RAPD技术在药用植物学研究中的应用
作者：舒艳群* 白守梅 陈毓亨
单位：中国医学科学院药物研究所(北京100050)中国协和医科大学药物研究所攻读硕士研究生
关键词：RAPD技术；药用植物；分子生物学
中草药/990234 摘 要 概述了RAPD技术在药用植物学中应用的理论意义及依据，并综述了该技术在药用植物中的应用情况、注意的问题及技术方法上的改进，展望了RAPD技术在药用植物分子生物学方面的应用前景。
过去几年里，在分子生物学领域中，DNA分子遣传标记(DNA Molecular Gene-tic Marker)技术迅猛发展，新方法、新技术不断涌现。继同工酶(isozyme)〔1，2〕、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphi-sm)和DNA指纹(DNA fingerprinting)〔3，4〕技术以后，90年代又发展了RAPD (Random Amplifed Polymorphic DNA,随机引物扩增多态DNA)〔5，6〕、CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)〔7〕、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphic)技术等〔8，9〕。其中RAPD技术由于操作简便、快速、省时、省力而迅速得到广大分子生物学家的重视，并在农、林、医学及动、植物和微生物学的各个领域得到广泛应用，在基因定位与分离、连锁图建立、品种鉴定、资源评价、物种亲缘关系和系统演化等各方面取得了很大进展。现对RAPD基本理论及其在药用植物方面的应用作简单的综述，并对应用前景作一展望。
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1 基本理论
RAPD是1990年由Williams等〔5，6〕两个研究小组分别在不同的实验室同时发展起来的，其核心技术是多聚酶链反应(PCR)，应用人工合成的10个左右的寡核甘酸(G+C约占60 %～70 %)作为引物，随机扩增基因组DNA，产生多态性DNA谱带，(DNA fingerprinter),产物经琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺电泳、EB染色，即可在紫外灯下检测出DNA谱带。任何生物种都 具有特定顺序和结构的遗传物质——DNA，不受外界因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响。由于在生物进化过程中所选择的不同，基因组DNA不同区域表现出高度的保守或高度的变异，有不同的遗传多样性。RAPD技术就是通过分析遗传物质DNA经过PRC扩增后的多态性来诊断生物体内在基因排布与外在性状表现的规律。其灵敏度高，不受环境、发育、数量性状遗传等的影响，客观地揭示供试材料之间DNA的差异，因而成为一种理想的有效的分子生物学的技术。该方法无需使用同位素，DNA用量少，无需事先知道DNA的顺序，用10个任意碱基引物就可以进行PCR扩增；没有DNA克隆、Southern转移、分子杂交等复杂程序；省工、省力、工作进度快；且PCR引物没有种属限制，一套RAPD引物可以应用于任意一种生物的研究，具有广泛和通用性的特点。而且，RAPD产物经克隆和序列分析后，可作为RFLP和原位杂交的探针。
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2 在药用植物学研究中的应用
药用植物在我国据估计大约有10 000多种，其中包括中药约600种，它们是我国人民防病、治病的重要手段，同时是寻找和开发新药的宝库。随着“人类回归自然”呼声日高和国内外新药开发和研制竞争的日益激烈，传统中药和天然产物的开发和利用受到人们越来越多的重视。在生物多样性已经受到认识和保护的今天，我们应该在保护生物多样性的基础上探求现有资源和成分的分布规律，以发现新疗效、低成本、更安全的新药。显然，传统的生物学和化学方法已不适应今天的要求，所以，我们应该在传统的生物学和药学基础上，应用新技术和新方法，开展植物物种、遗传和生态3个层次的生物多样性和天然产物多样性相结合的研究，使药用植物的研究提高到一个新的水平。
2.1 生物多样性：随着植物药研究的不断深入，可持续开发利用药用植物资源的问题越来越受到重视。应用RAPD技术进行药用植物生物多样性研究，可以在遗传多样性水平上了解天然产物多样性与物种、生态及地理分布的关系，挖掘潜在的药物资源，为开发新药寻找途径。
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RAPD方法可以检测物种的遗传多样性，探讨物种的亲缘关系和进化趋势。因此它是药用植物资源保护和种质资源保存的依据，特别是对濒危物种的研究更具有实际意义。陈永久等〔10〕用RAPD方法分析了冬虫夏草Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.的遗传分化，通过遗传距离说明遗传差异度与地理距离呈正相关。从分子水平上提供了冬虫夏草的分类、起源及进化方面的宝贵资料，可作为制定冬虫夏草资源保护和合理利用等措施的理论依据。
2.2 种属特异性：RAPD分析DNA在生物个体之间的差异，研究物种的遗传变异性，为物种分类提供依据。Paran等〔11〕用RAPD标记研究了药用植物列当属(Orobanche L.)的种间和种内变异性，从遗传距离得到了种间变异与依靠形态特征的分类的一致性：并找出了每个种特定的RAPD标记，而种内变异度则相对少得多。Scott等〔12〕对马缨丹Lantana camara L.这一按花颜色分类的种进行了研究，RAPD数据表明，遗传关系的远近与地理距离的远近有密切关系，而与花的颜色关系不大，从而说明用花颜色作为分类依据并不可靠。
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RAPD用于药用植物系统学研究，从方法上有独到的优势，它能够通过不同引物直接给出整个基因组的多态性信息，避免了生长环境和发育时期不同的影响；并从DNA水平上对分类群比较分析，确定药用植物种、品种间的亲缘关系，绘制系统发育树状图。汪小全等〔13〕通过对升麻属(Cimicifuga L.)5个种、类叶升麻Actaea asiatica Hara及松潘乌头Aconitum sungpanense Hand.-Mazz.的RAPD结果分析，认为RAPD方法可以用于种间乃至近缘属间的系统学研究，但有一定的局限性。惠东威等〔14〕利用8种RAPD引物对大豆属的21份材料进行了基因组指纹图谱构建，重建了大豆属中各个种的亲缘关系。Yu和Lin〔15〕对烟草属(Nicotiana L.)进行了种间和种内的亲缘关系鉴定并绘制了系统树。论证了N.sylvestris在分类学中的位置，即它可能是sect.Alatae下面的一个种。
在菌类中，药用真菌种的鉴定常常是个难点。虽然可以通过大工作量的筛选得到优良品种或品系，但在寻找新品种、新品系方面还缺乏有效的手段。孔繁荣等〔16〕应用RAPD技术对3群淋球菌进行了菌种鉴定和分型，找出了它们的特异的DNA条带，可作为3群淋球菌分型的基因学基础。Anzai等人〔17～19〕分别研究了RAPD应用于真菌、放线菌、细菌的菌株的筛选工作，结果表明RAPD是进行微生物菌株筛选工作的一个简单有效的手段。
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2.3 遗传育种：遗传连锁图谱可以指导育种，防止品种间杂化和自交，选育优良性状的品种。目前，应用RAPD技术已经建立了番茄和马尾松的〔20〕分子标记连锁图谱等。对茶Camellia sinensis L.植物相对自由的品种间杂交和自然种间的杂交现象，Wachira〔21〕等利用RAPD技术检验了栽培茶和野生茶之间的亲缘关系。RAPD分析表明，野生茶基因组DNA的片段渐渗到栽培茶基因组DNA中，这与假定的从相似的野生茶种的种质渐渗到栽培茶种质相一致。这些研究为RAPD技术应用在药用植物遗传育种方面提供了可行性依据。
2.4 生药鉴定和药材道地性：主要是同属不同种、同名不同种的药材和药材真伪(药材混淆替代品)的鉴定。传统的生药鉴定一般依靠外形和粉末特征等，RAPD技术应用于生药鉴定可直接分析药材DNA的多态性，找出药材特有的DNA片段(标记)进行药材检测。这方面已经有许多应用：张荣等〔22，23〕对木蓝属(Indigofera Linn.)8种生药、铁线莲属(Clematis L.)7种中药进行鉴定，并证明RAPD对于应用在干燥的植物类生药的鉴定上有实际应用价值。
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如今，药材道地性研究已经成为中医药科研的重要课题，道地药材有一个地域性现象，其产生除了与栽培方法、生态环境、加工方法有关外，还与物种的居群的遗传特异性有关，这可能是造成道地药材与非道地药材的品质差异的原因。由于道地与非道地药材在形态和生药上基本一致，因此，利用RAPD技术可以在DNA水平上鉴定两者的差异，使道地药材的研究提高到分子水平。
3 实际应用中需注意的问题
3.1 模板的浓度和纯度：RAPD的最佳扩增条件在不同的研究中有很大出入，对其重复性问题及其系统学价值引起了很大争论，尤其是模板DNA的浓度和纯度问题。Devos等人〔24〕研究了DNA模板浓度在2.5～2 500 μg/L内对RAPD产物的影响，结果仅在200～400 μg/L间获得了一致的扩增产物；汪小全等〔13〕在研究银杉Cathaya argyrophylla 的遗传多样性时，对RAPD产物的影响因素进行了大量的探索，得到逐级纯化的DNA模板的RAPD结果一致，认为模板制备过程中的许多纯化步骤是不必要的，尤其是RNA的存在与否对扩增产物没有影响；模板浓度在一个相当大的范围内不影响扩增结果。当然，实验过程中也避免不了人为原因(操作问题)对扩增结果产生影响。
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3.2 RAPD的重复性：由于RAPD技术灵敏性高，因而，其重复性问题最为引人注意。汪小全等〔13〕在研究了银杉的干、鲜叶片DNA的RAPD扩增结果后认为，从干样品中提取的DNA模板可获得与鲜样品同等的扩增结果，从同一个体的干叶和鲜叶中DNA模板可获得完全一致的扩增产物；干、鲜样品的RAPD结果可一起分析；野外采集鲜样品困难时，建议直接用硅胶干燥，这就为RAPD技术应用于生药鉴定提供了可能。Shaw等发现，不同产地、不同时间采集的同一植物基因组DNA的指纹图不变，从而证明RAPD方法在中药鉴定上的稳定性和重现性〔25，26〕。
3.3 引物的选择：Wolff等〔27〕研究了适用于菊属(Chrysanthemum)的RAPD最佳条件，包括不同厂家的酶、热循环次数、退火温度及引物；指出每一引物都有其最佳退火温度，引物的最佳退火温度与引物中G+C含量没有联系，找到最佳的引物与种的组合则是最关键的问题。
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3.4 产物分析：在RAPD产物中会出现许多弱带(亮度不够的带)，其中不能重复的可以不计；能够重复的在实验条件稳定的情况下可计算在内。另外，为避免污染问题，实验中应设空白对照反应。
4 技术方法的改进
4.1 DNA提取方法：Francois〔28〕在提取缓冲液中加入蛋白酶K，省略了反复离心过程，使DNA提取更加快速，每个样品可以做约6 000个PCR反应，为PCR -RAPD的工业化提供了很好的方法。Micheli等〔29〕认为影响RAPD可重复性的主要原因之一是模板DNA的质量，尤其是在传统的DNA提取方法中使用乙醇使许多杂质和DNA混在一起沉淀出来。他们介绍了一种简单的方法，即靠一个玻璃棒转动来收集DNA，从而去除了多余的沉淀物。
4.2 提高多态性：小麦是具低水平的RAPD重复性和多态性的作物，Robert〔30〕在研究该物种时对RAPD方法进行了改造，利用限制性内切酶(Frequently Cutting Restriction Enzymes)预先对模板DNA进行消化，然后选用与内切酶搭配适合的引物，得到了理想的结果。
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4.3 RAHM〔31〕和RAPMO〔32〕 ：RAHM (Rand om Amplified Hybridization Microsa tellites，随机扩增杂交微卫星)是1995年由Cifarelli等在RAPD基础上改进的一种方法，利用植物基因组中存在并散布着大量的微卫星重复序列的特性，将RAPD产物转移到尼龙膜上后用洋地黄毒苷标记的带有短重复序列的寡聚核苷酸探针进行杂交，经放射自显影后检测其多态性。这一技术可以检测真核生物基因组DNA中存在的微卫星DNA。
RAPMO(Random Amplified Microsa-tellite Polynorphisms，随机扩增微卫星匀线性)是1995年由Richardson等〔32〕对RAPD的另一个改进，与RAHM有异曲同工之处，但所用的引物不是随机的，而是微卫星PCR引物。电泳后产物转入尼龙膜，32P微卫星探针进行标记，放射自显影检测多态性指纹图谱。这一技术可检测植物的微卫星DNA多态性，应用在物种的分类、进化等许多方面。
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4.4 RAPD-RFLP联合：Nakai等〔33〕利用RAPD-RFLP联合的方法对中药淫羊藿属(Epimedium L.)7种植物进行了遗传连锁图谱的构建。Yamazaki等〔34〕用这两种方法对甘草属(Glycyrrhiza Linn.)建立了系统树。
5 展望
RAPD技术的出现虽然仅仅几年的时间，但在其应用过程中显示了广泛的前景。但此技术在药用植物方面的研究还不十分深入，相信随着分子生物学技术的不断发展和药用植物分子遗传特征研究的不断深入，RAPD技术将在药用植物研究领域中得到更加广泛的应用，并成为药用研究现代化的重要内容。
*Address:Shu Yanqun Institute of Materia Medica ,Chinese Academy of Medical Sciences ,Chinese X
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参考文献
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[33] Nakai R,et al. Biol Pharm Bull,1996,19(1):67
[34] Yamazaki M,et al.Biol Pharm Bull,1994,17(11):1529
(1998-09-13收稿), http://www.100md.com(舒艳群* 白守梅 陈毓亨)
单位：中国医学科学院药物研究所(北京100050)中国协和医科大学药物研究所攻读硕士研究生
关键词：RAPD技术；药用植物；分子生物学
中草药/990234 摘 要 概述了RAPD技术在药用植物学中应用的理论意义及依据，并综述了该技术在药用植物中的应用情况、注意的问题及技术方法上的改进，展望了RAPD技术在药用植物分子生物学方面的应用前景。
过去几年里，在分子生物学领域中，DNA分子遣传标记(DNA Molecular Gene-tic Marker)技术迅猛发展，新方法、新技术不断涌现。继同工酶(isozyme)〔1，2〕、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphi-sm)和DNA指纹(DNA fingerprinting)〔3，4〕技术以后，90年代又发展了RAPD (Random Amplifed Polymorphic DNA,随机引物扩增多态DNA)〔5，6〕、CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)〔7〕、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphic)技术等〔8，9〕。其中RAPD技术由于操作简便、快速、省时、省力而迅速得到广大分子生物学家的重视，并在农、林、医学及动、植物和微生物学的各个领域得到广泛应用，在基因定位与分离、连锁图建立、品种鉴定、资源评价、物种亲缘关系和系统演化等各方面取得了很大进展。现对RAPD基本理论及其在药用植物方面的应用作简单的综述，并对应用前景作一展望。
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1 基本理论
RAPD是1990年由Williams等〔5，6〕两个研究小组分别在不同的实验室同时发展起来的，其核心技术是多聚酶链反应(PCR)，应用人工合成的10个左右的寡核甘酸(G+C约占60 %～70 %)作为引物，随机扩增基因组DNA，产生多态性DNA谱带，(DNA fingerprinter),产物经琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺电泳、EB染色，即可在紫外灯下检测出DNA谱带。任何生物种都 具有特定顺序和结构的遗传物质——DNA，不受外界因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响。由于在生物进化过程中所选择的不同，基因组DNA不同区域表现出高度的保守或高度的变异，有不同的遗传多样性。RAPD技术就是通过分析遗传物质DNA经过PRC扩增后的多态性来诊断生物体内在基因排布与外在性状表现的规律。其灵敏度高，不受环境、发育、数量性状遗传等的影响，客观地揭示供试材料之间DNA的差异，因而成为一种理想的有效的分子生物学的技术。该方法无需使用同位素，DNA用量少，无需事先知道DNA的顺序，用10个任意碱基引物就可以进行PCR扩增；没有DNA克隆、Southern转移、分子杂交等复杂程序；省工、省力、工作进度快；且PCR引物没有种属限制，一套RAPD引物可以应用于任意一种生物的研究，具有广泛和通用性的特点。而且，RAPD产物经克隆和序列分析后，可作为RFLP和原位杂交的探针。
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2 在药用植物学研究中的应用
药用植物在我国据估计大约有10 000多种，其中包括中药约600种，它们是我国人民防病、治病的重要手段，同时是寻找和开发新药的宝库。随着“人类回归自然”呼声日高和国内外新药开发和研制竞争的日益激烈，传统中药和天然产物的开发和利用受到人们越来越多的重视。在生物多样性已经受到认识和保护的今天，我们应该在保护生物多样性的基础上探求现有资源和成分的分布规律，以发现新疗效、低成本、更安全的新药。显然，传统的生物学和化学方法已不适应今天的要求，所以，我们应该在传统的生物学和药学基础上，应用新技术和新方法，开展植物物种、遗传和生态3个层次的生物多样性和天然产物多样性相结合的研究，使药用植物的研究提高到一个新的水平。
2.1 生物多样性：随着植物药研究的不断深入，可持续开发利用药用植物资源的问题越来越受到重视。应用RAPD技术进行药用植物生物多样性研究，可以在遗传多样性水平上了解天然产物多样性与物种、生态及地理分布的关系，挖掘潜在的药物资源，为开发新药寻找途径。
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RAPD方法可以检测物种的遗传多样性，探讨物种的亲缘关系和进化趋势。因此它是药用植物资源保护和种质资源保存的依据，特别是对濒危物种的研究更具有实际意义。陈永久等〔10〕用RAPD方法分析了冬虫夏草Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.的遗传分化，通过遗传距离说明遗传差异度与地理距离呈正相关。从分子水平上提供了冬虫夏草的分类、起源及进化方面的宝贵资料，可作为制定冬虫夏草资源保护和合理利用等措施的理论依据。
2.2 种属特异性：RAPD分析DNA在生物个体之间的差异，研究物种的遗传变异性，为物种分类提供依据。Paran等〔11〕用RAPD标记研究了药用植物列当属(Orobanche L.)的种间和种内变异性，从遗传距离得到了种间变异与依靠形态特征的分类的一致性：并找出了每个种特定的RAPD标记，而种内变异度则相对少得多。Scott等〔12〕对马缨丹Lantana camara L.这一按花颜色分类的种进行了研究，RAPD数据表明，遗传关系的远近与地理距离的远近有密切关系，而与花的颜色关系不大，从而说明用花颜色作为分类依据并不可靠。
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RAPD用于药用植物系统学研究，从方法上有独到的优势，它能够通过不同引物直接给出整个基因组的多态性信息，避免了生长环境和发育时期不同的影响；并从DNA水平上对分类群比较分析，确定药用植物种、品种间的亲缘关系，绘制系统发育树状图。汪小全等〔13〕通过对升麻属(Cimicifuga L.)5个种、类叶升麻Actaea asiatica Hara及松潘乌头Aconitum sungpanense Hand.-Mazz.的RAPD结果分析，认为RAPD方法可以用于种间乃至近缘属间的系统学研究，但有一定的局限性。惠东威等〔14〕利用8种RAPD引物对大豆属的21份材料进行了基因组指纹图谱构建，重建了大豆属中各个种的亲缘关系。Yu和Lin〔15〕对烟草属(Nicotiana L.)进行了种间和种内的亲缘关系鉴定并绘制了系统树。论证了N.sylvestris在分类学中的位置，即它可能是sect.Alatae下面的一个种。
在菌类中，药用真菌种的鉴定常常是个难点。虽然可以通过大工作量的筛选得到优良品种或品系，但在寻找新品种、新品系方面还缺乏有效的手段。孔繁荣等〔16〕应用RAPD技术对3群淋球菌进行了菌种鉴定和分型，找出了它们的特异的DNA条带，可作为3群淋球菌分型的基因学基础。Anzai等人〔17～19〕分别研究了RAPD应用于真菌、放线菌、细菌的菌株的筛选工作，结果表明RAPD是进行微生物菌株筛选工作的一个简单有效的手段。
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2.3 遗传育种：遗传连锁图谱可以指导育种，防止品种间杂化和自交，选育优良性状的品种。目前，应用RAPD技术已经建立了番茄和马尾松的〔20〕分子标记连锁图谱等。对茶Camellia sinensis L.植物相对自由的品种间杂交和自然种间的杂交现象，Wachira〔21〕等利用RAPD技术检验了栽培茶和野生茶之间的亲缘关系。RAPD分析表明，野生茶基因组DNA的片段渐渗到栽培茶基因组DNA中，这与假定的从相似的野生茶种的种质渐渗到栽培茶种质相一致。这些研究为RAPD技术应用在药用植物遗传育种方面提供了可行性依据。
2.4 生药鉴定和药材道地性：主要是同属不同种、同名不同种的药材和药材真伪(药材混淆替代品)的鉴定。传统的生药鉴定一般依靠外形和粉末特征等，RAPD技术应用于生药鉴定可直接分析药材DNA的多态性，找出药材特有的DNA片段(标记)进行药材检测。这方面已经有许多应用：张荣等〔22，23〕对木蓝属(Indigofera Linn.)8种生药、铁线莲属(Clematis L.)7种中药进行鉴定，并证明RAPD对于应用在干燥的植物类生药的鉴定上有实际应用价值。
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如今，药材道地性研究已经成为中医药科研的重要课题，道地药材有一个地域性现象，其产生除了与栽培方法、生态环境、加工方法有关外，还与物种的居群的遗传特异性有关，这可能是造成道地药材与非道地药材的品质差异的原因。由于道地与非道地药材在形态和生药上基本一致，因此，利用RAPD技术可以在DNA水平上鉴定两者的差异，使道地药材的研究提高到分子水平。
3 实际应用中需注意的问题
3.1 模板的浓度和纯度：RAPD的最佳扩增条件在不同的研究中有很大出入，对其重复性问题及其系统学价值引起了很大争论，尤其是模板DNA的浓度和纯度问题。Devos等人〔24〕研究了DNA模板浓度在2.5～2 500 μg/L内对RAPD产物的影响，结果仅在200～400 μg/L间获得了一致的扩增产物；汪小全等〔13〕在研究银杉Cathaya argyrophylla 的遗传多样性时，对RAPD产物的影响因素进行了大量的探索，得到逐级纯化的DNA模板的RAPD结果一致，认为模板制备过程中的许多纯化步骤是不必要的，尤其是RNA的存在与否对扩增产物没有影响；模板浓度在一个相当大的范围内不影响扩增结果。当然，实验过程中也避免不了人为原因(操作问题)对扩增结果产生影响。
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3.2 RAPD的重复性：由于RAPD技术灵敏性高，因而，其重复性问题最为引人注意。汪小全等〔13〕在研究了银杉的干、鲜叶片DNA的RAPD扩增结果后认为，从干样品中提取的DNA模板可获得与鲜样品同等的扩增结果，从同一个体的干叶和鲜叶中DNA模板可获得完全一致的扩增产物；干、鲜样品的RAPD结果可一起分析；野外采集鲜样品困难时，建议直接用硅胶干燥，这就为RAPD技术应用于生药鉴定提供了可能。Shaw等发现，不同产地、不同时间采集的同一植物基因组DNA的指纹图不变，从而证明RAPD方法在中药鉴定上的稳定性和重现性〔25，26〕。
3.3 引物的选择：Wolff等〔27〕研究了适用于菊属(Chrysanthemum)的RAPD最佳条件，包括不同厂家的酶、热循环次数、退火温度及引物；指出每一引物都有其最佳退火温度，引物的最佳退火温度与引物中G+C含量没有联系，找到最佳的引物与种的组合则是最关键的问题。
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3.4 产物分析：在RAPD产物中会出现许多弱带(亮度不够的带)，其中不能重复的可以不计；能够重复的在实验条件稳定的情况下可计算在内。另外，为避免污染问题，实验中应设空白对照反应。
4 技术方法的改进
4.1 DNA提取方法：Francois〔28〕在提取缓冲液中加入蛋白酶K，省略了反复离心过程，使DNA提取更加快速，每个样品可以做约6 000个PCR反应，为PCR -RAPD的工业化提供了很好的方法。Micheli等〔29〕认为影响RAPD可重复性的主要原因之一是模板DNA的质量，尤其是在传统的DNA提取方法中使用乙醇使许多杂质和DNA混在一起沉淀出来。他们介绍了一种简单的方法，即靠一个玻璃棒转动来收集DNA，从而去除了多余的沉淀物。
4.2 提高多态性：小麦是具低水平的RAPD重复性和多态性的作物，Robert〔30〕在研究该物种时对RAPD方法进行了改造，利用限制性内切酶(Frequently Cutting Restriction Enzymes)预先对模板DNA进行消化，然后选用与内切酶搭配适合的引物，得到了理想的结果。
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4.3 RAHM〔31〕和RAPMO〔32〕 ：RAHM (Rand om Amplified Hybridization Microsa tellites，随机扩增杂交微卫星)是1995年由Cifarelli等在RAPD基础上改进的一种方法，利用植物基因组中存在并散布着大量的微卫星重复序列的特性，将RAPD产物转移到尼龙膜上后用洋地黄毒苷标记的带有短重复序列的寡聚核苷酸探针进行杂交，经放射自显影后检测其多态性。这一技术可以检测真核生物基因组DNA中存在的微卫星DNA。
RAPMO(Random Amplified Microsa-tellite Polynorphisms，随机扩增微卫星匀线性)是1995年由Richardson等〔32〕对RAPD的另一个改进，与RAHM有异曲同工之处，但所用的引物不是随机的，而是微卫星PCR引物。电泳后产物转入尼龙膜，32P微卫星探针进行标记，放射自显影检测多态性指纹图谱。这一技术可检测植物的微卫星DNA多态性，应用在物种的分类、进化等许多方面。
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4.4 RAPD-RFLP联合：Nakai等〔33〕利用RAPD-RFLP联合的方法对中药淫羊藿属(Epimedium L.)7种植物进行了遗传连锁图谱的构建。Yamazaki等〔34〕用这两种方法对甘草属(Glycyrrhiza Linn.)建立了系统树。
5 展望
RAPD技术的出现虽然仅仅几年的时间，但在其应用过程中显示了广泛的前景。但此技术在药用植物方面的研究还不十分深入，相信随着分子生物学技术的不断发展和药用植物分子遗传特征研究的不断深入，RAPD技术将在药用植物研究领域中得到更加广泛的应用，并成为药用研究现代化的重要内容。
*Address:Shu Yanqun Institute of Materia Medica ,Chinese Academy of Medical Sciences ,Chinese X
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(1998-09-13收稿), http://www.100md.com(舒艳群* 白守梅 陈毓亨)