HPLC测定脑组织和脑脊液中4种氨基酸类神经递质含量的方法改良研究*
作者：王炜 刘朝 江卫国 王式平 何善述
单位：王炜 王式平 江卫国 何善述 同济医科大学基础医学院生物化学教研室，武汉 430030；刘朝 同济医科大学附属协和医院中心实验室，武汉 430022
关键词：高效液相色谱；神经递质；脑脊液；脑组织
同济医科大学学报990202 摘要 谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)等神经递质的代谢异常是诱发多种神经系统疾病的因素之一。由于神经递质在脑内的含量很低，改良建立了一种用HPLC荧光检测Glu、GABA等4种神经递质的方法，以高丝氨酸为内标，流动相为磷酸缓冲液和甲醇，梯度洗脱20 min，荧光检测。分离效果及线性关系良好，Glu、GABA的相关系数分别为0.996 9、0.999 6；精密度CV批内3.4 %，批间5.6 %；其最小检测限分别为3.3 pmol、1.6 pmol。
, 百拇医药
中图法分类号 Q592.5， R322.8
Modification of HPLC Assay for 4 Amino Acid Neurotransmitter Content
in Brain Tissue and Cerebrospinal Fluid
Wang Wei1, Liu Zhao2, He Shanshu1 et al
1 Department 0f Biochemistry,School of Basic Medical Sciences,Tongji Medical University, Wuhan 430030
2 Central Laboratory,Xiehe Hospital,Tongji Medcal University,Wuhan 430022
, 百拇医药
Abstract Abnormal metabolism of neurotransmitters such as glutamate(Glu) and γ-aminobutyric acid(GABA) might contribute to one of factors to induce the multiple central nervous system (CNS) disorders. An modified fluorometric method was established for the determination of 4 neurotransmitters such as Glu and GABA by HPLC assay. Homoserine served as internal standard,phosphate buffer solution and methanol as mobile phases, and gradient elution lasted 20 min with fluorescence detection. Separation and linear relationship were fine. Coefficients of correlation for Glu and GABA were 0.996 9 and 0.999 6, respectively. The precision was 3.4 % for interassay CV, and 5.6 % for intraassay CV. The limits of detection for Glu and GABA were 3.3 pmol and 1.6 pmol, respectively.
, http://www.100md.com
Key words HPLC；neurotransmitter；cerebrospinal fluid；brain tissue
谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)是脑部的重要兴奋性神经递质，γ-氨基丁酸(GABA)及甘氨酸(Gly)是脑部的重要抑制性神经递质，这些氨基酸类神经递质存在于脑组织和脑脊液中，其含量变化可诱发如癫痫、舞蹈病、帕金森病等多种神经系统疾病[1]。因此，测定这些氨基酸类神经递质含量变化对于神经系统疾病的病因和预后分析有极其重要的参考价值，但是其含量很低(pmol/L)，用一般检测方法的灵敏度不够。本文利用高效液相色谱法(HPLC)的高分辨效力和荧光检测的高灵敏度及配合优选的内标物，改良建立了适用于检测这4种氨基酸类神经递质的HPLC荧光测定法，结果精确稳定。已多次应用于癫痫病的实验研究及临床检测，效果满意，值得推广应用。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 仪器
采用Gilson 116型高效液相色谱仪(HPLC)，C18反相柱4.6 mm×100 mm，粒度5 μm，荧光检测器。
1.2 试剂
邻苯二甲醛(OPA)、L-Glu、L-Asp、L-Gly、GABA及内标(高丝氨酸，homoserine)均购自Sigma公司；甲醇为色谱级，其余试剂均为AR规格。试剂用水均为亚沸重蒸馏水。
1.3 氨基酸标准品储备液
氨基酸溶于水/甲醇(50∶50)中，其浓度为1.0mmol/L，分装后-20 ℃冷藏。
1.4 衍生化试剂配制
参照文献[2,3]，取270mg OPA溶于5ml乙醇(995 ml/L)中，加2-巯基乙醇200μl，再加硼酸缓冲液(0.4mol/L,pH9.5)至50ml。此试剂用前需“老化”24h，每3～4d加2-巯基乙醇20 μl以维持试剂强度。
, 百拇医药
1.5 衍生化反应
氨基酸标准混合液(约为每种氨基酸40pmol/μl)20 μl和OPA液100μl在室温下反应，2min后即进样10μl。
1.6 色谱条件
以0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)和甲醇为流动相，开始洗脱时甲醇为35%，每min递增2%；流速为1ml/min，约20min洗脱结束，打印出洗脱曲线(如附图所示)。流动相试剂在用前经0.45μm孔径滤膜过滤并脱气处理。
附图 洗脱曲线
1.7 样品预处理
1.7.1 脑脊液中4种氨基酸类神经递质的检测：取脑脊液20μl加0.4 mol/L过氯酸(PCA)180 μl，混匀，37 ℃，12000r/min离心45 min。取上清液10μl加内标物(30 pmol/L高丝氨酸)10 μl，再加OPA 100 μl，2min后即进样10μl则按上述色谱条件进行梯度洗脱。
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1.7.2脑组织中4种氨基酸类神经递质的检测：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)在冰上制备脑组织匀浆，再用PCA除去蛋白，离心沉淀，上清液即用来测定4种氨基酸的含量(方法同1.7.1)。
2 结 果
2.1 色谱结果
在上述色谱条件下，经20min梯度洗脱则将Asp、Glu、GABA、Gly及homo-serine分离，其保留时间依次为4min 20s、5min 20s、11min、13min 50s及10min，参见附图。
2.2 线性与最低检测限
Glu、GABA在5～80 pmol/L内线性关系良好，其相关系数分别为0.996 9、0.999 6。最低检测限分别为3.3、1.6pmol。
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2.3 精密度
批内CV为3.4%，批间CV为5.6 %。
2.4 正常大鼠的测定结果
正常Wistar大鼠的脑脊液和海马组织中4种氨基酸类神经递质含量的测定结果见附表。
附表 正常大鼠的脑脊液和海马组织中神经递质的含量(
±s,n=6)
脑脊液(nmol/L)
海马组织(μmol/L)
Glu
36.69± 7.80
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4.84±0.37
Asp
18.02± 3.15
1.68±0.18
Gly
16.92± 2.57
0.43±0.10
GABA
173.53±33.62
5.12±1.17
3 讨 论
兴奋性神经递质如Glu、Asp及抑制性神经递质如GABA、Gly的含量变化及二者比例的改变是诊断神经系统疾病常用的重要生化指标；由于氨基酸类神经递质在脑组织及脑脊液中的含量很低，只有籍助高灵敏度和高分辨力的HPLC才能满足临床及科研实验的检测要求。我们在探索该检测方法时，在参考文献[2,3]中报道的内标物所需的洗脱时间远远超出本文检测的4种氨基酸类神经递质的洗脱时间；我们改用高丝氨酸(homoserine)作内标定量，同时降低流动相中磷酸缓冲液的浓度(从0.2 mol/L降到0.1 mol/L)，使内标物(高丝氨酸)的洗脱时间正好介于Asp、Glu和Gly、GABA之间，仅需20 min的洗脱时间(如附图所示)，而且洗脱时间稳定，重复性好。因此，本文改良建立了一种可信的氨基酸类神经递质的HPLC荧光测定法。经多次科研实验应用及临床检测，效果满意，值得推广应用。
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*国家自然科学基金重点资助项目 (No.39330210)
参考文献
1 哈里逊著，赵华月主译. 哈里逊内科学(下册).神经系统疾病.北京：人民卫生出版社，1994. 2 306～2 433
2 Lindroth P,Mopper K. High performance liquid chromatographic determination of subpicomole amounts of amino acids by precolumn fluorescence derivatization with o-phthalaldehyde. Anal Chem,1979,51:1 667
3 Allison L A,Mayer G S,Shoup R E. o-phthalaldehyde derivatives of amines for high-speed liquid chromatography. Anal Chem,1984,56:1 089
收稿日期：1998-10-09, 百拇医药
单位：王炜 王式平 江卫国 何善述 同济医科大学基础医学院生物化学教研室，武汉 430030；刘朝 同济医科大学附属协和医院中心实验室，武汉 430022
关键词：高效液相色谱；神经递质；脑脊液；脑组织
同济医科大学学报990202 摘要 谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)等神经递质的代谢异常是诱发多种神经系统疾病的因素之一。由于神经递质在脑内的含量很低，改良建立了一种用HPLC荧光检测Glu、GABA等4种神经递质的方法，以高丝氨酸为内标，流动相为磷酸缓冲液和甲醇，梯度洗脱20 min，荧光检测。分离效果及线性关系良好，Glu、GABA的相关系数分别为0.996 9、0.999 6；精密度CV批内3.4 %，批间5.6 %；其最小检测限分别为3.3 pmol、1.6 pmol。
, 百拇医药
中图法分类号 Q592.5， R322.8
Modification of HPLC Assay for 4 Amino Acid Neurotransmitter Content
in Brain Tissue and Cerebrospinal Fluid
Wang Wei1, Liu Zhao2, He Shanshu1 et al
1 Department 0f Biochemistry,School of Basic Medical Sciences,Tongji Medical University, Wuhan 430030
2 Central Laboratory,Xiehe Hospital,Tongji Medcal University,Wuhan 430022
, 百拇医药
Abstract Abnormal metabolism of neurotransmitters such as glutamate(Glu) and γ-aminobutyric acid(GABA) might contribute to one of factors to induce the multiple central nervous system (CNS) disorders. An modified fluorometric method was established for the determination of 4 neurotransmitters such as Glu and GABA by HPLC assay. Homoserine served as internal standard,phosphate buffer solution and methanol as mobile phases, and gradient elution lasted 20 min with fluorescence detection. Separation and linear relationship were fine. Coefficients of correlation for Glu and GABA were 0.996 9 and 0.999 6, respectively. The precision was 3.4 % for interassay CV, and 5.6 % for intraassay CV. The limits of detection for Glu and GABA were 3.3 pmol and 1.6 pmol, respectively.
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Key words HPLC；neurotransmitter；cerebrospinal fluid；brain tissue
谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)是脑部的重要兴奋性神经递质，γ-氨基丁酸(GABA)及甘氨酸(Gly)是脑部的重要抑制性神经递质，这些氨基酸类神经递质存在于脑组织和脑脊液中，其含量变化可诱发如癫痫、舞蹈病、帕金森病等多种神经系统疾病[1]。因此，测定这些氨基酸类神经递质含量变化对于神经系统疾病的病因和预后分析有极其重要的参考价值，但是其含量很低(pmol/L)，用一般检测方法的灵敏度不够。本文利用高效液相色谱法(HPLC)的高分辨效力和荧光检测的高灵敏度及配合优选的内标物，改良建立了适用于检测这4种氨基酸类神经递质的HPLC荧光测定法，结果精确稳定。已多次应用于癫痫病的实验研究及临床检测，效果满意，值得推广应用。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 仪器
采用Gilson 116型高效液相色谱仪(HPLC)，C18反相柱4.6 mm×100 mm，粒度5 μm，荧光检测器。
1.2 试剂
邻苯二甲醛(OPA)、L-Glu、L-Asp、L-Gly、GABA及内标(高丝氨酸，homoserine)均购自Sigma公司；甲醇为色谱级，其余试剂均为AR规格。试剂用水均为亚沸重蒸馏水。
1.3 氨基酸标准品储备液
氨基酸溶于水/甲醇(50∶50)中，其浓度为1.0mmol/L，分装后-20 ℃冷藏。
1.4 衍生化试剂配制
参照文献[2,3]，取270mg OPA溶于5ml乙醇(995 ml/L)中，加2-巯基乙醇200μl，再加硼酸缓冲液(0.4mol/L,pH9.5)至50ml。此试剂用前需“老化”24h，每3～4d加2-巯基乙醇20 μl以维持试剂强度。
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1.5 衍生化反应
氨基酸标准混合液(约为每种氨基酸40pmol/μl)20 μl和OPA液100μl在室温下反应，2min后即进样10μl。
1.6 色谱条件
以0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)和甲醇为流动相，开始洗脱时甲醇为35%，每min递增2%；流速为1ml/min，约20min洗脱结束，打印出洗脱曲线(如附图所示)。流动相试剂在用前经0.45μm孔径滤膜过滤并脱气处理。
附图 洗脱曲线
1.7 样品预处理
1.7.1 脑脊液中4种氨基酸类神经递质的检测：取脑脊液20μl加0.4 mol/L过氯酸(PCA)180 μl，混匀，37 ℃，12000r/min离心45 min。取上清液10μl加内标物(30 pmol/L高丝氨酸)10 μl，再加OPA 100 μl，2min后即进样10μl则按上述色谱条件进行梯度洗脱。
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1.7.2脑组织中4种氨基酸类神经递质的检测：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)在冰上制备脑组织匀浆，再用PCA除去蛋白，离心沉淀，上清液即用来测定4种氨基酸的含量(方法同1.7.1)。
2 结 果
2.1 色谱结果
在上述色谱条件下，经20min梯度洗脱则将Asp、Glu、GABA、Gly及homo-serine分离，其保留时间依次为4min 20s、5min 20s、11min、13min 50s及10min，参见附图。
2.2 线性与最低检测限
Glu、GABA在5～80 pmol/L内线性关系良好，其相关系数分别为0.996 9、0.999 6。最低检测限分别为3.3、1.6pmol。
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2.3 精密度
批内CV为3.4%，批间CV为5.6 %。
2.4 正常大鼠的测定结果
正常Wistar大鼠的脑脊液和海马组织中4种氨基酸类神经递质含量的测定结果见附表。
附表 正常大鼠的脑脊液和海马组织中神经递质的含量(
±s,n=6)脑脊液(nmol/L)
海马组织(μmol/L)
Glu
36.69± 7.80
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4.84±0.37
Asp
18.02± 3.15
1.68±0.18
Gly
16.92± 2.57
0.43±0.10
GABA
173.53±33.62
5.12±1.17
3 讨 论
兴奋性神经递质如Glu、Asp及抑制性神经递质如GABA、Gly的含量变化及二者比例的改变是诊断神经系统疾病常用的重要生化指标；由于氨基酸类神经递质在脑组织及脑脊液中的含量很低，只有籍助高灵敏度和高分辨力的HPLC才能满足临床及科研实验的检测要求。我们在探索该检测方法时，在参考文献[2,3]中报道的内标物所需的洗脱时间远远超出本文检测的4种氨基酸类神经递质的洗脱时间；我们改用高丝氨酸(homoserine)作内标定量，同时降低流动相中磷酸缓冲液的浓度(从0.2 mol/L降到0.1 mol/L)，使内标物(高丝氨酸)的洗脱时间正好介于Asp、Glu和Gly、GABA之间，仅需20 min的洗脱时间(如附图所示)，而且洗脱时间稳定，重复性好。因此，本文改良建立了一种可信的氨基酸类神经递质的HPLC荧光测定法。经多次科研实验应用及临床检测，效果满意，值得推广应用。
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*国家自然科学基金重点资助项目 (No.39330210)
参考文献
1 哈里逊著，赵华月主译. 哈里逊内科学(下册).神经系统疾病.北京：人民卫生出版社，1994. 2 306～2 433
2 Lindroth P,Mopper K. High performance liquid chromatographic determination of subpicomole amounts of amino acids by precolumn fluorescence derivatization with o-phthalaldehyde. Anal Chem,1979,51:1 667
3 Allison L A,Mayer G S,Shoup R E. o-phthalaldehyde derivatives of amines for high-speed liquid chromatography. Anal Chem,1984,56:1 089
收稿日期：1998-10-09, 百拇医药