RT-PCR半定量法检测人脐静脉内皮细胞t-PA和PAI-1 mRNA表达
作者：黄春 陈晓春 蓝玉福
单位：福建医科大学附属协和医院，福建省老年医学研究所(福州 350001)
关键词：逆转录-聚合酶链式反应；基因表达；纤溶酶原激活物，组织型；纤溶酶原灭活剂
福建医科大学学报990310 目的 建立一种敏感的检测组织型纤溶酶原激活物(t-PA)及其抑制剂(PAI-1)基因表达的方法。 方法 用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA，用单管RT-PCR法逆转录-扩增t-PA、PAI-1和内参照三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA，扩增产物经电泳分离后,用凝胶图像分析仪照相和扫描分析,测定各条带分子量和光密度值。 结果 PCR产物均与预期长度相吻合，且PCR产物量与扩增初始模板量之间存在良好的量-效关系。 结论 本实验建立的单管RT-PCR半定量法是检测t-PA、PAI-1 mRNA表达的有效手段,具有灵敏、快速、简便、可靠等优点。
, 百拇医药
A Semi-quantitation RT-PCR Method to Examine t-PA and PAI-1 mRNA Expression in Human Umbilical Vein Endothelial Cells
Huang Chun， Chen Xiaochun， Lan Yufu
(Fujian Institute of Geriatrics， The Affiliated Union Hospital,Fujian Medical University， Fuzhou， 350001)
Objective To establish a sensitive method to examine tissue-type plasminogen activator(t-PA) and plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1) mRNA expression in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs). Methods Total cellular RNA was isolated with a single extraction with acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform(AGPC) mixture. A one-tube coupled reverse transcription/polymerase chain reaction method(RT-PCR) was used to amplify successfully t-PA,PAI-1 and internal control glyceradehyde phosphate dehydrogenase(GAPDH) mRNA with respective primers. PCR products were separated on 2% agarose gels. With digital imaging and analysis systems, gels were photographed and scanned，then the molecular weight of each band was calculated and the integrated density value(IDV) determined. Results The size of PCR products was as long as respected,and there was a dose-dependent manner between the amounts of RT-PCR products and RNA doses. Conclusion We have established a reliable semi-quantitation one-tube RT-PCR method to examine the expression of t-PA and PAI-1 mRNA in HUVECs.
, 百拇医药
Key words reverse transcription polymerase chain reaction; gene expression; tissue type plasminogen activator genetics; plasminogen activator inhibitor 1 genetics
组织型纤溶酶原激活物(t-PA)及其抑制剂(PAI-1)是血浆纤溶活性的一对重要调节因子，两者比例下降在动脉粥样硬化及其血栓并发症的发生发展过程中起重要作用。为进一步探讨其调控机制，有必要建立一种灵敏、简捷、特异的半定量检测t-PA和PAI-1 mRNA表达的方法。 RT-PCR法是近年来发展起来的探讨基因转录水平的有效手段，本实验结合相关的计算机技术，将其应用于t-PA、PAI-1基因表达的半定量检测，建立灵敏、快速、可靠的半定量检测t-PA、PAI-1 mRNA表达的方法。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的分离培养与鉴定 参照Jaffe[1]的方法，无菌条件下取足月顺产新生儿脐带4～6条(长25～30 cm)。用胰蛋白酶消化法收集HUVECs，用含20%胎牛血清的IMDM培养液进行培养(在37℃，5%CO2条件下)；细胞长至单层融合时，用胰蛋白酶/EDTA混合消化液(终浓度分别为0.1%和0.01%)消化，按1∶2传代，第三代细胞长至单层融合后用于实验。原代及传代EC均用抗第八因子相关抗原(FⅧR)血清(购自福州迈新公司)进行免疫细胞化学染色鉴定。
1.2 细胞总RNA的提取 单层融合细胞用PBS洗2次，用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA(RNA提取液购自美国GIBCOBRL生物技术公司)：苯酚和异硫氰酸胍的单相溶液裂解细胞→氯仿抽提→异丙醇沉淀→75%乙醇洗涤→超净台上通风干燥→无RNA酶的灭菌双蒸水重溶 RNA；用紫外分光光度计测定总RNA浓度[RNA浓度(μg/ml)=OD260×稀释倍数×40(μg/ml)]和纯度；用1%琼脂糖甲醛变性电泳鉴定总RNA的质量[2]。
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1. 3 目的片断的扩增
1.3.1 引物的设计与合成 根据t-PA[3]、PAI-1[4]、三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)[5]的cDNA序列，分别设计三对引物，其核苷酸序列见表1。引物由上海生工生物工程公司合成，用DEPC处理的双蒸水溶解，配制成终浓度为 20 μmol/L的溶液备用。
表1 t-PA、PAI-1和GAPDH的引物序列、扩增产物的预期长度和退火温度 目的基因
引物序列(5'-3')
产物长度(bp)
退火温度TA(℃)
t-PA
, 百拇医药
上游
CTG CAG CTG AAA TCG GAT TCG T
368
58
下游
CTG ATG ATG CCC ACC AAA GTC
PAI-1
上游
CGG AGC ACG GTC AAG CAA GTG
401
55
, 百拇医药 下游
GTT GAG GGC AGA GAG AGG CGC
GAPDH
上游
CCA TGG AGA AGG CTG GGG
195
55
下游
CAA AGT TGT CAT GGA TGA CC
t-PA：组织型纤溶酶原激活物； PAI-1:t-PA抑制剂； GAPDH：三磷酸甘油醛脱氢酶.
1.3.2 单管RT-PCR反应(表2)[6] 单管RT-PCR试剂盒购自德国宝灵曼公司构建反应体系于0.2 ml PCR反应管中，总体积50 μl，充分混匀。在PCR仪(2400型，美国PE公司)上50℃逆转录30 min，94℃预变性2 min后，直接进行PCR反应：(94℃ 30 s→TA 30 s→68℃ 45 s)×30cycles ；最后68℃延伸7 min。
, 百拇医药
表2 RT-PCR的反应体系 组 分
体积(μl)
终浓度
dNTPs(各10 mmol/L)
1
各 0.2 mmol/L
上游引物(20 μmol/L)
1
0.4 μmol/L
下游引物(20 μmol/L)
1
0.4 μmol/L
, 百拇医药
总RNA
x
0.1～0.3 μg
DTT(100 mmol/L)
2.5
5 mmol/L
RNA酶抑制剂(40 U/μl)
1
40 U
5×RT-PCR Buffer
10
1.5 mmol/L MgCl2
, 百拇医药
酶混合物
1
加无核酸酶的去离子水至
50
1.4 PCR产物的鉴定和半定量检测 每一反应取PCR产物10 μl，用2%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，凝胶图像分析仪(美国Alpha公司)拍照，以50 bp ladder的DNA分子量标准(德国宝灵曼公司)为参照，计算三个目的片断的分子量，并扫描分析各条带的光密度值(IDV)，用IDV表示各目的基因的扩增产量。
1.5 数据处理 IDV数值用均数±标准差表示。
(1)引物：每一反应管中只加入一对引物，每份RNA样品分别对3个目的片断进行扩增.
(2)模板量：从同一份标本中取0.1，0.2,0.3 μg总RNA，分别对3个目的片断进行扩增，以了解3个目的片断的PCR产量与模板的初始剂量之间的量-效关系.2 结 果
, 百拇医药
用TRIzol试剂提取细胞总RNA，5×105 EC可获得总RNA 3～4 μg；总RNA样本OD260/OD280均在1.8以上，说明纯度较高；总RNA样本经1%琼脂糖甲醛变性电泳分离后，可见28 s和18 s两条清晰的rRNA条带，且18 s与28 s rRNA 荧光强度比值约为1∶2，表明RNA保持较好的分子完整性(图1)。
图1 RNA电泳照片
28 s rRNA:18 s rRNA约为2∶1
t-PA、PAI-1、GAPDH的RT-PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离后，均只有一条带，用凝胶图像分析仪计算其分子量分别为368，401，195 bp，与预期长度相吻合，说明三者均为特异性扩增片断(图2)。
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图2 t-PA,PAI-1,GAPDH的特异性扩增条带
(扩增产物分子量大小分别为368,401,195 bp)
M: marker; t:t-PA; P: PAI-1; G: GAPDH
于同一份标本中取0.1,0.2,0.3 μg 总RNA分别对3个目的片断进行扩增,发现随各目的基因模板含量的增加，扩增产量也成比例增加，具有明显的量-效关系(图3)。
图3 PCR扩增产量与总RNA量之间的剂量-效应关系
上图 电泳照片 1,4,7:总RNA量0.1 μg； 2，5，8:0.2 μg； 3，6，9:0.3 μg； 1～3:t-PA; 4～6:PAI-1; 7～9:GAPDH.
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下图 量-效关系曲线 ○:t-PA; □:PAI-1; △:GAPDH.
3 讨 论
t-PA/PAI-1是血浆纤溶活性的一对重要调节因子，两者均主要由EC合成、分泌。PAI-1是一种急相反应物，其合成和分泌受脂多糖(LPS)、白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和凝血酶等多种物质的影响[7,8]。原代培养人脐静脉内皮细胞中混有许多血细胞，其中单核、巨噬细胞能产生IL-1和TNF-α，激活EC，刺激PAI-1的分泌，传1～2代后单核、巨噬细胞基本除去；而高代EC的纤溶特性可能发生变化。因此，生长稳定的第3代(即传代的第2代)EC是研究纤溶调节机制较合适的模型。
总RNA的抽提是分子生物学研究中最常用的方法之一。本研究用TRIzol总RNA提取液提取细胞总RNA，具有快速、高产出、纯度高、完整性好等优点，尤其适用于细胞数少、样本含量大的情况。
, 百拇医药
将mRNA逆转录成cDNA是本实验的关键步骤，在逆转录时可选用的引物有3种，即PCR引物中的反向引物、随机引物和oligo(dT)。本实验选用反向引物，使mRNA转录成cDNA的反应更具有特异性。
mRNA的测定是分子生物学研究中一个常用的方法，传统的方法主要有斑点杂交、Northern Blot等几种方法。但是由于mRNA含量少，且在转膜等操作过程中极易降解，因此近年来发展了RNA-protective assay和含内标化的RT-PCR半定量检测mRNA的方法。RNA-protective assay虽然灵敏、准确，但操作复杂、价格昂贵、不易普及。含内标化的RT-PCR半定量检测简便、快速并能半定量。本实验用单管RT-PCR法成功扩增了t-PA、PAI-1及内参照GAPDH mRNA，并发现PCR产物量与扩增初始模板量之间存在良好的量-效关系，证实了该实验方法的可靠性。
本实验所用的每对引物所扩增的序列均至少跨越两个外显子，可排除基因组DNA的污染。作为内参照的三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是一种细胞内代谢酶，其基因属保守性强的“管家基因”，GAPDH mRNA具有普遍而恒定表达的特性[9]，设立内参照可减少因加样不准或RNA定量时产生的误差。将逆转录与PCR放在同一管、同一体系中进行，减少了反复加样造成的污染和人为误差。同时，由于逆转录产生的目的基因cDNA全部进入PCR反应，增加了反应的灵敏度，减少了实验的细胞用量，可避免为获得大量细胞进行多次传代而造成细胞形态和生物学性状的改变。
, 百拇医药
RT-PCR半定量法是目前探讨基因转录水平的有效手段，与传统的Northern Blot法比较，它具有灵敏、简捷、特异性高等优点。本实验建立了检测EC t-PA、PAI-1 mRNA表达的半定量RT-PCR法，为纤溶调节机制的研究提供了重要的手段。
福建省卫生厅科研基金资助课题(97030)
参考文献
1 Jaffe EA,Nachman RL,Becker CG,et al. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest, 1973;52:2745
2 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987;162:156
, 百拇医药
3 Pennica D, Holmes WE, Kohr WJ,et al. Cloning and expression of human tissue-type plasminogen activator cDNA in E.Coli. Nature, 1983;201:214
4 Ginsburg D,Zeheb R,Yang A,et al. CDNA cloning of human plasminogen activator-inhibitor from endothelial cells. J Clin Invest, 1986;78:1673
5 Yun JT,Sun XH,Kao TH,et al. Isolation and characterization of rat and human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase cDNAs:genomic complexity and molecular evolution of the gene. Nucleic Acids Res, 1985;13:2485
, 百拇医药
6 Myers TW,Gelfand DH. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochemistry, 1991;30:7661
7 David D,Thomas Q. Thrombin regulation of mRNA levels of tissue plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor-1 in culture human umbilical vein endothelial cells. Blood, 1989;74:222
8 Emeis JJ,Kooistra T. Interleukin 1 and lipopolysaccharide induce an inhibitor of tissue-type plasminogen activator in vivo and in cultured endothelial cells.J Exp Med, 1986;163:1260
9 Siebert PD,Larrick JW. Competitive PCR. Nature， 1992；359：557
(收稿：1999-06-25 修回：1999-08-25), 百拇医药
单位：福建医科大学附属协和医院，福建省老年医学研究所(福州 350001)
关键词：逆转录-聚合酶链式反应；基因表达；纤溶酶原激活物，组织型；纤溶酶原灭活剂
福建医科大学学报990310 目的 建立一种敏感的检测组织型纤溶酶原激活物(t-PA)及其抑制剂(PAI-1)基因表达的方法。 方法 用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA，用单管RT-PCR法逆转录-扩增t-PA、PAI-1和内参照三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA，扩增产物经电泳分离后,用凝胶图像分析仪照相和扫描分析,测定各条带分子量和光密度值。 结果 PCR产物均与预期长度相吻合，且PCR产物量与扩增初始模板量之间存在良好的量-效关系。 结论 本实验建立的单管RT-PCR半定量法是检测t-PA、PAI-1 mRNA表达的有效手段,具有灵敏、快速、简便、可靠等优点。
, 百拇医药
A Semi-quantitation RT-PCR Method to Examine t-PA and PAI-1 mRNA Expression in Human Umbilical Vein Endothelial Cells
Huang Chun， Chen Xiaochun， Lan Yufu
(Fujian Institute of Geriatrics， The Affiliated Union Hospital,Fujian Medical University， Fuzhou， 350001)
Objective To establish a sensitive method to examine tissue-type plasminogen activator(t-PA) and plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1) mRNA expression in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs). Methods Total cellular RNA was isolated with a single extraction with acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform(AGPC) mixture. A one-tube coupled reverse transcription/polymerase chain reaction method(RT-PCR) was used to amplify successfully t-PA,PAI-1 and internal control glyceradehyde phosphate dehydrogenase(GAPDH) mRNA with respective primers. PCR products were separated on 2% agarose gels. With digital imaging and analysis systems, gels were photographed and scanned，then the molecular weight of each band was calculated and the integrated density value(IDV) determined. Results The size of PCR products was as long as respected,and there was a dose-dependent manner between the amounts of RT-PCR products and RNA doses. Conclusion We have established a reliable semi-quantitation one-tube RT-PCR method to examine the expression of t-PA and PAI-1 mRNA in HUVECs.
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Key words reverse transcription polymerase chain reaction; gene expression; tissue type plasminogen activator genetics; plasminogen activator inhibitor 1 genetics
组织型纤溶酶原激活物(t-PA)及其抑制剂(PAI-1)是血浆纤溶活性的一对重要调节因子，两者比例下降在动脉粥样硬化及其血栓并发症的发生发展过程中起重要作用。为进一步探讨其调控机制，有必要建立一种灵敏、简捷、特异的半定量检测t-PA和PAI-1 mRNA表达的方法。 RT-PCR法是近年来发展起来的探讨基因转录水平的有效手段，本实验结合相关的计算机技术，将其应用于t-PA、PAI-1基因表达的半定量检测，建立灵敏、快速、可靠的半定量检测t-PA、PAI-1 mRNA表达的方法。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的分离培养与鉴定 参照Jaffe[1]的方法，无菌条件下取足月顺产新生儿脐带4～6条(长25～30 cm)。用胰蛋白酶消化法收集HUVECs，用含20%胎牛血清的IMDM培养液进行培养(在37℃，5%CO2条件下)；细胞长至单层融合时，用胰蛋白酶/EDTA混合消化液(终浓度分别为0.1%和0.01%)消化，按1∶2传代，第三代细胞长至单层融合后用于实验。原代及传代EC均用抗第八因子相关抗原(FⅧR)血清(购自福州迈新公司)进行免疫细胞化学染色鉴定。
1.2 细胞总RNA的提取 单层融合细胞用PBS洗2次，用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA(RNA提取液购自美国GIBCOBRL生物技术公司)：苯酚和异硫氰酸胍的单相溶液裂解细胞→氯仿抽提→异丙醇沉淀→75%乙醇洗涤→超净台上通风干燥→无RNA酶的灭菌双蒸水重溶 RNA；用紫外分光光度计测定总RNA浓度[RNA浓度(μg/ml)=OD260×稀释倍数×40(μg/ml)]和纯度；用1%琼脂糖甲醛变性电泳鉴定总RNA的质量[2]。
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1. 3 目的片断的扩增
1.3.1 引物的设计与合成 根据t-PA[3]、PAI-1[4]、三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)[5]的cDNA序列，分别设计三对引物，其核苷酸序列见表1。引物由上海生工生物工程公司合成，用DEPC处理的双蒸水溶解，配制成终浓度为 20 μmol/L的溶液备用。
表1 t-PA、PAI-1和GAPDH的引物序列、扩增产物的预期长度和退火温度 目的基因
引物序列(5'-3')
产物长度(bp)
退火温度TA(℃)
t-PA
, 百拇医药
上游
CTG CAG CTG AAA TCG GAT TCG T
368
58
下游
CTG ATG ATG CCC ACC AAA GTC
PAI-1
上游
CGG AGC ACG GTC AAG CAA GTG
401
55
, 百拇医药 下游
GTT GAG GGC AGA GAG AGG CGC
GAPDH
上游
CCA TGG AGA AGG CTG GGG
195
55
下游
CAA AGT TGT CAT GGA TGA CC
t-PA：组织型纤溶酶原激活物； PAI-1:t-PA抑制剂； GAPDH：三磷酸甘油醛脱氢酶.
1.3.2 单管RT-PCR反应(表2)[6] 单管RT-PCR试剂盒购自德国宝灵曼公司构建反应体系于0.2 ml PCR反应管中，总体积50 μl，充分混匀。在PCR仪(2400型，美国PE公司)上50℃逆转录30 min，94℃预变性2 min后，直接进行PCR反应：(94℃ 30 s→TA 30 s→68℃ 45 s)×30cycles ；最后68℃延伸7 min。
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表2 RT-PCR的反应体系 组 分
体积(μl)
终浓度
dNTPs(各10 mmol/L)
1
各 0.2 mmol/L
上游引物(20 μmol/L)
1
0.4 μmol/L
下游引物(20 μmol/L)
1
0.4 μmol/L
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总RNA
x
0.1～0.3 μg
DTT(100 mmol/L)
2.5
5 mmol/L
RNA酶抑制剂(40 U/μl)
1
40 U
5×RT-PCR Buffer
10
1.5 mmol/L MgCl2
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酶混合物
1
加无核酸酶的去离子水至
50
1.4 PCR产物的鉴定和半定量检测 每一反应取PCR产物10 μl，用2%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，凝胶图像分析仪(美国Alpha公司)拍照，以50 bp ladder的DNA分子量标准(德国宝灵曼公司)为参照，计算三个目的片断的分子量，并扫描分析各条带的光密度值(IDV)，用IDV表示各目的基因的扩增产量。
1.5 数据处理 IDV数值用均数±标准差表示。
(1)引物：每一反应管中只加入一对引物，每份RNA样品分别对3个目的片断进行扩增.
(2)模板量：从同一份标本中取0.1，0.2,0.3 μg总RNA，分别对3个目的片断进行扩增，以了解3个目的片断的PCR产量与模板的初始剂量之间的量-效关系.2 结 果
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用TRIzol试剂提取细胞总RNA，5×105 EC可获得总RNA 3～4 μg；总RNA样本OD260/OD280均在1.8以上，说明纯度较高；总RNA样本经1%琼脂糖甲醛变性电泳分离后，可见28 s和18 s两条清晰的rRNA条带，且18 s与28 s rRNA 荧光强度比值约为1∶2，表明RNA保持较好的分子完整性(图1)。
图1 RNA电泳照片
28 s rRNA:18 s rRNA约为2∶1
t-PA、PAI-1、GAPDH的RT-PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离后，均只有一条带，用凝胶图像分析仪计算其分子量分别为368，401，195 bp，与预期长度相吻合，说明三者均为特异性扩增片断(图2)。
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图2 t-PA,PAI-1,GAPDH的特异性扩增条带
(扩增产物分子量大小分别为368,401,195 bp)
M: marker; t:t-PA; P: PAI-1; G: GAPDH
于同一份标本中取0.1,0.2,0.3 μg 总RNA分别对3个目的片断进行扩增,发现随各目的基因模板含量的增加，扩增产量也成比例增加，具有明显的量-效关系(图3)。
图3 PCR扩增产量与总RNA量之间的剂量-效应关系
上图 电泳照片 1,4,7:总RNA量0.1 μg； 2，5，8:0.2 μg； 3，6，9:0.3 μg； 1～3:t-PA; 4～6:PAI-1; 7～9:GAPDH.
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下图 量-效关系曲线 ○:t-PA; □:PAI-1; △:GAPDH.
3 讨 论
t-PA/PAI-1是血浆纤溶活性的一对重要调节因子，两者均主要由EC合成、分泌。PAI-1是一种急相反应物，其合成和分泌受脂多糖(LPS)、白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和凝血酶等多种物质的影响[7,8]。原代培养人脐静脉内皮细胞中混有许多血细胞，其中单核、巨噬细胞能产生IL-1和TNF-α，激活EC，刺激PAI-1的分泌，传1～2代后单核、巨噬细胞基本除去；而高代EC的纤溶特性可能发生变化。因此，生长稳定的第3代(即传代的第2代)EC是研究纤溶调节机制较合适的模型。
总RNA的抽提是分子生物学研究中最常用的方法之一。本研究用TRIzol总RNA提取液提取细胞总RNA，具有快速、高产出、纯度高、完整性好等优点，尤其适用于细胞数少、样本含量大的情况。
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将mRNA逆转录成cDNA是本实验的关键步骤，在逆转录时可选用的引物有3种，即PCR引物中的反向引物、随机引物和oligo(dT)。本实验选用反向引物，使mRNA转录成cDNA的反应更具有特异性。
mRNA的测定是分子生物学研究中一个常用的方法，传统的方法主要有斑点杂交、Northern Blot等几种方法。但是由于mRNA含量少，且在转膜等操作过程中极易降解，因此近年来发展了RNA-protective assay和含内标化的RT-PCR半定量检测mRNA的方法。RNA-protective assay虽然灵敏、准确，但操作复杂、价格昂贵、不易普及。含内标化的RT-PCR半定量检测简便、快速并能半定量。本实验用单管RT-PCR法成功扩增了t-PA、PAI-1及内参照GAPDH mRNA，并发现PCR产物量与扩增初始模板量之间存在良好的量-效关系，证实了该实验方法的可靠性。
本实验所用的每对引物所扩增的序列均至少跨越两个外显子，可排除基因组DNA的污染。作为内参照的三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是一种细胞内代谢酶，其基因属保守性强的“管家基因”，GAPDH mRNA具有普遍而恒定表达的特性[9]，设立内参照可减少因加样不准或RNA定量时产生的误差。将逆转录与PCR放在同一管、同一体系中进行，减少了反复加样造成的污染和人为误差。同时，由于逆转录产生的目的基因cDNA全部进入PCR反应，增加了反应的灵敏度，减少了实验的细胞用量，可避免为获得大量细胞进行多次传代而造成细胞形态和生物学性状的改变。
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RT-PCR半定量法是目前探讨基因转录水平的有效手段，与传统的Northern Blot法比较，它具有灵敏、简捷、特异性高等优点。本实验建立了检测EC t-PA、PAI-1 mRNA表达的半定量RT-PCR法，为纤溶调节机制的研究提供了重要的手段。
福建省卫生厅科研基金资助课题(97030)
参考文献
1 Jaffe EA,Nachman RL,Becker CG,et al. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest, 1973;52:2745
2 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987;162:156
, 百拇医药
3 Pennica D, Holmes WE, Kohr WJ,et al. Cloning and expression of human tissue-type plasminogen activator cDNA in E.Coli. Nature, 1983;201:214
4 Ginsburg D,Zeheb R,Yang A,et al. CDNA cloning of human plasminogen activator-inhibitor from endothelial cells. J Clin Invest, 1986;78:1673
5 Yun JT,Sun XH,Kao TH,et al. Isolation and characterization of rat and human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase cDNAs:genomic complexity and molecular evolution of the gene. Nucleic Acids Res, 1985;13:2485
, 百拇医药
6 Myers TW,Gelfand DH. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochemistry, 1991;30:7661
7 David D,Thomas Q. Thrombin regulation of mRNA levels of tissue plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor-1 in culture human umbilical vein endothelial cells. Blood, 1989;74:222
8 Emeis JJ,Kooistra T. Interleukin 1 and lipopolysaccharide induce an inhibitor of tissue-type plasminogen activator in vivo and in cultured endothelial cells.J Exp Med, 1986;163:1260
9 Siebert PD,Larrick JW. Competitive PCR. Nature， 1992；359：557
(收稿：1999-06-25 修回：1999-08-25), 百拇医药