白的竞争性抑制作用
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Figuire 4 The competing inhibition of different plasmid DNA on
skeletal muscle sarcoplasmic reticulum DNA binding proteins in rats
3 讨论
最近，Hangstrom等[2]发现在家兔骨骼肌肌浆网膜上存在相对分子质量分别为95 000，60 000，28 000的特异DNA结合蛋白，其与线状双链DNA有较高的亲和力。本实验在大鼠骨骼肌肌质网膜蛋白中也发现了两种DNA结合蛋白质，相对分子质量为83 000及58 000,而且不同的双链DNA均可与之结合，应用非标记的同一线状双链DNA、环状DNA、单链DNA及不同的环状DNA均可竞争性抑制这种结合，提示这两种SR膜DNA结合蛋白与不同的线状、环状及单链DNA结合不具有选择性，即可认为这是一种DNA序列非依赖性的结合。
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近年研究发现胞浆中也存在一些DNA结合蛋白，例如信号传导子和转录激活子(signal transducers and activators of transcription, STAT)家族，这类蛋白质正常时存在于胞浆中，当细胞受到外界刺激时，可以发生核转位，进入核内作为转录调控因子发挥作用[6]。本实验中所检测到的肌质网非核DNA结合蛋白也属于胞浆DNA结合蛋白，其存在的意义及生物学功能尚不清楚，作者推测它也许可作为一种胞浆转录调控因子在机体细胞受到外界因素刺激时发生核转位，从而调控基因的表达；或许作为肌质网上一种固有的蛋白质，调节肌质网的主要功能——兴奋收缩偶联，有待进一步研究。
最近本实验室的研究还发现，肌肉注射质粒DNA之后可影响肌细胞胞浆cAMP及cGMP水平，提示外源DNA可能作为信息分子影响肌细胞的信号转导[7]。本实验发现外源质粒DNA可与肌质网膜蛋白特异结合，这种结合是否可作为外源DNA转染入细胞之后的一条细胞内通路以及结合之后可否调控外源基因的表达，或者转染基因对肌质网可否发挥非目的基因表达的生物学作用尚不清楚，有待更深入的研究。
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* 国家“八六三”高技术项目基因治疗重大课题(BH-03)；
☆ 自由词。
参考文献
1 顾天爵主编.基因转录调控元件.生物化学.北京：人民卫生出版社， 1995.289-291
2 Hagstrom JE, Rybakova IN, Wolff JA, et al. Nonnuclear DNA binding proteins in striated muscle. Biochem Mol Med, 1996,58:113-121
3 Ohlendieck K, Ervasti JM, Snook JB, et al. Dystrophin-glycoprotein complex is highly enriched in isolated skeletal muscle sarcolemma. J Cell Biol, 1991,112:135-1480
, 百拇医药
4 萨姆布鲁克，弗里奇，曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟枫译.质粒DNA的提取与纯化.分子克隆.第2版.北京：科学出版社， 1995.16-34
5 Jones LR, Besch HR Jr. Isolation of canine sarcolemmal vesicles. Methods Pharmacol, 1984,5:1-12
6 Darnell JE Jr. STATs and gene regulation. Science, 1997,277:1630-1635
7 赵 文，汤 健，贾弘
.直接肌注射质粒DNA对肌组织cAMP,cGMP含量的影响.基础医学与临床， 1998，6：25-27(1998-03-25收稿)
(本文编辑：王 蕾), http://www.100md.com