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编号:10285043
NADH-细胞色素b5还原酶与散发性甲状腺肿的关系
http://www.100md.com 《中国地方病学杂志》 2000年第4期
     作者:黄国良 林芬 高妍

    单位:黄国良(福建医科大学 附属协和医院,福建 福州 350001);林芬 高妍(北京医科大学 第一医院 内分泌科,北京 100034)

    关键词:NADH-细胞色素b5还原酶;甲状腺肿;甲状腺激素;过氧化氢

    中国地方病学杂志000426 [摘要] 目的 探讨NADH-细胞色素b5还原酶(b5R)在散发性甲状腺肿发病中作用。方法 应用荧光分析等技术测定甲状腺b5R活性和H2O2浓度,用b5R抑制剂观察b5R活性变化对H2O2浓度和蛋白结合碘(PBI)形成影响。结果 甲状腺H2O2浓度和PBI形成随b5R活性降低而减少,抑制b5R活性可抑制H2O2和PBI的形成。H2O2酶可明显减少PBI形成,而葡萄糖和葡萄糖氧化酶系统可增加PBI形成。结论 b5R参与甲状腺H2O2生成,b5R活性缺乏在散发性甲状腺肿发病中可能起重要作用。
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    [中图分类号]R581.1 [文献标识码] B

    [文章编号]1000-4955(2000)04-301-03

    Effect of NADH-cytochrome b5 reductase in the pathogenesis of sporadic goiter

    HUANG Guo-liang, LIN Feng,GAO Yan

    (Affiliated Union Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China)

    Abstract: Objective To investigate the effect of NADH-cytochrome b5 reductase (b5R) in the pathogenesis of sporadic goiter.Methods The activity of b5R and the levels of H2O2 in thyroid were measured with potassium ferricyanide as substrate and with the homovanillic acid fluorescence assay,the effect of change of b5R activity on the levels of H2O2 and formation of protein-bound iodine (PBI) were observed by the addition of b5R inhibitor.Results The levels of H2O2 and PBI formation decreased with b5R activity decreasing,inhibition of b5R activity could inhibit generation of H2O2 and PBI formation.Catalase reduced PBI formation and glucose/glucose oxidase system increased PBI formation.Conclusions b5R participates in generation of H2O2,deficient b5R activity may play an important role in pathogenesis of sporadic goiter.
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    Key words:NADH-cytochrome b5 reductase; Sporadic goiter; Thyroid hormone synthesis; Hydrogen peroxide

    散发性甲状腺肿又称非地方性甲状腺肿,其病因与地方性甲状腺肿不同,主要是由于甲状腺内在缺陷导致甲状腺激素合成和分泌障碍所致。甲状腺激素的合成需要碘,也需要过氧化氢(H2O2),H2O2缺乏将导致甲状腺激素合成障碍[1,2]。NADH-细胞色素b5还原酶(b5R)被认为是甲状腺内产生H2O2的主要酶系[3]。因此,b5R在散发性甲状腺肿发病中可能有重要作用。我们应用高香草酸荧光分析等技术直接测定甲状腺H2O2水平和b5R活性,同时建立碘有机化系统,应用b5R抑制剂对氯汞苯甲酸(PCMB)观察b5R活性变化对H2O2水平和蛋白结合碘(PBI)形成的影响,探讨b5R在散发性甲状腺肿发病中作用。
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    1 材料与方法

    1.1 对象 手术治疗的甲状腺腺瘤15例,男性4例,女性11例,平均年龄(34.2±9.2)岁,手术时取其远离腺瘤的正常甲状腺组织。全部病例均经病理证实。

    1.2 b5R活性测定 按Kusakabe法[1],甲状腺匀浆在4℃下经低(3 000 r/min)、中(10 000 r/min)、高(13 000 r/min)速离心分离微粒体。按俞氏方法[4],以高铁氰化钾为底物,NADH为辅酶测定b5R活性。以每min转化1 μmol底物的酶量为1个酶单位。为观察b5R抑制剂PCMB对b5R活性影响,加0.5 mmol/L PCMB预孵育5 min再测b5R活性。

    1.3 H2O2测定 参考Raspe法[5],反应体系中无荧光的高香草酸在H2O2和辣根过氧化物酶存在下转化为有很强荧光的高香草酸衍生物(2,2′-dihydroxy-3,3′-dimethoxybiphenyl-5,5′-diacetic acid)。以已知量H2O2为标准曲线,用RF-5301 PC型荧光分光光度计(日本岛津)测定。
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    1.4 PBI测定 参考Kusakabe法[1]建立碘有机化系统,甲状腺匀浆在含KI、Na131I、NaCl、磷酸盐缓冲液等,pH 7.4的碘有机化系统37℃孵育2h,加20%三氯醋酸终止碘化反应,离心测沉淀物PBI放射性脉冲,加0.5 mmol/L PCMB或0.01% H2O2酶或加1 mmol/L NaN3及葡萄糖和葡萄糖氧化酶系统观察对PBI形成的影响。结果以pmol/mg组织表示。

    1.5 H2O2酶测定 H2O2酶测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供,以每mg组织中H2O2酶每min分解吸光度为0.50的H2O2相对量为1个单位。蛋白质定量采用改进的Lowry(1951)法。
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    1.6 统计学分析方法 2组间均数比较用非配对t检验,2个变量间关系用直线相关分析,结果用±s表示。

    2 结果

    2.1 b5R活性和甲状腺H2O2及PBI形成关系 正常甲状腺b5R活性和H2O2水平分别为(252.7±46.2) U/g组织和(0.62±0.11) nmol.min-1.mg-1蛋白质,在碘有机化系统形成的PBI为(15.6±1.8) pmol/mg组织,加b5R抑制剂PCMB后,b5R活性下降至(32.7±6.2) U/g组织,明显降低(P<0.05),降低87%;同时H2O2水平也明显降低,降至(0.29±0.05) nmol.min-1.mg-1蛋白质,下降53.2%(P<0.05);随H2O2降低,PBI亦从(15.6±1.8) pmol/mg组织降至(7.6±0.8) pmol/mg组织,减少51.3%(P<0.05)。表明H2O2水平随b5R活性降低而下降,而PBI形成则随H2O2水平下降而减少。但甲状腺H2O2酶活性加PCMB前为(9.80±2.76) U/g组织,加PCMB后为(9.52±2.37) U/g组织,二者无明显改变(P>0.05)。
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    2.2 H2O2对碘有机化影响 在碘有机化系统,正常甲状腺形成的PBI为(15.6±1.8) pmol/mg组织,加H2O2酶后,H2O2水平从(0.62±0.1) nmol.min-1.mg-1蛋白质迅速降至(0.11±0.04) nmol.min-1.mg-1蛋白质,降低82.3%(P<0.05),随H2O2降低,PBI的形成亦明显下降,降至(3.0±0.4) pmol/mg组织,下降80.6%(P<0.05)。再加NaN3及葡萄糖和葡萄糖氧化酶系统则H2O2水平升到(0.79±0.15) nmol.min-1.mg-1蛋白质,PBI也上升至(17.2±2.1) pmol/mg组织,恢复到正常水平。
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    2.3 b5R活性与H2O2水平和PBI相关性 将未加H2O2酶及葡萄糖和葡萄糖氧化酶系统的甲状腺b5R与H2O2水平及PBI进行相关分析,结果b5R活性与H2O2水平及PBI均呈显著正相关关系(r分别为0.7217、0.6274,P<0.05)。

    3 讨论

    缺碘为地方性甲状腺肿的主要病因,这已被人们所接受,而散发性甲状腺肿与地方性甲状腺肿不同,主要是由于甲状腺内在缺陷致甲状腺激素合成和分泌障碍所致。甲状腺激素的生物合成除需要碘外,也需要H2O2,H2O2和碘一样都是甲状腺激素合成所需的重要成份,缺少H2O2即使有足够的碘,其碘离子也不能氧化成活性碘,酪氨酸的碘化和碘化酪氨酸的偶联也无法进行。因此,甲状腺内缺少H2O2,其结果和缺碘相似,都可引起甲状腺激素合成障碍。b5R是甲状腺内产生H2O2的主要酶系[3],b5R活性缺乏将导致H2O2生成不足,甲状腺激素合成障碍。因此,b5R在甲状腺激素生物合成中有重要作用,可能与散发性甲状腺肿有密切关系。
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    为了阐明b5R与H2O2之间关系,我们以高铁氰化钾为底物测定b5R活性,同时应用高香草酸荧光分析技术直接测定H2O2浓度。结果H2O2浓度与b5R活性密切相关,H2O2浓度随b5R活性变化而改变,两者呈同步一致改变。用PCMB抑制b5R活性,即可见H2O2浓度呈同步下降,说明b5R是甲状腺产生b5R的重要酶系。实验也表明PCMB几乎完全抑制b5R活性,但H2O2的产生并未受到完全抑制,这说明甲状腺H2O2的产生可能并非只有b5R单一途径,可能还有其他酶系参与H2O2的生成。PCMB抑制b5R,但并不抑制H2O2酶,这表明PCMB引起H2O2浓度下降并不是非选择性使所有酶失活,而是有选择性抑制b5R的结果。这也说明应用PCMB后H2O2水平变化是由于产生的减少,而非降解增加所致。
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    H2O2在甲状腺激素生物合成中有重要作用,H2O2缺乏将导致碘有机化障碍,甲状腺激素合成不足。在碘有机化系统为观察H2O2浓度变化对PBI形成的影响,应用清除H2O2的H2O2酶及产生H2O2的葡萄糖和葡萄糖氧化酶系统观察对PBI形成的影响。结果应用H2O2酶清除降解H2O2,随H2O2浓度迅速下降,PBI的形成也明显减少;此时加NaN3抑制H2O2酶,再加葡萄糖和葡萄糖氧化酶系统,则H2O2浓度又明显上升,PBI形成也随明显增加。说明H2O2在碘有机化中起重要作用。
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    以上结果表明,b5R是甲状腺内产生H2O2的重要酶系,而H2O2是碘有机化得以正常进行的重要因素,因此b5R在甲状腺激素生物合成中有重要作用。本文资料也表明用PCMB抑制b5R活性,H2O2产生明显减少,PBI的形成亦显著减少,b5R活性变化可直接引起PBI形成的变化。散发性甲状腺肿主要是由于甲状腺激素合成和分泌障碍所致,b5R活性缺乏可引起H2O2生成不足,导致甲状腺激素合成障碍,临床上已发现b5R活性缺乏的病人甲状腺激素合成障碍,表现为甲状腺功能减退和甲状腺肿,而给补充b5R辅酶恢复其活性,则甲状腺激素合成也恢复正常,甲状腺肿亦消退[1]。因此,b5R活性缺乏可能是散发性甲状腺肿重要病因,在散发性甲状腺肿发病中可能起重要作用。
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    [基金来源]福建省医学重点学科资金资助项目(1998223)

    [作者简介]黄国良(1958-),男,副教授,硕士研究生导师,在职博士生。

    参考文献

    [1] Kusakabe T.Deficient cytochrome b5 reductase activity in nontoxic goiter with iodide organification defect[J].Metabolism,1975,24:1103-1113.

    [2] Niepomniszcze H,Targovnik HM,Gluzman BE,et al.Abnormal H2O2 supply in the thyroid of a patient with goiter and iodine organification defect[J].J Clin Endocrinol Metab,1987,65:344-340.
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    [3] U,Ekholm R.Generation of H2O2 in isolated porcine thyroid follicles[J].Endocrinology,1984,115:392-398.

    [4] 俞秀玲,黄长晖,朱忠勇.红细胞内NADH-细胞色素b5还原酶三种测定方法比较[J].中华血液学杂志,1994,15(8):437-438.

    [5] Raspe E,Laurent E,Corvilain B,et al.Control of intracellular Ca++-concentration and the inositol phosphate accumulation in dog thyrocyte primary culture:evident for different kinetics of Ca++-phosphatidylinositol cascade activation and for involvement in the regulation of H2O2 production[J].J Cell Physiol,1991,146:242-250.

    [收稿日期]1999-10-12;[修订日期]2000-01-08, http://www.100md.com