薄层扫描法测定小鼠脑内4种神经递质的含量
作者：邓康 罗健
单位：邓康 罗健(广东宏远集团生物化学制药厂 广州 510021)
关键词：TLC；γ-氨基丁酸；丙氨酸；谷氨酸；牛磺酸
西北药学杂志000404 摘要 用双波长薄层扫描法测定小白鼠脑内的γ-氨基丁酸、丙氨酸、谷氨酸和牛磺酸四种神经递质的含量，测定波长为λS＝500nm，λR＝700nm，展开剂为苯酚-甲酸-水(18∶2∶1)，显色剂为1%茚三酮乙醇液；75℃～80℃烘干，结果斑点分离清晰，Rf值适中。四种成分的回收率分别为100.7%(γ-氨基丁酸)，101.1%(丙氨酸)，100.5%(谷氨酸)，100.4%(牛磺酸)。
中图分类号：R917 文献标识码：A
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，是生物体不可缺少的营养成分之一。检测氨基酸可用氨基酸自动分析仪、高效液相层析法等技术〔1〕，灵敏度高，快速准确，但设备昂贵。本文采用TLC法测定小白鼠脑内四种神经递质的含量〔2，3〕。
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1 仪器与试药
1.1 仪器 薄层扫描仪(CS-910型，日本岛津公司)；薄层自动铺板器(重庆南岸新力实验电器厂)。
1.2 试药 硅胶G(薄层层析用，青岛海洋化工厂)；硅胶G预制板(薄层层析用，浙江省台州市四青生化材料厂)；γ-氨基丁酸、丙氨酸、谷氨酸、牛磺酸对照品(中国药品生物制品检定所)。
2 方法与结果
2.1 样品液的制备及对照品液的配制 取健康小白鼠脑组织液，进行蛋白质沉淀，上清液作为样品液。
另准确称取γ-氨基丁酸74.7mg，丙氨酸68.0mg，谷氨酸74.0mg，牛磺酸87.3mg，加水溶解定容于10ml量瓶；再准确吸取溶液2ml，加3ml水后再加甲醇定容成10ml，制成对照品混合溶液。
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2.2 薄层层析条件及结果 把样品液、标准对照液点于硅胶G上，用苯酚-甲酸-水(18∶2∶1)展开2次(第一次展后晾干再二次展开)，晾干(挥干)后，于烘箱烘干(低于80℃)；喷以1%茚三酮乙醇液显色，斑点显紫红色，结果如图1。
图1 脑内递质样品(Ⅰ)及对照液(Ⅱ)TLC谱图
a-γ-氨基丁酸 b-丙氨酸 c-谷氨酸 d-牛磺酸
2.3 标准曲线绘制 准确称取γ氨基丁酸16.3mg，丙氨酸15.9mg，谷氨酸16.0mg，牛磺酸16.1mg，分别用水定容至10ml，制成对照品溶液。分别吸取上述4种对照品液1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0μl，点于硅胶G板上，按2.2项展开、显色；在λS＝500nm，λR＝700nm条件下，进行反射法双波长锯齿扫描。以所得的斑点峰面积积分值对点样量回归，得各自方程：
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γ-氨基丁酸：Y＝9.6X-2.32，r＝0.999；
丙氨酸：Y＝14.54X-6.3，r＝0.9999；
谷氨酸：Y＝6.9X+14.60，r＝0.9992；
牛磺酸：Y＝7.35X-2.83，r＝0.9995。
2.4 稳定性试验 分别吸取上述各对照溶液2μl，点样，展开，显色，每隔一定时间扫描测定一次。结果各氨基酸在3h内均稳定性良好，RSD值分别是γ-氨基丁酸1.99%，丙氨酸1.02%，谷氨酸1.08%，牛磺酸1.58%。分别吸取4种氨基酸对照品液，各在两块薄板上点样，依法测定。测得同板和异板RSD分别为0.15%，0.21%。
2.5 回收率测定 取小白鼠的脑组织适量，平均分成2份，其中1份中准确加入一定量氨基酸对照品，平行进行蛋白质沉淀，吸取上清液，点样，展开，显色，扫描测定，计算得各氨基酸的提取回收率。结果γ-氨基丁酸、丙氨酸、谷氨酸和牛磺酸的平均回收率分别为100.7%，101.1%，100.5%和100.4%，RSD分别为1.05%，2.25%，1.29%和1.08%。
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2.6 样品含量测定 在硅胶G板上依次点混合标准液3μl，样品液20μl，混合标准液4μl，按上述方法展开，显色，扫描测定。
结果测得10个样品中γ-氨基丁酸、丙氨酸、谷氨酸和牛磺酸的平均含量为(μg/g)分别为113.5，168.2，1591.7，1323.6，RSD分别为2.24%，1.43%，2.68%，1.47%。
3 讨论
①实验中曾选用苯酚-甲酸-水(22∶2∶1)和苯酚-甲酸-水(22∶4∶1)两种展开系统，拖尾较严重。改用苯酚-甲酸-水(18∶2∶1)，上行展开一次，各氨基酸尚不能很好地分开，上行展开两次，则能很好地把γ-氨基丁酸、丙氨酸、谷氨酸和牛磺酸分离开，斑点清晰、圆整、不拖尾。
②本实验受环境湿度的影响大，湿度大于70%会造成斑点扩散，不圆整，不清晰。
参考文献
〔1〕 大连轻工业学校，华南理工大学等合编.食品分析.北京：中国轻工业出版社，1995：214～245
〔2〕 周曦，赵天睿，南国华.小白鼠脑内某些递质氨基酸的单相纸层析法分离和定量.江西医学院学报，1995，25(2，3)：17
〔3〕 冯冰虹，罗健.绞股蓝皂苷XLⅢ对小白鼠脑内谷氨酸和γ-氨基丁酸的影响.中国药理学通报，1998，14(3)：234
(收稿：2000-02-25), http://www.100md.com
单位：邓康 罗健(广东宏远集团生物化学制药厂 广州 510021)
关键词：TLC；γ-氨基丁酸；丙氨酸；谷氨酸；牛磺酸
西北药学杂志000404 摘要 用双波长薄层扫描法测定小白鼠脑内的γ-氨基丁酸、丙氨酸、谷氨酸和牛磺酸四种神经递质的含量，测定波长为λS＝500nm，λR＝700nm，展开剂为苯酚-甲酸-水(18∶2∶1)，显色剂为1%茚三酮乙醇液；75℃～80℃烘干，结果斑点分离清晰，Rf值适中。四种成分的回收率分别为100.7%(γ-氨基丁酸)，101.1%(丙氨酸)，100.5%(谷氨酸)，100.4%(牛磺酸)。
中图分类号：R917 文献标识码：A
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，是生物体不可缺少的营养成分之一。检测氨基酸可用氨基酸自动分析仪、高效液相层析法等技术〔1〕，灵敏度高，快速准确，但设备昂贵。本文采用TLC法测定小白鼠脑内四种神经递质的含量〔2，3〕。
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1 仪器与试药
1.1 仪器 薄层扫描仪(CS-910型，日本岛津公司)；薄层自动铺板器(重庆南岸新力实验电器厂)。
1.2 试药 硅胶G(薄层层析用，青岛海洋化工厂)；硅胶G预制板(薄层层析用，浙江省台州市四青生化材料厂)；γ-氨基丁酸、丙氨酸、谷氨酸、牛磺酸对照品(中国药品生物制品检定所)。
2 方法与结果
2.1 样品液的制备及对照品液的配制 取健康小白鼠脑组织液，进行蛋白质沉淀，上清液作为样品液。
另准确称取γ-氨基丁酸74.7mg，丙氨酸68.0mg，谷氨酸74.0mg，牛磺酸87.3mg，加水溶解定容于10ml量瓶；再准确吸取溶液2ml，加3ml水后再加甲醇定容成10ml，制成对照品混合溶液。
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2.2 薄层层析条件及结果 把样品液、标准对照液点于硅胶G上，用苯酚-甲酸-水(18∶2∶1)展开2次(第一次展后晾干再二次展开)，晾干(挥干)后，于烘箱烘干(低于80℃)；喷以1%茚三酮乙醇液显色，斑点显紫红色，结果如图1。
图1 脑内递质样品(Ⅰ)及对照液(Ⅱ)TLC谱图
a-γ-氨基丁酸 b-丙氨酸 c-谷氨酸 d-牛磺酸
2.3 标准曲线绘制 准确称取γ氨基丁酸16.3mg，丙氨酸15.9mg，谷氨酸16.0mg，牛磺酸16.1mg，分别用水定容至10ml，制成对照品溶液。分别吸取上述4种对照品液1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0μl，点于硅胶G板上，按2.2项展开、显色；在λS＝500nm，λR＝700nm条件下，进行反射法双波长锯齿扫描。以所得的斑点峰面积积分值对点样量回归，得各自方程：
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γ-氨基丁酸：Y＝9.6X-2.32，r＝0.999；
丙氨酸：Y＝14.54X-6.3，r＝0.9999；
谷氨酸：Y＝6.9X+14.60，r＝0.9992；
牛磺酸：Y＝7.35X-2.83，r＝0.9995。
2.4 稳定性试验 分别吸取上述各对照溶液2μl，点样，展开，显色，每隔一定时间扫描测定一次。结果各氨基酸在3h内均稳定性良好，RSD值分别是γ-氨基丁酸1.99%，丙氨酸1.02%，谷氨酸1.08%，牛磺酸1.58%。分别吸取4种氨基酸对照品液，各在两块薄板上点样，依法测定。测得同板和异板RSD分别为0.15%，0.21%。
2.5 回收率测定 取小白鼠的脑组织适量，平均分成2份，其中1份中准确加入一定量氨基酸对照品，平行进行蛋白质沉淀，吸取上清液，点样，展开，显色，扫描测定，计算得各氨基酸的提取回收率。结果γ-氨基丁酸、丙氨酸、谷氨酸和牛磺酸的平均回收率分别为100.7%，101.1%，100.5%和100.4%，RSD分别为1.05%，2.25%，1.29%和1.08%。
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2.6 样品含量测定 在硅胶G板上依次点混合标准液3μl，样品液20μl，混合标准液4μl，按上述方法展开，显色，扫描测定。
结果测得10个样品中γ-氨基丁酸、丙氨酸、谷氨酸和牛磺酸的平均含量为(μg/g)分别为113.5，168.2，1591.7，1323.6，RSD分别为2.24%，1.43%，2.68%，1.47%。
3 讨论
①实验中曾选用苯酚-甲酸-水(22∶2∶1)和苯酚-甲酸-水(22∶4∶1)两种展开系统，拖尾较严重。改用苯酚-甲酸-水(18∶2∶1)，上行展开一次，各氨基酸尚不能很好地分开，上行展开两次，则能很好地把γ-氨基丁酸、丙氨酸、谷氨酸和牛磺酸分离开，斑点清晰、圆整、不拖尾。
②本实验受环境湿度的影响大，湿度大于70%会造成斑点扩散，不圆整，不清晰。
参考文献
〔1〕 大连轻工业学校，华南理工大学等合编.食品分析.北京：中国轻工业出版社，1995：214～245
〔2〕 周曦，赵天睿，南国华.小白鼠脑内某些递质氨基酸的单相纸层析法分离和定量.江西医学院学报，1995，25(2，3)：17
〔3〕 冯冰虹，罗健.绞股蓝皂苷XLⅢ对小白鼠脑内谷氨酸和γ-氨基丁酸的影响.中国药理学通报，1998，14(3)：234
(收稿：2000-02-25), http://www.100md.com