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编号:10284806
来氟米特离体透皮吸收的研究
http://www.100md.com 《第二军医大学学报》 2000年第10期
     作者:朱全刚 胡晋红 孙华君

    单位:朱全刚(第二军医大学长海医院药学部,上海200433);胡晋红(第二军医大学长海医院药学部,上海200433);孙华君(第二军医大学长海医院药学部,上海200433)

    关键词:来氟米特;脂质体;透皮吸收

    第二军医大学学报001022 [摘要] 目的:研究来氟米特的透皮特性 和脂质体对此的影响。方法:采用改良Franz扩散池,以离体皮肤为渗 透屏障,渗透系数为指标,HPLC法测定来氟米特浓度。结果:来氟米 特本身具有较好的皮肤渗透性能,脂质体对来氟米特的皮肤渗透性能影响不大。结 论:来氟米特可以采用经皮肤局部给药的方式给药。

    [中图分类号] R 976 [文献标识码] A

    [文章编号] 0258-879X(2000)10-0971-04
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    Study on the permeability of leflunomide in vitro

    ZHU Quan-Gang, HU Jin-Hong, SUN Hua-Jun

    (Department of Pharmacy, Changhai Hos pital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

    [ABSTRACT]Objective: To study the permeability of leflunomid e and the effect of liposome on its permeability. Methods: Modif ied Franz-diffusion cell adopted as apparatus for in vitro skin permeation. Various excised skins were used as permeation barriers and permeation coefficie nt was used as index. The concentration of leflunomide in the samples was measur ed by HPLC. Results: Leflunomide had a good permeability, but th e effect of liposome on permeability was not very strong. Conclusion: It is feasible that leflunomide is applied through skin.
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    [KEY WORDS] leflunomide; liposome; percutaneous absorption

    来氟米特是一种治疗活动性类风湿性关节炎的新药,不良反应以恶心、呕吐、腹痛、腹 泻、胃炎及胃肠炎等胃肠道症状和肝功能损害为最常见[1]。为提高来氟米特在炎 性关节局部的药物浓度、增强炎性关节局部的抗炎作用和减少全身给药引起的不良反应,探 讨其经皮肤局部给药的可行性具有重要意义。脂质体作为一种皮肤局部给药的载体已引起药 剂学工作者的广泛注意[2]。本文采用改良Franz扩散池,以离体皮肤为渗透屏障, 研究来氟米特的透皮特性和脂质体对此的影响,以期为来氟米特皮肤局部给药制剂的研制提 供实验依据。

    1 材料和方法

    1.1 仪器、试药和动物 高效液相色谱仪,包括 Maxima 820工作站, 510泵, 4 86可变波长紫外检测器,U6K 进样器(美国Waters公司);透皮扩散装置,包括改良Franz 扩散池(复旦大学科教仪器厂),多功能磁力搅拌器(安徽天长市恒运电器厂), CS501型 超级恒温器(重庆实验设备厂); ZFA-02型旋转蒸发器(上海玻璃仪器二厂); CPS-2 超声波粉碎机(上海必能信超声有限公司)。联苯酚(Sigma公司);来氟米特(第二军医 大学药学院药物化学教研室提供);精制大豆磷脂(纯度>95%,上海福达制药有限公司); 胆固醇(分析纯,上海化学试剂站分装厂);维生素E(上海三维药业有限公司);吐温-8 0(药用,上海大众药厂);生理盐水(长海医院制剂室);甲醇(色谱纯,上海吴泾化工 总厂);其他试剂均为分析纯。 BALB/c无毛小鼠(军事医学科学院实验动物中心);昆明 种小鼠、SD大鼠、新西兰家兔(第二军医大学实验动物中心);人体皮肤(长海医院烧伤科 )。
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    1.2 离体皮肤的制备 取昆明种小鼠(体质量约30 g)、SD大鼠(体质量约200 g )、新西兰家兔(体质量约2 kg),背部用8%硫化钠溶液脱毛,饲养24 h,实验前将它们和 无毛小鼠(体质量约25 g)处死,剥取背部皮肤,小心剔除皮下组织和脂肪,以生理盐水漂 洗干净,备用;另取新采集的人体皮肤,于60℃水中浸45 s,立即取出,分离表皮,备用。

    1.3 来氟米特脂质体的制备 取1 g磷脂、0.1 g胆固醇和0.01 g维生素E加入20 m l乙醚中,待完全溶解后将0.05 g来氟米特溶入其中,将其置于250 ml磨口梨形烧瓶中,同 时加入适量直径4 mm玻璃小珠,然后将梨形烧瓶置于35℃恒温水浴中,用旋转蒸发仪在转速 140 r/min及减压的条件下蒸除有机溶剂,使磷脂等成膜材料在烧瓶壁及玻璃小珠上形成均 匀类脂薄膜,充N2 10 min,使溶剂完全除去,再向烧瓶中加入35℃水合介质(0.5%吐温 -80水溶液)15 ml,并在同温度条件下用旋转蒸发仪转动洗膜,待形成的类脂薄膜水合变 成牛奶状脂质体混悬液,将其用探针式超声波粉碎机(50%脉冲,即每秒工作0.5 s、间隙0. 5 s)超声分散15 min,在冷水浴条件下控制混悬液温度在30℃左右,使溶液由乳白色转为 半透明,充N2,密闭, 4℃贮存,备用[3]
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    1.4 离体透皮实验 采用改良Franz扩散池,皮肤角质层面向供给室,真皮层面向 接受室,供给池内加入一定浓度的来氟米特溶液1 ml,并用封口膜密封,接受池内加入预先 加热至37℃的含0.01%枸橼酸和1%吐温-80的生理盐水,37℃水浴循环加热,分别在0.5, 1 , 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 24 h从接受池内取样1 ml,并补充等体积37℃的接受 介质。

    1.5 HPLC条件 色谱柱为Hypersil ODS C18柱(150 mm×4.6 mm,10 μm ,大连依利特科学仪器有限公司),流动相为甲醇∶水∶磷酸(60∶40∶0.006), 流速为1.0 ml/min;检测波长为260 nm,灵敏度为0.01 AUFS,内标为联苯酚,进样量20 μl。色谱图见图1。

    图 1 接受液(A)和皮肤样品(B)的HPLC图
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    Fig 1 HPLC chromatograms of receptor solution (A) and skin sample (B)

    a: Leflunomide; b: p-Phenylphenol

    1.6 接受液样品测定

    1.6.1 标准曲线的制备 准确配制浓度为30.8 μg/ml的联苯酚贮备液和浓度为12 0.6 μg/ml的来氟米特贮备液。精密量取来氟米特贮备液适量至10 ml容量瓶中,加入联苯 酚贮备液0.2 ml和空白小鼠皮肤24 h接受液(即供给室仅加生理盐水,不含来氟米特)5 ml ,用流动相稀释至刻度,得浓度为0.120 6, 0.603 0, 1.206 0, 3.015 0, 6.030 0, 9.045 0, 12.060 0 μg/ml的来氟米特系列标准液, 10 0 00 r/min离心10 min,取上清液20 μl进样。以来氟米特的浓度c对其与内标联苯酚的 峰面积比R进行回归,得标准曲线方程 c=0.002 2+1.027 9 R, r=0.999 9(n=7)。
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    1.6.2 方法回收率和精密度实验 按标准曲线项方法配制6.030 0 μg/ml的来氟 米特样品液,连续测定其与内标联苯酚的峰面积比3次,依据标准曲线方程换算,得方法回 收率平均为99.07%(n=3),日内RSD平均为0.93%(n=3),日间RSD平均为1.58% ( n=3)。

    1.6.3 接受液样品的测定 样品经适当稀释后测定,并通过下式校正接受池的药 物质量浓度(μg/ml):

    式中V为接受池体积,V0为每次取样的体积,cn为第n个样品实际测得的药 物浓度,c为校正后的药物浓度,∑ci为该取样点前各点的 测定浓度之和。以扩散平衡后的c对时间t进行回归,求得渗透系数:c 校=PAcdt/V+b(式中P为渗透系数,A为皮肤有效扩散面积,cd为供给 池中药物的浓度,b为截距)。
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    1.7 皮肤样品测定

    1.7.1 标准曲线的制备 精取上述来氟米特贮备液适量置10 ml离心管中,50℃水 浴挥尽甲醇,加入4 cm2空白小鼠皮肤匀浆,得药物含量分别为0.603, 3.015, 6.030, 9.045, 12.060 μg/4 cm2的系列标准液;加入乙醚5 ml,涡旋振荡5 min, 4 000 r/min离心5 min,将上层有机相吸入另一洁净离心管中,在50℃水浴N2流作用下 挥干。管壁用1 ml乙醚洗涤,水浴中重新挥干;加980 μl流动相溶解残渣,同时加入内标 联苯酚贮备液20 μl,振荡,10 000 r/min离心10 min,取上清液20 μl进样。以来氟米特 的浓度c对其与内标联苯酚的峰面积比R进行回归,得标准曲线方程c=-0.554 3 +1.214 5 R, r=0.990 7(n=5)。

    1.7.2 方法回收率和精密度实验 按标准曲线项方法配制3.015, 6.030, 9.045 μg/4 cm2的3个浓度来氟米特样品液,分别测定其与内标联苯酚的峰面积比,依据标准 曲线方程换算,得方法回收率平均为101.51%(n=3),日内RSD平均为2.32%(n=3 ),日间RSD平均为2.81%(n=3)。
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    1.7.3 渗透完成后皮肤样品的测定 取渗透完成后的皮肤,用50%乙醇洗净,以吸 水纸吸干,用剪子剪碎,放入玻璃匀浆器中,加水2 ml,制成匀浆,按标准曲线项下方法进 行提取和测定。

    1.8 统计学处理 实验数据以±s表示,采用t检验。

    2 结 果

    2.1 来氟米特的透皮特性

    2.1.1 来氟米特水饱和溶液的渗透性 供给池中装入饱和来氟米特水溶液,得来 氟米特透过新鲜无毛小鼠、昆明种小鼠、SD大鼠、新西兰家兔及人体皮肤的渗透系数P(×1 0-3cm/h),分别为:14.304 3±3.174 4, 23.268 4±1.708 0, 17.325 2±3 .369 5, 6.617 3±1.293 4, 7.976 7±1.254 0(n=3)。
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    2.1.2 来氟米特无水乙醇溶液的渗透性 供给池中装入来氟米特无水乙醇溶液,得 来氟米特透过新鲜昆明种小鼠、SD大鼠、新西兰家兔及人体皮肤的渗透系数P(×10-3 cm/h),分别为:18.804 4±2.409 2, 6.464 2±0.448 3, 9.896 9±1.870 9, 7.016 9±0.042 5(n=3)。

    2.2 脂质体对来氟米特透过离体昆明种小鼠皮肤的影响 按前法制备来氟米特脂 质体,但用水代替0.5%吐温-80溶液洗膜。取该洗涤液4.5 ml,加入0.5 ml乙醇后超声5 mi n使脂质体破坏,得浓度约3 mg/ml的来氟米特醇性脂质混悬液;另取来氟米特脂质体4.5 ml ,加入0.5%吐温-80溶液0.5 ml混匀,得浓度约3 mg/ml的来氟米特脂质体混悬液。分别以 这两种混悬液作供给液,进行透过离体昆明种小鼠皮肤的渗透实验,脂质体混悬液作为供给 液时又分成供给池密闭与开放两组,并测定渗透完成后皮肤样品中来氟米特的滞留量。醇性 脂质混悬液、密闭组脂质体混悬液和开放组脂质体混悬液的渗透系数P(×10-3cm/h )分别为:1.287 2±0.240 6, 0.858 6±0.145 5, 0.900 1±0.067 3(n =3);而渗透完成后单位面积皮肤中的药物滞留量Q(μg/cm2)分别为:2.392 0 ±0.239 5, 0.672 4±0.149 2, 4.523 0±0.299 9(n=3)。
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    3 讨 论

    来氟米特的相对分子质量为270.2,熔点为165~166℃,分配系数logP正辛醇/ 水约为3.6。一般认为油/水分配系数接近1者具有较好的经皮渗透系数,但梁栋等[4 ]在对氨基苯甲酸酯类化合物大鼠离体皮肤的透皮速率和分配系数P正辛醇/水的相 关性研究中发现logP最佳是3.56,因此认为来氟米特也可能具有较好的透皮结果。实 验显示来氟米特在人体皮肤中的渗透系数为7.976 7×10-3 cm/h(水为溶剂)、 7.0 16 9×10-3 cm/h(无水乙醇为溶剂),表明来氟米特本身的皮肤渗透性能较好,可 以采用经皮肤局部给药的方式给药。

    一般认为无水乙醇为溶剂时药物的渗透系数应大于水为溶剂的渗透系数,但本实验结果是水 为溶剂的渗透系数值大,这一方面可能是由于无水乙醇为溶剂时药物的溶解度显著增大,改 变了药物在介质和皮肤中的分配,另外也可能是由于浓度和溶解度间的比值(Co/Cs)较水 为溶剂时的明显小,即药物的热力学活性较低所致[5]
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    水为溶剂时,来氟米特在4种动物皮肤中的渗透系数以昆明种小鼠皮肤最大,新西兰家兔皮 肤最小,新西兰家兔皮肤的渗透系数与人体皮肤的渗透系数较接近(P>0.05);无水乙醇 为溶剂时,来氟米特在昆明种小鼠皮肤中的渗透系数仍为最大,SD大鼠和新西兰家兔皮肤的 渗透系数与人体皮肤的渗透系数较接近(P>0.05);说明新西兰家兔皮肤可作为来氟米特 透皮吸收实验的皮肤模型。

    脂质体作为药物载体用于透皮吸收可增加药物在皮肤中的滞留量,具有安全、局部高浓度和 无毒副作用的效果,近年作为一种增加药物经皮吸收方法的研究十分活跃[2]。来 氟米特脂质体混悬液在昆明种小鼠皮肤中的渗透系数与相同辅料和药物浓度的醇性脂质混悬 液比较接近(P>0.05),说明脂质体对来氟米特经皮渗透的影响不大。但供给池开放的脂 质体混悬液组皮肤中的药物滞留量明显高于供给池密闭的脂质体混悬液组和醇性脂质混悬液 组(P<0.05),说明采用开放给药方式比密闭给药方式更有助于脂质体中来氟米特在皮肤 局部的分布,这是由于开放给药使脂质体保持一定程度的脱水状态,从而提高渗透压之故, 这与文献报道一致[6]
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    [基金项目] 全军“九五”医学科研规划基金资助项目(98M077).

    [作者简介] 朱全刚(1968-),男(汉族),硕士,主管药师.

    [参 考 文 献]

    [1] Graul A, Castaner J. Leflunomide[J]. Drugs Fut,1998,23(8): 827-837.

    [2] 朱于村,李汉蕴.脂质体用作皮肤局部给药的载体[J].中国医药工业杂志,1 998,29(5):231-235.

    [3] 朱全刚,胡晋红,孙华君.来氟米特脂质体的工艺优化[J].华西药学杂志,2 000,15(2):85-88.

    [4] 梁 栋,梁文权,刘志强.药物透皮速率与高效液相色谱保留行为的相关性[J ].中国医学科学院学报,1990,12(4):262-268.
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    [5] Ogiso T, Iwaki M, Paku T. Effect of various enhancers on transdermal penetration of indomethacin and urea, and relationship between penetration param eters and enhancement factors[J]. J Pharm Sci,1995,84(4):482-488.

    [6] Touitou E, Junginger HE, Weiner ND, et al. Liposomes as carriers for topical and transdermal delivery[J]. J Pharm Sci,1994,83(9):1189-1203.

    [收稿日期] 2000-06-05

    [修回日期] 2000-08-20, http://www.100md.com