爆震后豚鼠耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞定量观察
作者：周义德 张青 吴皓 李兆基
单位：第二军医大学长海医院耳鼻咽喉科，上海 200433
关键词：爆震；耳蜗毛细胞；螺旋神经节细胞；聋
第二军医大学学报001215 [摘要] 目的：观察爆震后耳蜗毛细胞和 螺旋神经节细胞的变化。方法：复制强脉冲噪声致聋豚鼠模型，以脑 干听觉诱发电位测试仪测定听神经脑干反应(ABR)阈值，通过耳蜗铺片计算机图像分析行 毛细胞计数，耳蜗病理切片螺旋神经节细胞计数。结果：正常对照组 和噪声暴露后21 d的实验组耳蜗钩回、第1和第2回毛细胞总数分别为3 599±159.6个，6 02 2±98.4个；二下螺旋神经节细胞计数分别为(51±4.72)个，(27±6.94)个，以上 均数各组间相 差显著。 结论：爆震后不仅ABR阈值升高，毛细胞数减少，而且耳蜗螺旋神经节细胞数也 明显减少。
[中图分类号] R 764.4302 [文献标识码] A
, 百拇医药
[文章编号] 0258-879X(2000)12-1143-03
A quantitative study on cochlear hair cells and spiral ganglion cells after blast exposure in guinea pigs
ZHOU Yi-De ZHANG Qing WU Hao LI Zhao-Ji
(Department of Otolaryngology, C hanghai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
[ABSTRACT] Objective: To study quantitative changes of coch lear hair cells and spiral ganglion cells after blast exposure in guinea p igs. Methods: The number of hair cells was calculated using the surface specimen technique and computer image analysis technique after blast exp osure. The number of spiral ganglion cells was calculated using pathologic tech nique and computer image analysis technique after blast exposure. Result s: Quantitative observation was carried out 21 days after blast expo sure. The number of total hair cells in uncus, the first and second gyre in norm al control group and in blast group was 3 599±159.6 and 6 022±98.4 respectively, and the number of spiral gangli on cells in the 2-low parts of cochlear in normal control group and in blast gr oup was 51±4.72 and 27±6.94 respectively, the difference in me an value between the groups be ing significant. Conclusion: Not only the hair cells reduce, b ut also the spiral ganglion cells are severely damaged after blast exposure.
, 百拇医药
[KEY WORDS] noise; cochlear hair cells; spiral ganglion cells; hear ing loss
爆震后豚鼠Corti器中毛细胞大量缺失，而爆震后耳蜗螺旋神经节细胞的变化情况如何 尚不清楚。为此，我们制备豚鼠爆震致聋模型，应用计算机辅助测定图像分析和病理切片检 测爆震后耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞的变化。
1 材料和方法
1.1 动物的选择及分组 选用耳廓反射正常，体质量200 g左右的健康杂种豚鼠1 6只，随机分为正常对照组和爆震组，每组8只。
1.2 噪声源 强脉冲噪声声源系由特制的D-86电火花脉冲发生器(上海江湾一 厂生产)。爆震组动物暴露80发，间隔2 s，脉宽0.5 ms,压力峰值172.0 dB spl， 正常对照组不接受噪声。
, http://www.100md.com
1.3 ABR阈值测定 用豚鼠固定装置固定豚鼠，用Madenson-2250型脑干听 觉诱发电位测试仪测定豚鼠清醒状态下ABR阈值，记录电极置颅顶正中部，参考电极和接地 电极分别置于同侧和对侧耳廓。噪声暴露前后测试时电极放置位点相同。刺激声为宽频带短 声(click)，脉冲宽度为0.1 ms，扫描时程10 ms，叠加256次。以出现最稳定的Ⅲ波刚消 失时的声刺激强度作为该耳的听反应阈。爆震组豚鼠测定爆震前及爆震后3 h，3 d，21 d的 ABR阈值,正常对照组则在对应时间测试。
1.4 琥珀酸脱氢酶(SDH)染色铺片和图像分析行毛细胞计数 噪声暴露后21 d，所有实验组和对照组动物均在麻醉状态下断头处死，快速取出左侧耳蜗并进行蜗管内灌 注硝基四氮唑蓝(NBT)配制的SDH染色液，37℃温箱内孵育60 min，固定，脱钙后解剖 显微镜下剥去蜗壳，按文献[1]介绍的方法制备耳蜗铺片标本，备用。耳蜗毛细胞 计数采用计算机图像分析处理。毛细胞计数是先测量从钩回到顶回基底膜上各回每排毛细胞 的长度，再根据各回每排单位长度内毛细胞个数而计算出各回毛细胞数，各回相加即得到毛 细胞总数。
, 百拇医药
1.5 螺旋神经节细胞计数 噪声暴露后21 d，所有实验组和对照组动物均在麻醉 状 态下断头处死，快速取出右侧耳蜗并进行蜗管内灌注10%甲醛液并固定于该液24 h，10%甲 酸脱钙72 h，石蜡包埋，制作7 μm 厚连续中轴切片，H-E染色。光镜下，按文献[2]所 述方法稍加改进，目镜加网格片，在40×10倍下直接计数蜗螺旋管中有核神经节细胞数，每 只耳蜗连续计数5张中轴切片，取其均值。
1.6 统计学处理 数据以
±s表示，用t检验进行显著性检测 。
2 结 果
2.1 豚鼠ABR阈值改变 对照组和实验组的ABR阈值见表1。此表可以看出，爆震 前两组 豚鼠ABR阈值无差异，表明所用豚鼠组间条件相同。爆震后不仅3 h和3 d ABR阈值差异显著 ，21 d后两者间差异依然存在。
, 百拇医药
表1 爆震前后不同时间ABR阈值
Tab 1 The change of ABR threshold before and after blast
(±s，LI/dB) Group
Ears
Before blast
After blast
3 h
3 d
21 d
, http://www.100md.com
Control
8
39.0±3.82
39.0±3.82
38.0±4.04
40.4±3.57
Blast group
8
37.5±3.04
93.5±6.93**
84.5±6.56**
, http://www.100md.com
80 .0±8.94**
**P<0.01 vs control group
2.2 毛细胞的变化 耳蜗SDH染色铺片,见正常组各回均有整齐排列的3排外毛细胞和1排内毛细胞，毛细胞自然缺失率极少。爆震后21 d出 现大量的毛细胞缺失，其中减少主要在钩回(484±63.8)个、第1回(1 943±210.4)个、 第2回(688±204.7)个，与对照组(1 278±65.2)，(2 712±110.5)，(2 032±119.4 )个相比差异显著(P<0.01)。
2.3 螺旋神经节细胞的变化 正常对照组耳蜗螺旋管内螺旋神经节部位螺旋神经 节细胞清晰可见，爆震组豚鼠相应部位螺旋神经节细胞数减少，减少的神经节细胞主要发生 在耳蜗螺旋管内螺旋神经节部位的一上和二下，爆震后21 d耳蜗螺旋神经节细胞计数结果见 表2。
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表 2 噪声暴露后21 d耳蜗螺旋神经节细胞变化
Tab 2 The change of spiral ganglion cells 21 d after blast exposure
(n=5,±s ) Group
Ears
The number of spiral ganglion cells
1 low
1 up
2 low
2 up
, http://www.100md.com
3 low
3 up
4
Control
8
54±8.36
56±3.81
51±4.72
42± 2.96
41±2.83
43±5.10
41±2.97
, 百拇医药 Blast group
8
52±7.32
41±4.86*
27±6.94**
38±4.75
3 8±2.98
41±5.44
39±3.26
*P<0.05; ** P<0.01 vs control group3 讨 论
, http://www.100md.com 爆震后听阈的改变和内耳Corti器毛细胞的缺失在以往的动物实验中已得到广泛的证实 [3]。本实验应用计算机辅助图像分析定量观察爆震后内耳毛细胞的变化，与以往用普 通耳蜗硬铺片显微镜测微尺测量法、火棉胶连续切片耳蜗描摹翻造法以及扫描电镜测量 法比较，实验手段较先进，结果也较可靠。从正常对照组和实验组毛细胞计数结果来看，两 组间只有钩回、第1回和第2回相差明显(P<0.01)，其余各回差异不大。可能 与爆震声的频率有关。
本实验主要目的是观察爆震后在毛细胞大量缺失和听阈明显升高时，对应的螺旋神经节细胞 数量的变化。从实验结果来看，由于耳蜗基底膜及其对应的螺旋神经节细胞是围绕蜗轴3圈 半多排列，故耳蜗中轴切片上可见7个部位存在螺旋神经节细胞，由蜗底到蜗顶分别称为一 下、一上、二下、二上、三下、三上和四，而爆震后21 d螺旋神经节细胞数量较对照组明显 减少的只有一上和二下，与基底膜上毛细胞缺失最明显的钩回、第一回和第二回基本相对应 ，说明爆震后毛细胞损伤的同时，耳蜗螺旋神经节细胞也同样受到损伤。其损伤的机制可能 与耳蜗螺旋神经节细胞发生继发性退行性改变有关[4]。
, 百拇医药
研究耳蜗螺旋神经节细胞病变的目的主要是
为进一步的治疗研究提供病理基础和疗效判定的方法。目前对于中重度神 经性耳聋尚无可靠的治疗手段，探索某些有价值的药物对耳蜗神经元损伤修复的作用，可 能为最终解决这一难题带来新的希望。
[作者简介] 周义德(1966-)，男(汉族)，硕士，主治医师，讲师.
参考文献
[1] 周义德,翟所强,杨伟炎,等.睫状神经营养因子防治强脉冲噪声对豚鼠 内耳损伤的试验研究[J].中华耳鼻咽喉科杂志,1999, 34(3):150-153.
[2] 方耀云,姚行齐,姜泗长.老化豚鼠耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞定量研究[J] .中国体视学与图像分析,1996, 1(1)：64-67.
, 百拇医药
[3] 孙建和,郗 昕,姜泗长，等.豚鼠耳蜗毛细胞的定量观察[J].中国体视学与 图像分析,1996,1(1)：68-70.
[4] 王锦玲,姜鸿彦,刘顺利，等.表皮生长因子及地塞米松对爆炸性耳聋治疗作用的 试验研究[J].中华耳鼻咽喉科杂志, 1996,31(3)：136-138.
[5] Mill JM, Chi DH, O`keefe LJ, et al, Neurotrophins can enhance spi ral ganglion cell survival after inner hair cell loss[J]. Int J Dev Neurosci ， 1997， 15(4-5):631-643.
[6] Ylikoski J, Pirvola U, Virkkaka J， et al. Guinea pig auditory ne urons are protected by glial cell line-deried growth factor from degeneration a fter noise trauma[J]. Hear Res, 1998, 124(1-2):17-26.
[收稿日期] 2000-06-15
[修回日期] 2000-09-21, 百拇医药
单位：第二军医大学长海医院耳鼻咽喉科，上海 200433
关键词：爆震；耳蜗毛细胞；螺旋神经节细胞；聋
第二军医大学学报001215 [摘要] 目的：观察爆震后耳蜗毛细胞和 螺旋神经节细胞的变化。方法：复制强脉冲噪声致聋豚鼠模型，以脑 干听觉诱发电位测试仪测定听神经脑干反应(ABR)阈值，通过耳蜗铺片计算机图像分析行 毛细胞计数，耳蜗病理切片螺旋神经节细胞计数。结果：正常对照组 和噪声暴露后21 d的实验组耳蜗钩回、第1和第2回毛细胞总数分别为3 599±159.6个，6 02 2±98.4个；二下螺旋神经节细胞计数分别为(51±4.72)个，(27±6.94)个，以上 均数各组间相 差显著。 结论：爆震后不仅ABR阈值升高，毛细胞数减少，而且耳蜗螺旋神经节细胞数也 明显减少。
[中图分类号] R 764.4302 [文献标识码] A
, 百拇医药
[文章编号] 0258-879X(2000)12-1143-03
A quantitative study on cochlear hair cells and spiral ganglion cells after blast exposure in guinea pigs
ZHOU Yi-De ZHANG Qing WU Hao LI Zhao-Ji
(Department of Otolaryngology, C hanghai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
[ABSTRACT] Objective: To study quantitative changes of coch lear hair cells and spiral ganglion cells after blast exposure in guinea p igs. Methods: The number of hair cells was calculated using the surface specimen technique and computer image analysis technique after blast exp osure. The number of spiral ganglion cells was calculated using pathologic tech nique and computer image analysis technique after blast exposure. Result s: Quantitative observation was carried out 21 days after blast expo sure. The number of total hair cells in uncus, the first and second gyre in norm al control group and in blast group was 3 599±159.6 and 6 022±98.4 respectively, and the number of spiral gangli on cells in the 2-low parts of cochlear in normal control group and in blast gr oup was 51±4.72 and 27±6.94 respectively, the difference in me an value between the groups be ing significant. Conclusion: Not only the hair cells reduce, b ut also the spiral ganglion cells are severely damaged after blast exposure.
, 百拇医药
[KEY WORDS] noise; cochlear hair cells; spiral ganglion cells; hear ing loss
爆震后豚鼠Corti器中毛细胞大量缺失，而爆震后耳蜗螺旋神经节细胞的变化情况如何 尚不清楚。为此，我们制备豚鼠爆震致聋模型，应用计算机辅助测定图像分析和病理切片检 测爆震后耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞的变化。
1 材料和方法
1.1 动物的选择及分组 选用耳廓反射正常，体质量200 g左右的健康杂种豚鼠1 6只，随机分为正常对照组和爆震组，每组8只。
1.2 噪声源 强脉冲噪声声源系由特制的D-86电火花脉冲发生器(上海江湾一 厂生产)。爆震组动物暴露80发，间隔2 s，脉宽0.5 ms,压力峰值172.0 dB spl， 正常对照组不接受噪声。
, http://www.100md.com
1.3 ABR阈值测定 用豚鼠固定装置固定豚鼠，用Madenson-2250型脑干听 觉诱发电位测试仪测定豚鼠清醒状态下ABR阈值，记录电极置颅顶正中部，参考电极和接地 电极分别置于同侧和对侧耳廓。噪声暴露前后测试时电极放置位点相同。刺激声为宽频带短 声(click)，脉冲宽度为0.1 ms，扫描时程10 ms，叠加256次。以出现最稳定的Ⅲ波刚消 失时的声刺激强度作为该耳的听反应阈。爆震组豚鼠测定爆震前及爆震后3 h，3 d，21 d的 ABR阈值,正常对照组则在对应时间测试。
1.4 琥珀酸脱氢酶(SDH)染色铺片和图像分析行毛细胞计数 噪声暴露后21 d，所有实验组和对照组动物均在麻醉状态下断头处死，快速取出左侧耳蜗并进行蜗管内灌 注硝基四氮唑蓝(NBT)配制的SDH染色液，37℃温箱内孵育60 min，固定，脱钙后解剖 显微镜下剥去蜗壳，按文献[1]介绍的方法制备耳蜗铺片标本，备用。耳蜗毛细胞 计数采用计算机图像分析处理。毛细胞计数是先测量从钩回到顶回基底膜上各回每排毛细胞 的长度，再根据各回每排单位长度内毛细胞个数而计算出各回毛细胞数，各回相加即得到毛 细胞总数。
, 百拇医药
1.5 螺旋神经节细胞计数 噪声暴露后21 d，所有实验组和对照组动物均在麻醉 状 态下断头处死，快速取出右侧耳蜗并进行蜗管内灌注10%甲醛液并固定于该液24 h，10%甲 酸脱钙72 h，石蜡包埋，制作7 μm 厚连续中轴切片，H-E染色。光镜下，按文献[2]所 述方法稍加改进，目镜加网格片，在40×10倍下直接计数蜗螺旋管中有核神经节细胞数，每 只耳蜗连续计数5张中轴切片，取其均值。
1.6 统计学处理 数据以
±s表示，用t检验进行显著性检测 。2 结 果
2.1 豚鼠ABR阈值改变 对照组和实验组的ABR阈值见表1。此表可以看出，爆震 前两组 豚鼠ABR阈值无差异，表明所用豚鼠组间条件相同。爆震后不仅3 h和3 d ABR阈值差异显著 ，21 d后两者间差异依然存在。
, 百拇医药
表1 爆震前后不同时间ABR阈值
Tab 1 The change of ABR threshold before and after blast
(
±s，LI/dB) GroupEars
Before blast
After blast
3 h
3 d
21 d
, http://www.100md.com
Control
8
39.0±3.82
39.0±3.82
38.0±4.04
40.4±3.57
Blast group
8
37.5±3.04
93.5±6.93**
84.5±6.56**
, http://www.100md.com
80 .0±8.94**
**P<0.01 vs control group
2.2 毛细胞的变化 耳蜗SDH染色铺片,见正常组各回均有整齐排列的3排外毛细胞和1排内毛细胞，毛细胞自然缺失率极少。爆震后21 d出 现大量的毛细胞缺失，其中减少主要在钩回(484±63.8)个、第1回(1 943±210.4)个、 第2回(688±204.7)个，与对照组(1 278±65.2)，(2 712±110.5)，(2 032±119.4 )个相比差异显著(P<0.01)。
2.3 螺旋神经节细胞的变化 正常对照组耳蜗螺旋管内螺旋神经节部位螺旋神经 节细胞清晰可见，爆震组豚鼠相应部位螺旋神经节细胞数减少，减少的神经节细胞主要发生 在耳蜗螺旋管内螺旋神经节部位的一上和二下，爆震后21 d耳蜗螺旋神经节细胞计数结果见 表2。
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表 2 噪声暴露后21 d耳蜗螺旋神经节细胞变化
Tab 2 The change of spiral ganglion cells 21 d after blast exposure
(n=5,
±s ) GroupEars
The number of spiral ganglion cells
1 low
1 up
2 low
2 up
, http://www.100md.com
3 low
3 up
4
Control
8
54±8.36
56±3.81
51±4.72
42± 2.96
41±2.83
43±5.10
41±2.97
, 百拇医药 Blast group
8
52±7.32
41±4.86*
27±6.94**
38±4.75
3 8±2.98
41±5.44
39±3.26
*P<0.05; ** P<0.01 vs control group3 讨 论
, http://www.100md.com 爆震后听阈的改变和内耳Corti器毛细胞的缺失在以往的动物实验中已得到广泛的证实 [3]。本实验应用计算机辅助图像分析定量观察爆震后内耳毛细胞的变化，与以往用普 通耳蜗硬铺片显微镜测微尺测量法、火棉胶连续切片耳蜗描摹翻造法以及扫描电镜测量 法比较，实验手段较先进，结果也较可靠。从正常对照组和实验组毛细胞计数结果来看，两 组间只有钩回、第1回和第2回相差明显(P<0.01)，其余各回差异不大。可能 与爆震声的频率有关。
本实验主要目的是观察爆震后在毛细胞大量缺失和听阈明显升高时，对应的螺旋神经节细胞 数量的变化。从实验结果来看，由于耳蜗基底膜及其对应的螺旋神经节细胞是围绕蜗轴3圈 半多排列，故耳蜗中轴切片上可见7个部位存在螺旋神经节细胞，由蜗底到蜗顶分别称为一 下、一上、二下、二上、三下、三上和四，而爆震后21 d螺旋神经节细胞数量较对照组明显 减少的只有一上和二下，与基底膜上毛细胞缺失最明显的钩回、第一回和第二回基本相对应 ，说明爆震后毛细胞损伤的同时，耳蜗螺旋神经节细胞也同样受到损伤。其损伤的机制可能 与耳蜗螺旋神经节细胞发生继发性退行性改变有关[4]。
, 百拇医药
研究耳蜗螺旋神经节细胞病变的目的主要是
为进一步的治疗研究提供病理基础和疗效判定的方法。目前对于中重度神 经性耳聋尚无可靠的治疗手段，探索某些有价值的药物对耳蜗神经元损伤修复的作用，可 能为最终解决这一难题带来新的希望。
[作者简介] 周义德(1966-)，男(汉族)，硕士，主治医师，讲师.
参考文献
[1] 周义德,翟所强,杨伟炎,等.睫状神经营养因子防治强脉冲噪声对豚鼠 内耳损伤的试验研究[J].中华耳鼻咽喉科杂志,1999, 34(3):150-153.
[2] 方耀云,姚行齐,姜泗长.老化豚鼠耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞定量研究[J] .中国体视学与图像分析,1996, 1(1)：64-67.
, 百拇医药
[3] 孙建和,郗 昕,姜泗长，等.豚鼠耳蜗毛细胞的定量观察[J].中国体视学与 图像分析,1996,1(1)：68-70.
[4] 王锦玲,姜鸿彦,刘顺利，等.表皮生长因子及地塞米松对爆炸性耳聋治疗作用的 试验研究[J].中华耳鼻咽喉科杂志, 1996,31(3)：136-138.
[5] Mill JM, Chi DH, O`keefe LJ, et al, Neurotrophins can enhance spi ral ganglion cell survival after inner hair cell loss[J]. Int J Dev Neurosci ， 1997， 15(4-5):631-643.
[6] Ylikoski J, Pirvola U, Virkkaka J， et al. Guinea pig auditory ne urons are protected by glial cell line-deried growth factor from degeneration a fter noise trauma[J]. Hear Res, 1998, 124(1-2):17-26.
[收稿日期] 2000-06-15
[修回日期] 2000-09-21, 百拇医药