NADPH-细胞色素C还原酶参与Graves病甲状腺过氧化氢生物合成*
作者：黄国良 林芬 高妍
单位：黄国良 林芬(福建医科大学附属协和医院，福建 福州350001)；高妍(北京医科大学第一医院内分泌科，北京 100034)
关键词：过氧化氢；格雷夫斯病；NADH脱氢酶
中国病理生理杂志000725 [摘 要] 目的：探讨NADPH-细胞色素C还原酶(CR)在Graves病甲状腺过氧化氢(H2O2)生物合成中作用。方法：应用高香草酸荧光分析等技术测定Graves病和正常甲状腺H2O2浓度和CR活性，观察CR活性变化对H2O2合成的影响。结果：Graves病甲状腺CR活性和H2O2水平均明显高于正常而H2O2酶活性无改变。加CR抑制剂对氯汞苯甲酸后， Graves病和正常甲状腺CR活性降低84%，同时H2O2水平下降近57%。H2O2水平随CR活性降低而降低，两者呈显著正相关。 结论：CR参与Graves病甲状腺内H2O2生物合成，是甲状腺内H2O2生成的重要途径。
, 百拇医药
[中图分类号] R581.1 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)07-0636-02
[MeSH] Hydrogen peroxide; Graves' disease; NADH dehydrogenase
过氧化氢(H2O2)在甲状腺激素生物合成中起重要作用，碘离子氧化成活性碘、酪氨酸碘化及碘化酪氨酸偶联均需H2O2存在。甲状腺内H2O2生成不足将导致碘有机化障碍，临床表现为甲状腺肿和甲状腺机能减退[1] 。近二十多年人们一直在探讨甲状腺内H2O2生成的生化机制，提出了一些可能产生H2O2的酶系[2，3] ，但仍有争论。本文应用荧光分析等技术探讨NADPH—细胞色素C还原酶(NADPH-cytochrome C reductase, CR)在甲状腺H2O2生物合成中作用。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
一、标本来源
手术治疗的Graves病(Graves’disease, GD)人15例，男性5例，女性10例，年龄(34.2±9.2)岁。另选15例远离腺瘤的正常甲状腺作对照。全部病例均经病理证实。
二、方法
(一) CR活性测定 新鲜甲状腺组织按Omura法[4]在4℃下剪碎、匀浆，10 000×g、105 000×g离心60 min分离微粒体，经酶消化制得含CR而不含NADH-细胞色素b5还原酶的酶液。以细胞色素C为底物，NADPH为辅酶，用752C紫外可见分光光度计在550 nm处测定CR活性。 加0.5 mmol/L对氯汞苯甲酸观察对CR活性影响。
(二)H2O2水平测定 参考Raspe法[5]，甲状腺组织在4℃下剪碎、匀浆、过滤，4 200×g离心15 min。 反应体系由Ⅱ型辣根过氧化物酶0.1 mg/mL，0.44 mmol/L 高香草酸，1 mmol/L NaN3，沉淀悬液150 μL，20 mmol/L Hepes缓冲液组成。置37℃振荡30 min，以已知量的H2O2制作标准曲线， 用RF-5301PC型荧光分光光度计测定。
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(三) H2O2酶活性测定 H2O2酶测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，按试剂盒说明测定。蛋白质定量采用改进的Lowry(1951)法。
三、 统计分析
数据以
±s表示 ，两组间均数比较用非配对t 检验，两变量间关系用直线相关分析。
结 果
一、正常和GD甲状腺CR和H2O2酶活性
用酶总活力表示，正常和GD甲状腺CR活性分别为(64.3±17.4) mU/g组织和(166.1±48.0) mU/g组织， GD甲状腺CR活性明显高于正常(P<0.05) 。 用酶比活性表示， 正常和GD甲状腺CR活性分别为(14.3± 3.4) mU/mg蛋白和(33.4±6.7)mU/mg 蛋白，GD甲状腺CR活性亦明显高于正常(P<0.05)。正常和GD甲状腺H2O2 酶活性分别为(9.80±3.24) U/g组织和(10.05±3.84) U/g组织，两组差异无显著(P>0.05)。
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二、正常和GD甲状腺H2O2水平
正常和GD甲状腺H2O2水平分别为(0.67±0.11) nmol*min-1*mg-1蛋白和(1.32±0.23) nmol*min-1*mg-1蛋白，GD甲状腺H2O2水平明显高于正常(P<0.05) 。加入H2O2酶后正常甲状 腺 H2O2水平降低82.1%，GD甲状腺H2O2 降低83.4%，表明所测得为对H2O2酶敏感的H2O2。
三、CR抑制剂对CR活性和H2O2水平影响
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正常甲状腺加对氯汞苯甲酸后,CR活性从(64.3±17.4) mU/g组织降至(10.8±2.4) mU/g组织，降低82.7%，同时H2O2水平浓度 降低58.2%； GD甲状腺加对氯汞苯甲酸后CR活性从(166.1±48.0) mU/g 组织降至(24.6 ±8.2) mU/g组织，降低85.2%，同时H2O2水平降低56.1%。H2O2 水平随CR活性降低而降低。而H2O2 酶活性无论正常还是GD甲状腺在加对氯汞苯甲酸后均无显著改变。
四、CR活性和H2O2水平相关性
将15例正常和15例GD甲状腺CR活性与H2O2水平进行相关分析，结果呈显著正相关(r=0.7264,P<0.05)。
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讨 论
甲状腺激素的生物合成需要H2O2，缺少H2O2碘离子将无法氧化成活性碘，出现碘有机化障碍，本文结果表明甲状腺内H2O2水平与CR活性密切相关，正常甲状腺对GD相对来说CR活性处较低水平，其H2O2水平亦处较低水平；GD时CR活性明显增高，其H2O2水平亦明显增加。为了证实CR活性和H2O2水平间因果关系，我们用CR抑制剂对氯汞苯甲酸直接观察抑制CR活性后H2O2水平变化，结果无论正常还是GD甲状腺用对氯汞苯甲酸后，CR活性降低的同时，H2O2水平亦同时下降，两者均呈平行一致变化，表明CR是产生H2O2的酶系。但本文资料也表明，甲状腺内H2O2并非单一由CR产生，可能还有其他酶系。
, 百拇医药
H2O2酶是组织中 H2O2 主要降解途径，因此组织中 H2O2的含量与H2O2酶活性密切相关。本文结果表明GD时甲状腺H2O2酶活性并未发生改变，说明GD时H2O2增加是由于生成增加，而非降解减少所致。CR活性增高可能是GD时甲状腺激素生成增多的重要环节，针对甲状腺内产生H2O2 的酶系，抑制H2O2的产生，能达到抑制甲状腺激素合成的目的。对甲状腺内产生 H2O2 酶系的深入研究，可望为甲状腺机能亢进症治疗药物的开发开辟新的领域。
[基金项目] 福建省卫生厅科研基金资助
, 百拇医药
[参 考 文 献]
[1] Niepomniszcze H, Targo Vnik HM,Gluzman BE,et al. Abnormal H2O2 supply in the thyroid of a patient with goiter and iodine organification defect[J].J Clin Endocrinol Metab,1987,65(2):344～348.
[2] Cross AR, Jones OTG. Enzymic mechanisms of superoxide production . Biochem Biophys Acta, 1991,1057(3):281～298.
[3] Bjorkman U, Ekholm R. Generation of H2O2 in isolated porcine thyroid follicles[J].Endocrinology, 1984, 115(1):392～398.
, 百拇医药
[4] Omura T, Takesue S. A new method for simultaneous purification of cytochrome b5 and NADPH-cytochrome C reductase from rat liver microsomes[J]. J Biochem,1970,67(2):249～257.
[5] Raspe E,Laurent E,Corvilain B,et al. Control of the intracellular Ca2+-concentration and the inositol phosphate accumulation in dog thyrocyte primary culture: evident for different kinetics of Ca2+-phosphatidylinositol cascade activation and for involvement in the regulation of H2O2 production[J]. J Cell Physiol,1991,146(2):242～250.
[收稿日期] 2000-03-10
[修回日期] 2000-05-23, http://www.100md.com
单位：黄国良 林芬(福建医科大学附属协和医院，福建 福州350001)；高妍(北京医科大学第一医院内分泌科，北京 100034)
关键词：过氧化氢；格雷夫斯病；NADH脱氢酶
中国病理生理杂志000725 [摘 要] 目的：探讨NADPH-细胞色素C还原酶(CR)在Graves病甲状腺过氧化氢(H2O2)生物合成中作用。方法：应用高香草酸荧光分析等技术测定Graves病和正常甲状腺H2O2浓度和CR活性，观察CR活性变化对H2O2合成的影响。结果：Graves病甲状腺CR活性和H2O2水平均明显高于正常而H2O2酶活性无改变。加CR抑制剂对氯汞苯甲酸后， Graves病和正常甲状腺CR活性降低84%，同时H2O2水平下降近57%。H2O2水平随CR活性降低而降低，两者呈显著正相关。 结论：CR参与Graves病甲状腺内H2O2生物合成，是甲状腺内H2O2生成的重要途径。
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[中图分类号] R581.1 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)07-0636-02
[MeSH] Hydrogen peroxide; Graves' disease; NADH dehydrogenase
过氧化氢(H2O2)在甲状腺激素生物合成中起重要作用，碘离子氧化成活性碘、酪氨酸碘化及碘化酪氨酸偶联均需H2O2存在。甲状腺内H2O2生成不足将导致碘有机化障碍，临床表现为甲状腺肿和甲状腺机能减退[1] 。近二十多年人们一直在探讨甲状腺内H2O2生成的生化机制，提出了一些可能产生H2O2的酶系[2，3] ，但仍有争论。本文应用荧光分析等技术探讨NADPH—细胞色素C还原酶(NADPH-cytochrome C reductase, CR)在甲状腺H2O2生物合成中作用。
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材 料 和 方 法
一、标本来源
手术治疗的Graves病(Graves’disease, GD)人15例，男性5例，女性10例，年龄(34.2±9.2)岁。另选15例远离腺瘤的正常甲状腺作对照。全部病例均经病理证实。
二、方法
(一) CR活性测定 新鲜甲状腺组织按Omura法[4]在4℃下剪碎、匀浆，10 000×g、105 000×g离心60 min分离微粒体，经酶消化制得含CR而不含NADH-细胞色素b5还原酶的酶液。以细胞色素C为底物，NADPH为辅酶，用752C紫外可见分光光度计在550 nm处测定CR活性。 加0.5 mmol/L对氯汞苯甲酸观察对CR活性影响。
(二)H2O2水平测定 参考Raspe法[5]，甲状腺组织在4℃下剪碎、匀浆、过滤，4 200×g离心15 min。 反应体系由Ⅱ型辣根过氧化物酶0.1 mg/mL，0.44 mmol/L 高香草酸，1 mmol/L NaN3，沉淀悬液150 μL，20 mmol/L Hepes缓冲液组成。置37℃振荡30 min，以已知量的H2O2制作标准曲线， 用RF-5301PC型荧光分光光度计测定。
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(三) H2O2酶活性测定 H2O2酶测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，按试剂盒说明测定。蛋白质定量采用改进的Lowry(1951)法。
三、 统计分析
数据以
±s表示 ，两组间均数比较用非配对t 检验，两变量间关系用直线相关分析。结 果
一、正常和GD甲状腺CR和H2O2酶活性
用酶总活力表示，正常和GD甲状腺CR活性分别为(64.3±17.4) mU/g组织和(166.1±48.0) mU/g组织， GD甲状腺CR活性明显高于正常(P<0.05) 。 用酶比活性表示， 正常和GD甲状腺CR活性分别为(14.3± 3.4) mU/mg蛋白和(33.4±6.7)mU/mg 蛋白，GD甲状腺CR活性亦明显高于正常(P<0.05)。正常和GD甲状腺H2O2 酶活性分别为(9.80±3.24) U/g组织和(10.05±3.84) U/g组织，两组差异无显著(P>0.05)。
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二、正常和GD甲状腺H2O2水平
正常和GD甲状腺H2O2水平分别为(0.67±0.11) nmol*min-1*mg-1蛋白和(1.32±0.23) nmol*min-1*mg-1蛋白，GD甲状腺H2O2水平明显高于正常(P<0.05) 。加入H2O2酶后正常甲状 腺 H2O2水平降低82.1%，GD甲状腺H2O2 降低83.4%，表明所测得为对H2O2酶敏感的H2O2。
三、CR抑制剂对CR活性和H2O2水平影响
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正常甲状腺加对氯汞苯甲酸后,CR活性从(64.3±17.4) mU/g组织降至(10.8±2.4) mU/g组织，降低82.7%，同时H2O2水平浓度 降低58.2%； GD甲状腺加对氯汞苯甲酸后CR活性从(166.1±48.0) mU/g 组织降至(24.6 ±8.2) mU/g组织，降低85.2%，同时H2O2水平降低56.1%。H2O2 水平随CR活性降低而降低。而H2O2 酶活性无论正常还是GD甲状腺在加对氯汞苯甲酸后均无显著改变。
四、CR活性和H2O2水平相关性
将15例正常和15例GD甲状腺CR活性与H2O2水平进行相关分析，结果呈显著正相关(r=0.7264,P<0.05)。
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讨 论
甲状腺激素的生物合成需要H2O2，缺少H2O2碘离子将无法氧化成活性碘，出现碘有机化障碍，本文结果表明甲状腺内H2O2水平与CR活性密切相关，正常甲状腺对GD相对来说CR活性处较低水平，其H2O2水平亦处较低水平；GD时CR活性明显增高，其H2O2水平亦明显增加。为了证实CR活性和H2O2水平间因果关系，我们用CR抑制剂对氯汞苯甲酸直接观察抑制CR活性后H2O2水平变化，结果无论正常还是GD甲状腺用对氯汞苯甲酸后，CR活性降低的同时，H2O2水平亦同时下降，两者均呈平行一致变化，表明CR是产生H2O2的酶系。但本文资料也表明，甲状腺内H2O2并非单一由CR产生，可能还有其他酶系。
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H2O2酶是组织中 H2O2 主要降解途径，因此组织中 H2O2的含量与H2O2酶活性密切相关。本文结果表明GD时甲状腺H2O2酶活性并未发生改变，说明GD时H2O2增加是由于生成增加，而非降解减少所致。CR活性增高可能是GD时甲状腺激素生成增多的重要环节，针对甲状腺内产生H2O2 的酶系，抑制H2O2的产生，能达到抑制甲状腺激素合成的目的。对甲状腺内产生 H2O2 酶系的深入研究，可望为甲状腺机能亢进症治疗药物的开发开辟新的领域。
[基金项目] 福建省卫生厅科研基金资助
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[参 考 文 献]
[1] Niepomniszcze H, Targo Vnik HM,Gluzman BE,et al. Abnormal H2O2 supply in the thyroid of a patient with goiter and iodine organification defect[J].J Clin Endocrinol Metab,1987,65(2):344～348.
[2] Cross AR, Jones OTG. Enzymic mechanisms of superoxide production . Biochem Biophys Acta, 1991,1057(3):281～298.
[3] Bjorkman U, Ekholm R. Generation of H2O2 in isolated porcine thyroid follicles[J].Endocrinology, 1984, 115(1):392～398.
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[4] Omura T, Takesue S. A new method for simultaneous purification of cytochrome b5 and NADPH-cytochrome C reductase from rat liver microsomes[J]. J Biochem,1970,67(2):249～257.
[5] Raspe E,Laurent E,Corvilain B,et al. Control of the intracellular Ca2+-concentration and the inositol phosphate accumulation in dog thyrocyte primary culture: evident for different kinetics of Ca2+-phosphatidylinositol cascade activation and for involvement in the regulation of H2O2 production[J]. J Cell Physiol,1991,146(2):242～250.
[收稿日期] 2000-03-10
[修回日期] 2000-05-23, http://www.100md.com