ICAM-1反义寡核苷酸对小鼠肾小管上皮细胞ICAM-1表达的影响①
作者：程庆砾 陈香美 傅博 叶一舟
单位：程庆砾(解放军总医院肾科肾病中心暨重点实验室 北京100853)；陈香美(解放军总医院肾科肾病中心暨重点实验室 北京100853)；傅 博(解放军总医院肾科肾病中心暨重点实验室 北京100853)；叶一舟(解放军总医院肾科肾病中心暨重点实验室 北京100853)
关键词：细胞间粘附分子-1；反义核酸；上皮细胞；细胞转染；肾脏
中国免疫学杂志000203 摘 要：目的：探讨ICAM-1反义寡核苷酸对小鼠肾小管上皮细胞表达ICAM-1的影响，为利用ICAM-1反义寡核苷酸类药物治疗肾小管间质病变奠定基础。方法：小鼠ICAM-1反义寡核苷酸及其对照物参照文献合成并行全硫代磷酸化修饰。部分ICAM-1反义寡核苷酸在其5′端作FITC荧光标记。将ICAM-1反义寡核苷酸单独或脂质体转染试剂DOTAP混合后转染至培养的肾小管上皮细胞之中，转染成功后加入IL-1β诱导细胞产生ICAM-1。采用对照寡核苷酸及不含寡核苷酸的细胞转染液作为实验对照及空白对照。利用免疫组化染色的方法检测细胞ICAM-1表达变化并提取细胞总RNA行逆转录PCR及Northern杂交观察ICAM-1 mRNA的表达的变化。结果：两个不同浓度的ICAM-1反义寡核苷酸均可明显阻断IL-1β诱导的肾小管上皮细胞ICAM-1及ICAM-1 mRNA的表达；对照的寡核苷酸不能减少IL-1β诱导的肾小管上皮细胞ICAM-1及ICAM-1 mRNA的表达。结论：小鼠ICAM-1反义寡核苷酸可明显抑制IL-1β诱导的小鼠肾小管上皮细胞ICAM-1及ICAM-1 mRNA 的表达，提示ICAM-1的反义寡核苷酸有可能应用于肾小管间质病变的实验治疗之中。
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分类号：R692.6
Inhibition of ICAM-1 expression in renal tubular epithelial cells with ICAM-1 antisense oligodeoxynucleotide
CHENG Qing-Li
(Department of Nephrology,General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853)
CHEN Xiang-Mei
(Department of Nephrology,General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853)
, 百拇医药
FU Bo
(Department of Nephrology,General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853)
Abstract：Objective：The blocking effects in ICAM-1 antisense oligodeoxynucleotide (ASON) on the ICAM-1 expression of renal tubular epithelial cell was investigated to probe the potential applicability of the ASON drug in renal tubulointerstitial diseases.Methods:The mouse ICAM-1 ASON was transducted into the mouse renal tubular epithelial cells with the presence of liposome DOTAP.Another oligodeoxynucleotide,which has the same base composition as the ICAM-1 ASON but a different sequence,was also transfected into the cells as a control.ICAM-1 expression of the epithelial cells was induced by interleukin-1.The changes of ICAM-1 protein expression by the cells were measured by immunohistochemistic stainging with anti-ICAM-1 antibody.ICAM-1 mRNA expression of the epithelial cells was examined by RT-PCR and Northern blotting methods.Results：①ICAM-1 ASON inhibited the ICAM-1 and ICAM-1 mRNA expressions of the epithelial cells induced by IL-1 at dosages of both 100 and 200 nmol/L.②The control oligodeoxynucleotide has no effect on the ICAM-1 expression of the epithelial cells.Conclusion:These data demonstrate that ICAM-1 ASON can selectively inhibit the ICAM-1 expression of the cells.It suggests that the ICAM-1 ASON might be applied in treatment of renal tubular interstitial diseases.
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Key words：ICAM-1 Antisense Epithelial cell Transfection Kidney▲
细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)是介导细胞与细胞之间粘附的重要生物分子，其在机体的炎性病变中起着十分重要的作用。目前的研究发现ICAM-1的拮抗物可以有效地阻断ICAM-1介导的细胞间的粘附及炎症发生[1，2]。近几年，随着反义寡核苷酸类药物的开发成功，利用ICAM-1反义寡核苷酸类药物阻断细胞内ICAM-1 mRNA的表达，抑制体内ICAM-1的过度表达，已见文献报道[3，4]，但ICAM-1反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞表达ICAM-1的影响尚未有研究报道。国外的研究和我们的前期研究均表明肾小管上皮细胞在缺氧[5]、缺血及炎症因子[6]的诱导下细胞膜上ICAM-1的表达可以明显增强，缺氧损伤的上皮细胞进而还可诱导肾小管间质成纤维细胞的增殖及ICAM-1表达的增强[7]，这些病理生理改变在肾小管间质炎症病变及间质纤维化病变中起着十分重要的作用。为利用ICAM-1反义寡核苷酸类药物实验性治疗肾小管间质病变，本研究探讨了ICAM-1反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞表达ICAM-1的影响。
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1 材料与方法
1.1 材料 NIH雌性小鼠，重18～22 g，由解放军总医院医学实验动物中心提供。小鼠ICAM-1反义寡核苷酸及其对照物均由Cybersyn公司合成并行全硫代磷酸化修饰。小鼠ICAM-1反义寡核苷酸及其对照物的序列参照文献[3]合成。小鼠ICAM-1反义寡核苷酸序列为：5’-TGCATCCCCCAGGCCACCAT-3’；其对照物的序列为：5’-TCGCATCGACCCGCCCACTA-3’。IL-1β(10 000 U/ml)为邦定公司产品。细胞转染试剂DOTAP为Boehringer Mannheim公司产品。小鼠ICAM-1的3条引物序列分别为：Sense:5’-CAACTGGAAGCTGTTTGAGCTG-3’；Antisense 1:5’-TAGCTGGAAGATCGAAAGTCCG-3’；Antisense 2:5’-GTGTTCACAGTCTTGCTCCAT-3’。Antisense 1与Sense扩增片段为437 bp，Antisense 2与Sense扩增的片段数为1 567 bp。RNA提取试剂Trizol为GIBCO BRL公司产品，逆转录试剂盒及PRC试剂均为Promega公司产品，脱氧胞苷5’-[α-32P] 三磷酸盐(α-32P-dCTP)由北京亚辉生物医学工程公司提供。
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1.2 方法
1.2.1 细胞培养 取NIH小鼠肾脏去包膜，剪下皮质，于80目不锈钢网筛上研磨、冲洗，在140目网筛上收集肾小管节段(纯度可达98%以上)，经生理盐水冲洗2次后，将肾小管节段加入10%新生牛血清RPMI 1640培养液置于预铺1%明胶的5 ml培养瓶中培养，约5 d后可见肾小管贴壁，置换培养液继续培养至第10天可见肾小管上皮细胞长出，用0.1%胰酶/EDTA缓冲液消化传代培养3 d，取第1代肾小管上皮细胞作细胞转染实验。
1.2.2 细胞转染 将ICAM-1反义寡核苷酸与脂质体转染试剂DOTAP按1∶1(重量之比)的比例分别加入至Hepes缓冲液(20 mmol/L，pH7.4)中，配制成ICAM-1反义寡核苷酸的浓度为0.1 μg/μl的细胞转染液。将上述已制备成功的小鼠肾小管上皮细胞的培养液更换为1%新生牛血清RPMI 1640培养液后加入细胞转染液，使每瓶细胞培养液中ICAM-1反义寡核苷酸的最终浓度为100或200 nmol/L。另外按相同的方法加入对照物寡核苷酸及不含寡核苷酸的细胞转染液作为实验对照及空白对照。
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1.2.3 细胞ICAM-1表达的诱导 上述细胞转染4 h 后，弃上清，更换为10%新生牛血清RPMI 1640培养液继续培养4 h后，加入人重组的IL-1β于细胞培养液中(终浓度为10 U/ml)，刺激培养12 h，诱导细胞产生ICAM-1。
1.2.4 细胞RNA的提取及定量 上述各组细胞在刺激培养12 h后，弃上清，加入Trizol试剂1.0 ml瓶，氯仿抽提后，用异丙醇沉淀，沉淀的RNA用70%乙醇洗涤后，溶于DEPC水中，利用紫外分光光度计测定RNA溶液的光密度值，计算RNA的浓度。
1.2.5 逆转录PCR观察ICAM-1 mRNA的表达情况 取抽提的RNA 5 μg，按试剂盒的说明分别加入10 pmol Oligo dT、20 mmol/L dNTP、0.1 mol/L DTT及逆转录酶后于37℃水浴2 h，100℃灭活、变性3 min后，取2 μl逆转录产物，分别加入两对引物后进行热启动扩增，PCR扩增的条件分别为94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 45 s 共30个循环(437 bp)及94℃ 60 s，60℃ 60 s，72℃ 2 min共30个循环(1 567 bp)，PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，观察ICAM-1 mRNA的表达情况。
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1.2.6 Northern杂交检测ICAM-1 mRNA的变化 取20 μg RNA，甲醛变性凝胶电泳后转移至尼龙膜上，紫外线固定后，预杂交2 h，利用PCR扩增产物制备的ICAM-1 cDNA探针，α-32P-dCTP标记探针，杂交16 h后放射自显影观察细胞中ICAM-1 mRNA的变化。
1.2.7 免疫组化检测ICAM-1表达改变 将培养的原代肾小管上皮细胞消化传代后接种至24孔细胞培养板中，细胞接种密度为3×104/孔，将细胞分为12组，每组有3孔细胞，按方法1.2.2进行细胞转染实验，并设立不加脂质体、直接用100和200 nmol/L的寡核苷酸转染细胞，观察脂质体在细胞转染中的作用。转染后的细胞以方法1.2.4诱导细胞产生ICAM-1，同时设定不转染反义寡核苷酸及不加IL-1β刺激诱导的细胞作为空白对照。肾小管上皮细胞刺激培养结束后，细胞以95%甲醇固定10 min，加入1%小牛血清室温下阻断培养2 h，再加入大鼠抗小鼠ICAM-1单克隆抗体，4℃过夜，以0.5%Tween/PBS缓冲液洗涤后，加入辣根过氧化酶标记的兔抗大鼠IgS，室温下孵育2 h，以0.5%Tween/PBS缓冲液洗涤后，以30%过氧化氢及邻苯二胺发色，在倒置显微室下观察细胞膜上ICAM-1表达的改变，同时设立不加一抗和不加二抗的细胞作为免疫组化实验的阴性对照。根据肾小管上皮细胞膜上着色的程度分为-、+、++、+++4个等级记录ICAM-1表达的变化。
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1.2.8 统计学处理 计量资料的比较采用t检验，等级资料的比较采用Mann-Whitney 检验法。
2 结果
2.1 ICAM-1反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞ICAM-1 mRNA表达的影响 Northern杂交的结果显示与未经寡核苷酸阻断的肾小管上皮细胞比较，100和200 nmol/L两个浓度的ICAM-1反义寡核苷酸均可明显减少IL-1β诱导的肾小管上皮细胞ICAM-1 mRNA表达，而对照寡核苷酸则没有明显的阻断效应(图1)。
图1 ICAM-1反义核酸可阻断肾小管上皮细胞ICAM-1 mRNA的表达
Fig.1 The blocking effects of ICAM-1 antisense oligonucleotide on the ICAM-1 mRNA expression of cultured tubular epithelial cell
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Note:A.ICAM-1 antisene;B.control oligonucleotide;C.transfection buffer; M.1.0 kb molecular mark
2.2 ICAM-1反义寡核苷酸阻断后细胞膜上ICAM-1表达的变化 细胞免疫组化检查显示，两个浓度的ICAM-1反义寡核苷酸在体外均可以阻断IL-1β诱导的肾小管上皮细胞ICAM-1的表达(图2)，但是，对照寡核苷酸对肾小管上皮细胞ICAM-1的表达没有阻断作用，另外，未加脂质体转染的ICAM-1反义寡核苷酸在相同的条件下对ICAM-1阻断作用不明显，如表1所示。
图2 ICAM-1反义核酸可阻断IL-1β诱导的肾小管上皮细胞表达ICAM-1
Fig.2 The blocking effect of ICAM-1 antisense oligonucleotide on the ICAM-1 expression of cultured renal tubular epithelial cell induced by IL-1β
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Note:A.epithelial cell without IL-1β induction;B.epithelial cell+ICAM-1 antisense;C.epithelial cell+control oligonucleotide;D.epithelial cell+tranfection buffer
表1 ICAM-1反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞表达ICAM-1的阻断作用(n=6)
Tab.1 ICAM-1 antisense oligonucleotide blocks the ICAM-1 expression of cultured tubular epithelial cell in vitro(n=6) Group
ICAM-1 antisense
Control oligonucleotide
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Transfection buffer
-
+
++
+++
-
+
++
+++
-
+
++
+++
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100 nmol/L+DOTAP
1
4
1
01)
0
1
4
1
0
0
4
2
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200 nmol/L+DOTAP
0
5
1
01)
0
0
5
1
0
0
3
3
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100 nmol/L-DOTAP
0
1
4
1
0
0
3
3
0
0
3
3
200 nmol/L-DOTAP
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0
1
5
2
0
1
3
2
0
0
4
2
Note:1)P<0.01,compared with group of control oligonucleotide and group of transfection buffer；100 nmol/L/200 nmol/L:the concentration of ICAM-1 antisense oligonucleotide；+/-DOTAP:with/without DOTAP transfection buffer
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3 讨论
编码小鼠ICAM-1跨膜蛋白的基因全长cDNA共2 525 bp，其中5’非编码区有29 bp，开放框架区(ORF)为1 611 bp，其余的为3’非转录区[8]。本研究所选用的小鼠ICAM-1反义寡核苷酸的靶序列位于3’-非转录区。为了在实验中初步证实ICAM-1反义寡核苷酸的裂解ICAM-1 mRNA的作用，我们设计了3条PCR的引物(共两对)，其中PCR产物为437 bp的两条引物均位于ICAM-1的ORF区域，产物为1 567 bp的上游引物部分在ORF区域，而下游部分则位于3’非转录区，RT-PCR的产物将ICAM-1反义寡核苷酸的靶序列包含在其中。结果表明在ICAM-1反义寡核苷酸作用后，两种RT-PCR产物均明显减少，提示ICAM-1反义寡核苷酸进入细胞后可以使肾小管上皮细胞的ICAM-1 mRNA发生降解，从而起到反义作用。
由于未经化学修饰的外源性寡核苷酸进入细胞内可能会被细胞内的核酶降解而不能与特定的序列结合，因此在合成小鼠的ICAM-1反义寡核苷酸时，我们进行了核酸的全硫代磷酸化修饰，以增强其抗核酶的活性[9]，从本实验的结果来看，ICAM-1的反义寡核苷酸转染于小鼠的肾小管上皮细胞后能使细胞ICAM-1及ICAM-1 mRNA表达的水平明显下降，说明ICAM-1反义寡核苷酸未被核酶降解，并发挥了反义功能。
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硫代修饰的反义寡核苷酸带有较多的阴电荷，在体外细胞的实验研究中，可能出现非特异的吸附而导致“序列不依赖性抑制作用”[10，11]，为了证实ICAM-1反义寡核苷酸的作用是序列特异的，我们设立一个对照的寡核苷酸，这个对照物在碱基的种类及数量上与ICAM-1反义寡核苷酸是完全一致的，并进行了全硫代磷酸化修饰，只是其排列顺序与ICAM-1反义寡核苷酸不同，而且这一对照序列与目前已知的小鼠任何基因产物均无同源性[3]，结果表明这一个对照寡核苷酸没有抑制ICAM-1 mRNA表达的作用，提示本研究中小鼠ICAM-1反义寡核苷酸的作用是序列特异性的。
已有研究表明，人的ICAM-1反义寡核苷酸抑制脐静脉内皮细胞表达ICAM-1的最适剂量为50～200 nmol/L，过低过高均会降低其抑制效率[12]，本实验研究采用了两种浓度剂量100及200 nmol/L，结果发现这两种浓度的小鼠ICAM-1反义寡核苷酸均可明显抑制肾小管上皮细胞ICAM-1 mRNA的表达。
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总之，本研究结果提示小鼠ICAM-1反义寡核苷酸可以抑制小鼠肾小管上皮细胞ICAM-1及ICAM-1 mRNA的表达，且这种抑制作用是特异序列依赖性的。本研究为进一步应用ICAM-1反义寡核苷酸治疗肾小管间质炎症性疾病变奠定了基础。■
①本课题为国家自然科学基金资助项目
②通讯联系人：陈香美 E-mail:xmchen@public.bta.net.cn
作者简介：程庆砾，男，34岁，副主任医师，副教授，主要从事肾小管间质病变的研究；陈香美，女，47岁，主任医师，教授，主要从事慢性进展性肾病研究
参考文献：
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[2]Katz S M,Tian L,Stepkowshi S M et al.Effect of ICAM-1/LFA-1 blockade on pancreatic islet allograft survival ,function,and early cytokine production.Tansplant Proc, 1997;29:748
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[4]Glover J M, Leeds J M,Mant T G et al.Phase I safely and pharmacokinetic profile of an intercellular adhesion molecule-l antisense oligodeoxynucleotide(ISIS 2302). J Pharmacol Exp Ther， 1997;282:1173
, 百拇医药
[5]Combe C,Burton C J,Dufourco P et al.Hypoxia induces intercellular adhesion molecule-1 on cultured human tubular cells.Kidney Int， 1997;51(6):1703
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[7]李文歌，陈香美，程庆砾 et al.用共培养体系观察缺氧的肾小管上皮细胞对成纤维细胞的调节作用.中华内科杂志，1996；35：810
[8]Horley K J, Carpenito C,Baker B et al.Molecular cloning of murine intercellular adhesion molecule(ICAM-1).EMBO J， 1989;8(10):2889
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[9]Crook R M,Graham M J,Cooke M E et al.In vitro pharmacokinetics of phosphorothioate antisense oligonucleotides.J Pharmacol Exp Ther， 1995;275:462
[10]Jansen B,Wadl H,Inoue S A et al.Phosphorothioate oligonucleotides reduce melanoma growth in a SCID-hu mouse model by a nonantisense mechanisem.Antisense Res Dev, 1995;5:271
[11]Giles R V,Spiller D G,Tidd D M et al.Detection of ribonuclease H-generated mRNA fragments in human leukemia cells following reversible membrane permeabilization in the presence of antisense oligodeoxynucleotides. Antisense Res Dev，1995;5:23
[12]Bennett E F,Candon T P,Grimm S et al.Inhibition of endothelial cell adhesion molecule expression with antisense oligomucleotides.J Immuonol， 1994;152:3530
收稿日期：1998-07-03
修回日期：1998-10-26, 百拇医药
单位：程庆砾(解放军总医院肾科肾病中心暨重点实验室 北京100853)；陈香美(解放军总医院肾科肾病中心暨重点实验室 北京100853)；傅 博(解放军总医院肾科肾病中心暨重点实验室 北京100853)；叶一舟(解放军总医院肾科肾病中心暨重点实验室 北京100853)
关键词：细胞间粘附分子-1；反义核酸；上皮细胞；细胞转染；肾脏
中国免疫学杂志000203 摘 要：目的：探讨ICAM-1反义寡核苷酸对小鼠肾小管上皮细胞表达ICAM-1的影响，为利用ICAM-1反义寡核苷酸类药物治疗肾小管间质病变奠定基础。方法：小鼠ICAM-1反义寡核苷酸及其对照物参照文献合成并行全硫代磷酸化修饰。部分ICAM-1反义寡核苷酸在其5′端作FITC荧光标记。将ICAM-1反义寡核苷酸单独或脂质体转染试剂DOTAP混合后转染至培养的肾小管上皮细胞之中，转染成功后加入IL-1β诱导细胞产生ICAM-1。采用对照寡核苷酸及不含寡核苷酸的细胞转染液作为实验对照及空白对照。利用免疫组化染色的方法检测细胞ICAM-1表达变化并提取细胞总RNA行逆转录PCR及Northern杂交观察ICAM-1 mRNA的表达的变化。结果：两个不同浓度的ICAM-1反义寡核苷酸均可明显阻断IL-1β诱导的肾小管上皮细胞ICAM-1及ICAM-1 mRNA的表达；对照的寡核苷酸不能减少IL-1β诱导的肾小管上皮细胞ICAM-1及ICAM-1 mRNA的表达。结论：小鼠ICAM-1反义寡核苷酸可明显抑制IL-1β诱导的小鼠肾小管上皮细胞ICAM-1及ICAM-1 mRNA 的表达，提示ICAM-1的反义寡核苷酸有可能应用于肾小管间质病变的实验治疗之中。
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Inhibition of ICAM-1 expression in renal tubular epithelial cells with ICAM-1 antisense oligodeoxynucleotide
CHENG Qing-Li
(Department of Nephrology,General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853)
CHEN Xiang-Mei
(Department of Nephrology,General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853)
, 百拇医药
FU Bo
(Department of Nephrology,General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853)
Abstract：Objective：The blocking effects in ICAM-1 antisense oligodeoxynucleotide (ASON) on the ICAM-1 expression of renal tubular epithelial cell was investigated to probe the potential applicability of the ASON drug in renal tubulointerstitial diseases.Methods:The mouse ICAM-1 ASON was transducted into the mouse renal tubular epithelial cells with the presence of liposome DOTAP.Another oligodeoxynucleotide,which has the same base composition as the ICAM-1 ASON but a different sequence,was also transfected into the cells as a control.ICAM-1 expression of the epithelial cells was induced by interleukin-1.The changes of ICAM-1 protein expression by the cells were measured by immunohistochemistic stainging with anti-ICAM-1 antibody.ICAM-1 mRNA expression of the epithelial cells was examined by RT-PCR and Northern blotting methods.Results：①ICAM-1 ASON inhibited the ICAM-1 and ICAM-1 mRNA expressions of the epithelial cells induced by IL-1 at dosages of both 100 and 200 nmol/L.②The control oligodeoxynucleotide has no effect on the ICAM-1 expression of the epithelial cells.Conclusion:These data demonstrate that ICAM-1 ASON can selectively inhibit the ICAM-1 expression of the cells.It suggests that the ICAM-1 ASON might be applied in treatment of renal tubular interstitial diseases.
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Key words：ICAM-1 Antisense Epithelial cell Transfection Kidney▲
细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)是介导细胞与细胞之间粘附的重要生物分子，其在机体的炎性病变中起着十分重要的作用。目前的研究发现ICAM-1的拮抗物可以有效地阻断ICAM-1介导的细胞间的粘附及炎症发生[1，2]。近几年，随着反义寡核苷酸类药物的开发成功，利用ICAM-1反义寡核苷酸类药物阻断细胞内ICAM-1 mRNA的表达，抑制体内ICAM-1的过度表达，已见文献报道[3，4]，但ICAM-1反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞表达ICAM-1的影响尚未有研究报道。国外的研究和我们的前期研究均表明肾小管上皮细胞在缺氧[5]、缺血及炎症因子[6]的诱导下细胞膜上ICAM-1的表达可以明显增强，缺氧损伤的上皮细胞进而还可诱导肾小管间质成纤维细胞的增殖及ICAM-1表达的增强[7]，这些病理生理改变在肾小管间质炎症病变及间质纤维化病变中起着十分重要的作用。为利用ICAM-1反义寡核苷酸类药物实验性治疗肾小管间质病变，本研究探讨了ICAM-1反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞表达ICAM-1的影响。
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1 材料与方法
1.1 材料 NIH雌性小鼠，重18～22 g，由解放军总医院医学实验动物中心提供。小鼠ICAM-1反义寡核苷酸及其对照物均由Cybersyn公司合成并行全硫代磷酸化修饰。小鼠ICAM-1反义寡核苷酸及其对照物的序列参照文献[3]合成。小鼠ICAM-1反义寡核苷酸序列为：5’-TGCATCCCCCAGGCCACCAT-3’；其对照物的序列为：5’-TCGCATCGACCCGCCCACTA-3’。IL-1β(10 000 U/ml)为邦定公司产品。细胞转染试剂DOTAP为Boehringer Mannheim公司产品。小鼠ICAM-1的3条引物序列分别为：Sense:5’-CAACTGGAAGCTGTTTGAGCTG-3’；Antisense 1:5’-TAGCTGGAAGATCGAAAGTCCG-3’；Antisense 2:5’-GTGTTCACAGTCTTGCTCCAT-3’。Antisense 1与Sense扩增片段为437 bp，Antisense 2与Sense扩增的片段数为1 567 bp。RNA提取试剂Trizol为GIBCO BRL公司产品，逆转录试剂盒及PRC试剂均为Promega公司产品，脱氧胞苷5’-[α-32P] 三磷酸盐(α-32P-dCTP)由北京亚辉生物医学工程公司提供。
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1.2 方法
1.2.1 细胞培养 取NIH小鼠肾脏去包膜，剪下皮质，于80目不锈钢网筛上研磨、冲洗，在140目网筛上收集肾小管节段(纯度可达98%以上)，经生理盐水冲洗2次后，将肾小管节段加入10%新生牛血清RPMI 1640培养液置于预铺1%明胶的5 ml培养瓶中培养，约5 d后可见肾小管贴壁，置换培养液继续培养至第10天可见肾小管上皮细胞长出，用0.1%胰酶/EDTA缓冲液消化传代培养3 d，取第1代肾小管上皮细胞作细胞转染实验。
1.2.2 细胞转染 将ICAM-1反义寡核苷酸与脂质体转染试剂DOTAP按1∶1(重量之比)的比例分别加入至Hepes缓冲液(20 mmol/L，pH7.4)中，配制成ICAM-1反义寡核苷酸的浓度为0.1 μg/μl的细胞转染液。将上述已制备成功的小鼠肾小管上皮细胞的培养液更换为1%新生牛血清RPMI 1640培养液后加入细胞转染液，使每瓶细胞培养液中ICAM-1反义寡核苷酸的最终浓度为100或200 nmol/L。另外按相同的方法加入对照物寡核苷酸及不含寡核苷酸的细胞转染液作为实验对照及空白对照。
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1.2.3 细胞ICAM-1表达的诱导 上述细胞转染4 h 后，弃上清，更换为10%新生牛血清RPMI 1640培养液继续培养4 h后，加入人重组的IL-1β于细胞培养液中(终浓度为10 U/ml)，刺激培养12 h，诱导细胞产生ICAM-1。
1.2.4 细胞RNA的提取及定量 上述各组细胞在刺激培养12 h后，弃上清，加入Trizol试剂1.0 ml瓶，氯仿抽提后，用异丙醇沉淀，沉淀的RNA用70%乙醇洗涤后，溶于DEPC水中，利用紫外分光光度计测定RNA溶液的光密度值，计算RNA的浓度。
1.2.5 逆转录PCR观察ICAM-1 mRNA的表达情况 取抽提的RNA 5 μg，按试剂盒的说明分别加入10 pmol Oligo dT、20 mmol/L dNTP、0.1 mol/L DTT及逆转录酶后于37℃水浴2 h，100℃灭活、变性3 min后，取2 μl逆转录产物，分别加入两对引物后进行热启动扩增，PCR扩增的条件分别为94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 45 s 共30个循环(437 bp)及94℃ 60 s，60℃ 60 s，72℃ 2 min共30个循环(1 567 bp)，PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，观察ICAM-1 mRNA的表达情况。
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1.2.6 Northern杂交检测ICAM-1 mRNA的变化 取20 μg RNA，甲醛变性凝胶电泳后转移至尼龙膜上，紫外线固定后，预杂交2 h，利用PCR扩增产物制备的ICAM-1 cDNA探针，α-32P-dCTP标记探针，杂交16 h后放射自显影观察细胞中ICAM-1 mRNA的变化。
1.2.7 免疫组化检测ICAM-1表达改变 将培养的原代肾小管上皮细胞消化传代后接种至24孔细胞培养板中，细胞接种密度为3×104/孔，将细胞分为12组，每组有3孔细胞，按方法1.2.2进行细胞转染实验，并设立不加脂质体、直接用100和200 nmol/L的寡核苷酸转染细胞，观察脂质体在细胞转染中的作用。转染后的细胞以方法1.2.4诱导细胞产生ICAM-1，同时设定不转染反义寡核苷酸及不加IL-1β刺激诱导的细胞作为空白对照。肾小管上皮细胞刺激培养结束后，细胞以95%甲醇固定10 min，加入1%小牛血清室温下阻断培养2 h，再加入大鼠抗小鼠ICAM-1单克隆抗体，4℃过夜，以0.5%Tween/PBS缓冲液洗涤后，加入辣根过氧化酶标记的兔抗大鼠IgS，室温下孵育2 h，以0.5%Tween/PBS缓冲液洗涤后，以30%过氧化氢及邻苯二胺发色，在倒置显微室下观察细胞膜上ICAM-1表达的改变，同时设立不加一抗和不加二抗的细胞作为免疫组化实验的阴性对照。根据肾小管上皮细胞膜上着色的程度分为-、+、++、+++4个等级记录ICAM-1表达的变化。
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1.2.8 统计学处理 计量资料的比较采用t检验，等级资料的比较采用Mann-Whitney 检验法。
2 结果
2.1 ICAM-1反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞ICAM-1 mRNA表达的影响 Northern杂交的结果显示与未经寡核苷酸阻断的肾小管上皮细胞比较，100和200 nmol/L两个浓度的ICAM-1反义寡核苷酸均可明显减少IL-1β诱导的肾小管上皮细胞ICAM-1 mRNA表达，而对照寡核苷酸则没有明显的阻断效应(图1)。
图1 ICAM-1反义核酸可阻断肾小管上皮细胞ICAM-1 mRNA的表达
Fig.1 The blocking effects of ICAM-1 antisense oligonucleotide on the ICAM-1 mRNA expression of cultured tubular epithelial cell
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Note:A.ICAM-1 antisene;B.control oligonucleotide;C.transfection buffer; M.1.0 kb molecular mark
2.2 ICAM-1反义寡核苷酸阻断后细胞膜上ICAM-1表达的变化 细胞免疫组化检查显示，两个浓度的ICAM-1反义寡核苷酸在体外均可以阻断IL-1β诱导的肾小管上皮细胞ICAM-1的表达(图2)，但是，对照寡核苷酸对肾小管上皮细胞ICAM-1的表达没有阻断作用，另外，未加脂质体转染的ICAM-1反义寡核苷酸在相同的条件下对ICAM-1阻断作用不明显，如表1所示。
图2 ICAM-1反义核酸可阻断IL-1β诱导的肾小管上皮细胞表达ICAM-1Fig.2 The blocking effect of ICAM-1 antisense oligonucleotide on the ICAM-1 expression of cultured renal tubular epithelial cell induced by IL-1β
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Note:A.epithelial cell without IL-1β induction;B.epithelial cell+ICAM-1 antisense;C.epithelial cell+control oligonucleotide;D.epithelial cell+tranfection buffer
表1 ICAM-1反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞表达ICAM-1的阻断作用(n=6)
Tab.1 ICAM-1 antisense oligonucleotide blocks the ICAM-1 expression of cultured tubular epithelial cell in vitro(n=6) Group
ICAM-1 antisense
Control oligonucleotide
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Transfection buffer
-
+
++
+++
-
+
++
+++
-
+
++
+++
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100 nmol/L+DOTAP
1
4
1
01)
0
1
4
1
0
0
4
2
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200 nmol/L+DOTAP
0
5
1
01)
0
0
5
1
0
0
3
3
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100 nmol/L-DOTAP
0
1
4
1
0
0
3
3
0
0
3
3
200 nmol/L-DOTAP
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0
1
5
2
0
1
3
2
0
0
4
2
Note:1)P<0.01,compared with group of control oligonucleotide and group of transfection buffer；100 nmol/L/200 nmol/L:the concentration of ICAM-1 antisense oligonucleotide；+/-DOTAP:with/without DOTAP transfection buffer
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3 讨论
编码小鼠ICAM-1跨膜蛋白的基因全长cDNA共2 525 bp，其中5’非编码区有29 bp，开放框架区(ORF)为1 611 bp，其余的为3’非转录区[8]。本研究所选用的小鼠ICAM-1反义寡核苷酸的靶序列位于3’-非转录区。为了在实验中初步证实ICAM-1反义寡核苷酸的裂解ICAM-1 mRNA的作用，我们设计了3条PCR的引物(共两对)，其中PCR产物为437 bp的两条引物均位于ICAM-1的ORF区域，产物为1 567 bp的上游引物部分在ORF区域，而下游部分则位于3’非转录区，RT-PCR的产物将ICAM-1反义寡核苷酸的靶序列包含在其中。结果表明在ICAM-1反义寡核苷酸作用后，两种RT-PCR产物均明显减少，提示ICAM-1反义寡核苷酸进入细胞后可以使肾小管上皮细胞的ICAM-1 mRNA发生降解，从而起到反义作用。
由于未经化学修饰的外源性寡核苷酸进入细胞内可能会被细胞内的核酶降解而不能与特定的序列结合，因此在合成小鼠的ICAM-1反义寡核苷酸时，我们进行了核酸的全硫代磷酸化修饰，以增强其抗核酶的活性[9]，从本实验的结果来看，ICAM-1的反义寡核苷酸转染于小鼠的肾小管上皮细胞后能使细胞ICAM-1及ICAM-1 mRNA表达的水平明显下降，说明ICAM-1反义寡核苷酸未被核酶降解，并发挥了反义功能。
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硫代修饰的反义寡核苷酸带有较多的阴电荷，在体外细胞的实验研究中，可能出现非特异的吸附而导致“序列不依赖性抑制作用”[10，11]，为了证实ICAM-1反义寡核苷酸的作用是序列特异的，我们设立一个对照的寡核苷酸，这个对照物在碱基的种类及数量上与ICAM-1反义寡核苷酸是完全一致的，并进行了全硫代磷酸化修饰，只是其排列顺序与ICAM-1反义寡核苷酸不同，而且这一对照序列与目前已知的小鼠任何基因产物均无同源性[3]，结果表明这一个对照寡核苷酸没有抑制ICAM-1 mRNA表达的作用，提示本研究中小鼠ICAM-1反义寡核苷酸的作用是序列特异性的。
已有研究表明，人的ICAM-1反义寡核苷酸抑制脐静脉内皮细胞表达ICAM-1的最适剂量为50～200 nmol/L，过低过高均会降低其抑制效率[12]，本实验研究采用了两种浓度剂量100及200 nmol/L，结果发现这两种浓度的小鼠ICAM-1反义寡核苷酸均可明显抑制肾小管上皮细胞ICAM-1 mRNA的表达。
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总之，本研究结果提示小鼠ICAM-1反义寡核苷酸可以抑制小鼠肾小管上皮细胞ICAM-1及ICAM-1 mRNA的表达，且这种抑制作用是特异序列依赖性的。本研究为进一步应用ICAM-1反义寡核苷酸治疗肾小管间质炎症性疾病变奠定了基础。■
①本课题为国家自然科学基金资助项目
②通讯联系人：陈香美 E-mail:xmchen@public.bta.net.cn
作者简介：程庆砾，男，34岁，副主任医师，副教授，主要从事肾小管间质病变的研究；陈香美，女，47岁，主任医师，教授，主要从事慢性进展性肾病研究
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收稿日期：1998-07-03
修回日期：1998-10-26, 百拇医药