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编号:10285033
用RAPD技术评估苍术居群间的亲缘关系
http://www.100md.com 《中草药》 2000年第6期
     作者:任冰如 贺善安 於虹 朱晓琴

    单位:江苏省.中国科学院植物研究所 江苏省植物迁地保护重点实验室 南京 210014

    关键词:苍术;RAPD;居群

    中草药000631摘 要 用 RAPD 方法分析了苍术不同居群间的亲缘关系。选取10个10 碱基的随机引物对苍术的10个居群共83个个体进行扩增,获得100个DNA片断。用 RAPD ista nce 软件计算了不同居群间的 Jaccard 遗传距离,得距离矩阵,分别用单联法、全联法、 类平均法作聚类图,结果表明,该10个居群可划分为3个类群:即类群1,大别山类群(Ta); 类群2,南苍术类群(Wu、Lu、Hu、Xu、Ca、Li);类群3,北苍术类群(Tt、Da、Lao)。在这3 个类群中,南、北苍术之间的遗传距离相对较近,大别山类群与南、北苍术之间的距离则较 远。根据本试验的结果及前人关于苍术精油成分差异的聚类结果,作者认为大别山类群比较 特殊。
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    Evaluating the Relationships Between Populations of Swordlike Atractylodes

    (Atractylodes lancea) by Random Amplified Polymorphic DNA Techn ology

    Ren Bingru, He San'an, Yu Hong and Zhu X iaoqin

    (The Provincial Key laboratory for Plant Ex Situ Conservation of Jiangsu, Chinese Academy of Sciences Nanjing 210014)

    Abstract The relationships between the populations of Atractylodes lancea (Thunb.)DC.were analyzed with the method of rand om amplified polymorphic DNA(RAPD).Choosing 10 primers of 10-base oligonucleot ide to amplify the DNA of A.lancea which have 10 populations an d contain 83 individuals, 100 fragments were obtained. Using RAPD distance soft ware, the Jaccard's distance was caculated and listed in the form of distance's matrix, and from which the dendrograms were drawn using the methods of nearest n eighbor clustering, furthermost neighbor clustering and UPGMA separately.The re sults showed that the 10 populations could be divided into 3 clusters, namely cl uster 1 [Dabieshan (Ta)], cluster 2 [South A.lancea (Wu, Lu , Hu, Xu, Ca, Li)] and cluster 3 [North A.lancea (Tt, Da, Lao )]. Furthermore, among the three clusters the distance between cluster 2 and c luster 3 was obviously nearer than the distance between cluster 2 and cluster 1 or the distance between cluster 3 and cluster 1. According to this result and t hat reported elsewhere by other workers concerning the essential oil components , it was suggested that cluster 1 sho uld be listed alone from the south A.lancea.
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    Key words Atractylodes lancea (Thunb.) DC. RAPD population relationship

    苍术为菊科植物茅苍术 Atractylodes lancea(Thunb.)DC. 和北苍术 A.chinensis (DC.) Koidz.的根茎[1]。茅苍术产于江苏、浙 江、安徽、江西、湖 北、山东,由于生长在分布区的南部,故又称为南苍术;北苍术产于东北、华北及山东、河 南、陕西。南北苍术主要是根据其根茎、叶、花等外部形态及根茎的解剖结构存在的差异而 划分的。但在分类学上,关于南北苍术的等级划分,意见并不一致,刘慎谔[2]把 北苍术定为种;石铸[3]把北苍术并入南苍术 A.lancea;傅舜 谟[ 4]则把北苍术定为南苍术 A.lancea 的变种 A.lancea var.chinensis(Bunge)Koidz.

, 百拇医药     武田[5]等根据苍术根茎中精油的6种主要成分的差异,将苍术分为3种类型,即(Ⅰ )大别山类型,(Ⅱ)湖北-安徽类型和(Ⅲ)茅山类型,并且认为苍术间化学成分的差异主要 是由于遗传变异引起的。

    随机扩增多态性 DNA(RAPD) 是90年代发展起来的一种快速、方便的分析不同个体间遗传差 异的技术,可以直接对基因组 DNA 进行检测,已广泛应用于种内不同居群间亲缘关系的研 究,在种间关系上也显示了一定的潜力[6]。因此作者将 RAPD 技术用于苍术的遗 传变异检测,旨在更深入地了解苍术不同居群间的亲缘关系。

    1 材料与方法

    1.1 材料:苍术10个居群的来源见表1,各种源种植于江苏省.中国科学院植物研究所种 质保存圃,各居群取3~11个个体的叶片分别提取 DNA 作随机扩增。

    表1 苍术材料来源及个体数 名 称
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    来 源

    个体数

    Atractyloddes lancea

    江苏金坛薛埠镇(Xu)

    10

    A.lancea

    江苏溧阳后周乡黄山(Li)

    11

    A.lancea

    湖北随州草店镇(Ca)

    10

    A.lancea
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    安徽黄山新华乡(Hu)

    5

    A.Lancea

    湖北丹江口罗店乡(Lu)

    11

    A.Lancea

    湖北丹江口武当山镇(Wu)

    3

    A.Lancea

    湖北英山桃花冲(大别山)(Ta)

    10

    A.chinensis
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    山东泰安泰山区大津口乡(Tt)

    3

    A.chinensis

    山东青岛崂山林场下官林区(Lao)

    10

    A.chinensis

    河北承德大庙镇大庙村(Da)

    10

    1.2 实验方法:DNA 的提取、随机扩增反应及电泳分离条件、方法如前所述[7]

    1.3 数据分析:根据电泳后获得的 DNA 片断图谱,在同一迁移位置上,重复性的 DNA 扩增条带“有”记为 “1”,“没有”记为“0”。计算 jaccard[8]相似系数:S=n11/(n-n00) ,(n11 为两个体均“有”的片段数目,n为群体总的片段数目, n00为两个体均“没有”的片段数目),遗传距离D=1-S,求出遗传距离矩阵,分别 用单联法(最短距离法)、全联法(最长距离法)和类平均法(UPGMA)构建树系图[9]
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    2 结果与分析

    2.1 DNA扩增结果:用Operon公司的10种10碱基随机引物, 对苍术10个居群的83个 个体进 行扩增,所用引物及其核苷顺序见表2。共扩增出100个片段,其中65个片段是多态的 (占65%),说明苍术群体的遗传变异程度较高。

    图1为引物OPB-11和OPL-17对部分苍术个体扩增的结果。图1(a)可见,片段OPB 11-500 0稳定地出现在 Ta 居群中,其它居群的任何个体均无该位点,类似情形还见于其它引物的 扩增结果,如OPB 08-500 等,说明 Ta 与其它居群有较大的差异。

    图1 引物OPB-11(a)和OPL-17(b)对苍术 部分个体 DNA 扩增的结果

    由图1(b)可以看出,位点OPL 17-800只在 Lu,Ta,Ca,Li,Xu,Hu 这5 个居群中出现,这5 个居群属于南苍术;在 Lao,Da,Tt 这3 个居群均不出现,这3 个居群属于北苍术。
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    2.2 苍术不同居群间的亲缘关系:根据扩增结果进行统计分析,计算两两居群之间 Jacca rd 相似系数,距离系数矩阵见表3。

    表2 用于苍术 DNA 随机扩增的引物及其扩增片断数目 引物

    5′与3′序列

    扩增带数

    多态性带数

    引物

    5′→3′序列

    扩增带 数

    多态性带数

    OPA-16

    AGCCAGCGAA
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    17

    13

    OPB-08

    GTCCACACGG

    15

    1 0

    OPB-01

    GTTTCGCTCC

    12

    10

    OPB-09

    TGGGGGACTC

    9
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    5

    OPB-02

    TGATCCCTGG

    13

    10

    OPB-11

    GTAGACCCGT

    7

    4

    OPB-04

    GGACTGGAGT

    8

    3
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    OPB-19

    ACCCCCGAAG

    8

    4

    OPB-06

    TGCTCTGCCC

    5

    3

    OPL-17

    AGCCTGAGCC

    6

    3

    将距离系数分别用单联法、全联法及类平均法进行运算,得聚类图,见图2(a,b,c)。3种 运算方法所得结果都表明所取苍术10个居群可划分为3个类群:大别山类群(Ta)(类群1);南 苍术类群(Xu、Li、Ca、Hu、Lu、Wu)(类群2);北苍术类群(Tt、Lao、Da)(类群3)。由图2还 可看出,南苍术类群和北苍术类群之间遗传距离较近,而大别山类群与它们两者之间的遗传 距离较远。表3 苍术两两居群间的遗传距离(D) 居群
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    1.Xu

    0.0

    2.Li

    0.169014

    0.0

    3.Tt

    0.273973

    0.257143

    0.0

    4.Lao

    0.250000

    0.278481

    0.216216
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    0.0

    5.Da

    0.233766

    0.263158

    0.222222

    0.155844

    0.0

    6.Ta

    0.453488

    0.464286

    0.475610

    0.438202
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    0.448276

    0.0

    7.Lu

    0.232877

    0.263889

    0.319444

    0.353659

    0.320513

    0.400000

    0.0

    8.Wu

    0.289855
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    0.272727

    0.307692

    0.346667

    0.285714

    0.460526

    0.261538

    0.0

    9.Ca

    0.184211

    0.138889

    0.289474

    0.265060
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    0.250000

    0.425287

    0.272727

    0.328767

    0.0

    10.Hu

    0.202899

    0.208955

    0.294118

    0.333333

    0.273973

    0.443038
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    0.223881

    0.229508

    0.197183

    0.0

    1

    2

    3

    4

    5

    6

    7

    8

    9

, 百拇医药     10

    a-单联法 b-全联法 c-类平均法

    图2 苍术10个居群的RAPD结果用 Jaccard 距离系数所 作的树系图

    3 讨论

    3.1 苍术大别山居群的特殊性:武田[5]等分析了苍 术根茎中的精油成分,根据6 种主要化学成分含量的差异,将苍术分为3种类型,Ⅰ)大别山类型,指湖北大别山地区 的南苍术,Ⅱ)湖北-安徽类型,包括湖北(除大别山)、安徽的南苍术和陕西、河南(除嵩 山)的北苍术,Ⅲ)茅山类型,包括江苏茅山地区的南苍术及江苏北部、河北、山东、河南 嵩山的北苍术。在聚类图上,类群 Ⅱ 首先与类群 Ⅲ 相聚,再与类群 Ⅰ 相聚,而类群 Ⅰ 与前面两者之间的距离较远。
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    本文图1(a)表明,大别山居群具有其它各居群所不具备的 DNA 扩增片断,表3列出了 Ta 与 其它 居群的距离,它们均在 0.4 以上,远远大于其余居群相互之间的距离,3种运算方法所得 聚类图(图2)都更直观地显示了这一点。这一结果与武田[5]的结果明显一致,说明 不论是在精油成分的差异方面还是在 DNA 的差异方面,大别山类群与其它类群之间的距离 都较远。以往的文献报道均侧重于南、北苍术之间的差异,武田的结果和本次研究的结果则 提示了大别山居群的特殊性。

    3.2 南北苍术的相互关系:关于南苍术和北苍术的相互关系及学名的处理问题,以往我国 文献[1,2,10]均作为二个独立的种:Atractylodes lancea (T hunb.) DC.和A.chinensis Koidz.两者的主要区别在于茎中部的叶的 形态差异。石铸[3]对苍术属(A. D C.)标本进行了系统整理 ,认为苍术是一个极大多型性的种,A. chinensis(Bunge)Koidz.与 A. lancea (Thunb.)DC. 实为一物,A.la ncea (Thunb.)DC.就是苍术的合法名称。傅舜谟[4]对苍术进行了化学成分的 分 析比较结果表明,两个类型在所含成分的种类方面没有本质的差异,仅在挥发油的含量方面 , 南苍术要比北苍术高,认为将北苍术定为变种 A.lancea(Thunb.)DC.v ar.chinensis(Bunge)Kitam.较合适。
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    本试验从 DNA 水平上分析了南、北苍术之间的亲缘关系,结果表明,Wu、Lu、Hu、Xu、Ca 、Li、聚为一类,它们均属于南苍术;Tt、Da、Lao 聚为一类,它们均属于北苍术,这一结 果与以往有南、北苍术之分的观点一致,但南北苍术之间的差异较小,将南、北苍术定为两 个种显然是不妥的,故支持傅舜谟[4]将北苍术定为变种A.lancea(Thunb.)DC.var.chinensis(Bunge.)Kitam.的意见。

    3.3 苍术化学成分的遗传变异特性:武田(Takeda)[11](1996)通过栽培试验认为 ,苍术精油成分的差异主要是由遗传变异引起的,环境因子也有一定的影响。在大别山居群 与其它居群之间的关系上,RAPD 结果与精油成分的结果明显一致,因此又从DNA 水平上证 明了武田[11]的观点,同时也为地道药材的引种栽培提供了分子水平上的依据。

    致谢:RAPDistance 软件由澳大利亚的 Arstrong J.S. Gibbs A.J.,Peakall R . 和 Weiller G. 等通过互联网提供的共享软件包,特此致谢。
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    任冰如 女,1991年毕业于南京农业大学植物生理生化专业,获硕士学位,现为江苏省.中国科学院植物研究所助理研究员,主要从事植物资源的研究与利用。

    参 考 文 献

    1,中国医学科学院药物研究所.中药志(第1册).北京:人民卫生出版社 ,1979:152

    2,刘慎谔,等.东北植物检索表.北京:科学出版社,1959:410

    3,石 铸.植物分类学报,1981,19(3):318

    4,傅舜谟,等.植物分类学报,1981,19(2):195

    5,武田修己,等.Natural Med,1996,50(4):289
, 百拇医药
    6,汪小全,等.植物学报,1996,38(12):954

    7,任冰如,等.植物资源与环境,1997,6(4):1

    8,Jaccard P.New Pheologist,1912,11:37

    9,钟 扬,等.数量分类的方法与程序.武汉:武汉大学出版社,1990: 35

    10,中国科学院植物研究所编.中国高等植物图鉴.第4册.北京:科学出版社,19 75:600

    11,Takeda O, et al.Chem Pharm Bull,1996,44(4):832

    (1999-05-24收稿), http://www.100md.com