产空泡毒素幽门螺杆菌感染的临床意义
作者：鲁东水 于长青 王缚鲲 罗平 邹全明
单位：鲁东水(第三军医大学临床微生物学教研室，重庆400038)；于长青(第三军医大学临床微生物学教研室，重庆400038)；王缚鲲(第三军医大学临床微生物学教研室，重庆400038)；罗平(第三军医大学临床微生物学教研室，重庆400038)；邹全明(第三军医大学临床微生物学教研室，重庆400038)
关键词：幽门螺杆菌；空泡毒素；细胞培养；酶联免疫吸附试验
细胞与分子免疫学杂志000322
中图号：R378.99 文献标识码：B 文章编号：1007-8738(2000)03-0246-02▲
基金项目：国家“九五”重点攻关课题资助，No.969010154
, 百拇医药
幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡和萎缩性胃炎的重要病因之一，并与胃癌、胃淋巴瘤的发生密切相关，其中人群中的感染率超过50%，目前已被世界卫生组织列为一级致癌因子〔1〕。Hp的致癌因子包括：尿素酶、脂多糖、热休克蛋白、磷脂酶和空泡毒素(vacuolatingcytotoxin，VacA)等。其中VacA蛋白仅有部分菌株产生，可引起上皮细胞出现空泡样变及胃粘膜病变。为了解重庆地区HpVacA+株的感染与不同消化道疾病的关系，我们采用ELISA法和细胞培养法，检测了本校西南医院消化科住院患者HpVacA+株感染的情况。
1 材料和方法
1.1材料Hella细胞与Hp标准产毒株为本室保存。包被用VacA为本室基因工程表达产物。MeM细胞培养液为Gibico公司产品。辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(HRP羊抗人IgG)购自华美公司。酶标仪为Beckman公司产品。
, 百拇医药
1.2方法
1.2.1Hp菌的分离培养取消化病患者的胃粘膜标本48人份，并同时抽取外周血分离Hp菌。首次分离时，采用牛心、脑浸液固体培养基，于微需氧条件下37℃培养48h，做革兰氏染色观察形态，并做尿素酶、氧化酶和过氧化氢酶试验鉴定Hp菌。常规分离血清，置20℃冻存待用。
1.2.2Hp菌VacA的活性检测①分离Hp菌及VacA的收集，参照文献〔2〕进行。②用MeM细胞培养液(含150mL/L小牛血清和100kU/L青、链霉素双抗)，于37℃70mL/LCO2条件下培养Hella细胞，至计算数达108/L以上。加于96孔细胞培养板中，每孔100μL，并加入100μLVacA，于37℃70mL/LCO2条件下培养18～24h。每份样品做倍比稀释(1∶10，1∶20～1∶160)，每个稀释度测定2次。空白对照孔中加入100μLHp液体培养基上清代替Hp菌培养物的超滤上清。于光镜下计数Hella细胞的空泡样变，细胞空泡形成≥50%者判为阳性。
, 百拇医药
1.2.3外周血清中抗VacA抗体的检测采用ELISA夹心法，操作步骤及结果判定均按照文献〔3〕进行。简要过程是：以基因工程制备的VacA蛋白包被酶标板(100mg/L)，依次用牛血清白蛋白封闭，加入Hp感染患者的血清和HRP羊抗人IgG，用OPD显色后，检测A405nm值。结果判定：测试孔A405nm值-空白孔A405nm值/阴性对照孔A405nm值-空白孔A405nm值≥2.1者判为阳性。另将Hp产毒标准株超声粉碎后，以12000×g40℃离心20min。取上清包被作为阳性对照，以VacA稀释液包被作为阴性对照。
2 结果
从48例消化病患者胃粘膜及外周血中，共分离出Hp菌42株。分离菌VacA的活性检测表明，约有62%的菌株可产生VacA；用ELISA法检测抗VacA抗体的阳性率为45.8%。不同疾病患者的标本中分离的Hp产毒株的阳性率及不同Hp菌感染患者标本产生VacA的活性，以及血中抗VacA抗体的滴度均不相同，结果见表1。
, 百拇医药
表1不同疾病患者标本中分离的Hp产毒株 病种
n
分离的
VacA+株
VacA+活性抗
VacA抗体
Hp株
感染率(%)
滴度(
±S)
阳性率(%)
胃溃疡
, 百拇医药
18
16
61
58±10.52
44.4
十二指肠溃疡
12
10
50
32±8.75
58.3
慢性胃炎
8
, 百拇医药
6
12.5(1/8)
20
25.0
胃癌
10
10
80
65±16.36
70.0
3 讨论
本研究证实，Hp菌的培养上清可诱导Hella细胞空泡形成，其产毒素株的阳性率为62%，与Leunk等〔2〕的报道相似。抗VacA抗体的检出，可间接说明不同Hp菌株产生的VacA的活性有差异。消化性溃疡、胃癌患者感染Hp产毒株的阳性率和抗VacA抗体的检出阳性率高于慢性胃炎组(P∨0.01)，提示VacA与较严重的胃粘膜病变有关。
, 百拇医药
VacA是一种相对分子质量(Mr)为87000的蛋白质，由Mr为136000的前体水解而形成。其对胰蛋白酶敏感、不耐热，可引起组织细胞出现空泡和变性环死。Atherton等〔4〕发现，VacA基因有3种不同的信号区和2个不同的中间区(S1a，S1b，Si，m1和m2)，其等位基因有5种重组体(sla/m1，sla/m2，slb/m1，slb/m2和s2/m2)。其中只有s1/m1产生的VacA活性高；而s2/m2株几乎测不到细胞毒性，说明VacA的表达及活性与其基因亚型有关。临床上发现，约有60%Hp可产生VacA，也是由于VacA基因亚型的不同所致。本实验中，抗VacA抗体的阳性率低于Hp菌的感染率，也说明不同基因亚型产生的VacA活性不同，诱发机体产生免疫应答的程度不同所致。Timothy等〔5〕对VacA蛋白的N端氨基酸序列分析发现，VacA与大肠杆菌K+-Na+ATP酶的β链、人K+-Na+ATP酶的α亚单位及人胃K+-Na+ATP酶的α亚单位等离子通道或转运蛋白部分同源。由于胃酸的分泌是由壁细胞H+-K+ATP酶所介导，因此，VacA可能通过作用于壁细胞中的H+-K+ATP酶而影响胃酸的分泌，从而使Hp菌逃避胃酸对其损害，定植于胃粘膜上。另外，细胞膜内外K+-Na+浓度的维持需K+-Na+ATP酶；而K+-Na+浓度的变化又可通过影响细胞中细胞器的毒素系统而导致VacA异常分泌，引起上皮细胞空泡样改变。VacA诱导上皮细胞空泡样改变的机制，可能是干扰了细胞膜内外K+-Na+的正常转运，使膜内外K+-Na+浓度发生异常变化而导致VacA异常释放。
, 百拇医药
VacA在Hp致病性中的作用，尤其是其与消化性溃疡及胃癌的关系已引起众多学者的重视。早期诊断并消除VacA+株感染，可大大降低消化性溃疡和胃癌的发病率。进一步阐明VacA蛋白的结构、功能及其致病机制，对Hp与胃炎、消化性溃疡和胃癌的病因学关系，以及对Hp感染的选择性治疗都将有十分重要的意义。另外，还可研制VacA佐剂疫苗，通过消除Hp感染，治疗消化性溃疡和预防胃癌的发生。■
作者简介:鲁东水，男，36岁，实验师重庆市高滩岩，Tel.(023)68752315
参考文献：
〔1〕 范 学 工 ， 夏 华 向 . 幽 门 螺 杆 菌 感 染 — 基 础 与 临 床 〔M〕 .长 沙 ： 湖 南 科 学 技 术 出 版 社 ， 1997： 7- 37.
〔2〕 leunk RD, Johnson PT, David BC, et al. Cytotoxin activity in broth culture filtrates of Campylobacter pylori〔J〕 . J Med Microbiol, 1988; 26: 93.
, 百拇医药
〔3〕 Easton KA, Brooks CL, Morgan DR, et al. Serology detection of antibodies to Helicobacter pylori in children and adolescents using ELISA〔J〕 . Infect Immun, 1991; 59: 2470- 2475.
〔4〕 Tummuru MKR, Cover TL, Blase MJ. Cloning and expression of a high molecular mass major antigen of Helicobacter pylori: evidence of linkage to cytotoxin production〔J〕 . Infect Immun, 1993; 61: 1799.
〔5〕 Cover TL, Tummuru, MKR, Cao P, et al. Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori〔J〕 . J Biol Chem, 1994; 269: 10566.
, http://www.100md.com
〔6〕 Atherton JC, Ping C, Peek PM, et al. Divergence of genetic sequences for the vacuolating cytotoxin among Helicobacter pylori strains〔J〕 . J Biol Chem, 1996; 270: 17771.
〔7〕 Timothy L, Cover TL, Martin JB, et al. Purification and characterization of the vacuolating toxin from Helicobacter pylori〔J〕 . Am J Biol Chem, 1992; 267:10570- 10575.
收稿日期：1999-08-03
修回日期：1999-10-25, 百拇医药
单位：鲁东水(第三军医大学临床微生物学教研室，重庆400038)；于长青(第三军医大学临床微生物学教研室，重庆400038)；王缚鲲(第三军医大学临床微生物学教研室，重庆400038)；罗平(第三军医大学临床微生物学教研室，重庆400038)；邹全明(第三军医大学临床微生物学教研室，重庆400038)
关键词：幽门螺杆菌；空泡毒素；细胞培养；酶联免疫吸附试验
细胞与分子免疫学杂志000322
中图号：R378.99 文献标识码：B 文章编号：1007-8738(2000)03-0246-02▲
基金项目：国家“九五”重点攻关课题资助，No.969010154
, 百拇医药
幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡和萎缩性胃炎的重要病因之一，并与胃癌、胃淋巴瘤的发生密切相关，其中人群中的感染率超过50%，目前已被世界卫生组织列为一级致癌因子〔1〕。Hp的致癌因子包括：尿素酶、脂多糖、热休克蛋白、磷脂酶和空泡毒素(vacuolatingcytotoxin，VacA)等。其中VacA蛋白仅有部分菌株产生，可引起上皮细胞出现空泡样变及胃粘膜病变。为了解重庆地区HpVacA+株的感染与不同消化道疾病的关系，我们采用ELISA法和细胞培养法，检测了本校西南医院消化科住院患者HpVacA+株感染的情况。
1 材料和方法
1.1材料Hella细胞与Hp标准产毒株为本室保存。包被用VacA为本室基因工程表达产物。MeM细胞培养液为Gibico公司产品。辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(HRP羊抗人IgG)购自华美公司。酶标仪为Beckman公司产品。
, 百拇医药
1.2方法
1.2.1Hp菌的分离培养取消化病患者的胃粘膜标本48人份，并同时抽取外周血分离Hp菌。首次分离时，采用牛心、脑浸液固体培养基，于微需氧条件下37℃培养48h，做革兰氏染色观察形态，并做尿素酶、氧化酶和过氧化氢酶试验鉴定Hp菌。常规分离血清，置20℃冻存待用。
1.2.2Hp菌VacA的活性检测①分离Hp菌及VacA的收集，参照文献〔2〕进行。②用MeM细胞培养液(含150mL/L小牛血清和100kU/L青、链霉素双抗)，于37℃70mL/LCO2条件下培养Hella细胞，至计算数达108/L以上。加于96孔细胞培养板中，每孔100μL，并加入100μLVacA，于37℃70mL/LCO2条件下培养18～24h。每份样品做倍比稀释(1∶10，1∶20～1∶160)，每个稀释度测定2次。空白对照孔中加入100μLHp液体培养基上清代替Hp菌培养物的超滤上清。于光镜下计数Hella细胞的空泡样变，细胞空泡形成≥50%者判为阳性。
, 百拇医药
1.2.3外周血清中抗VacA抗体的检测采用ELISA夹心法，操作步骤及结果判定均按照文献〔3〕进行。简要过程是：以基因工程制备的VacA蛋白包被酶标板(100mg/L)，依次用牛血清白蛋白封闭，加入Hp感染患者的血清和HRP羊抗人IgG，用OPD显色后，检测A405nm值。结果判定：测试孔A405nm值-空白孔A405nm值/阴性对照孔A405nm值-空白孔A405nm值≥2.1者判为阳性。另将Hp产毒标准株超声粉碎后，以12000×g40℃离心20min。取上清包被作为阳性对照，以VacA稀释液包被作为阴性对照。
2 结果
从48例消化病患者胃粘膜及外周血中，共分离出Hp菌42株。分离菌VacA的活性检测表明，约有62%的菌株可产生VacA；用ELISA法检测抗VacA抗体的阳性率为45.8%。不同疾病患者的标本中分离的Hp产毒株的阳性率及不同Hp菌感染患者标本产生VacA的活性，以及血中抗VacA抗体的滴度均不相同，结果见表1。
, 百拇医药
表1不同疾病患者标本中分离的Hp产毒株 病种
n
分离的
VacA+株
VacA+活性抗
VacA抗体
Hp株
感染率(%)
滴度(
±S)阳性率(%)
胃溃疡
, 百拇医药
18
16
61
58±10.52
44.4
十二指肠溃疡
12
10
50
32±8.75
58.3
慢性胃炎
8
, 百拇医药
6
12.5(1/8)
20
25.0
胃癌
10
10
80
65±16.36
70.0
3 讨论
本研究证实，Hp菌的培养上清可诱导Hella细胞空泡形成，其产毒素株的阳性率为62%，与Leunk等〔2〕的报道相似。抗VacA抗体的检出，可间接说明不同Hp菌株产生的VacA的活性有差异。消化性溃疡、胃癌患者感染Hp产毒株的阳性率和抗VacA抗体的检出阳性率高于慢性胃炎组(P∨0.01)，提示VacA与较严重的胃粘膜病变有关。
, 百拇医药
VacA是一种相对分子质量(Mr)为87000的蛋白质，由Mr为136000的前体水解而形成。其对胰蛋白酶敏感、不耐热，可引起组织细胞出现空泡和变性环死。Atherton等〔4〕发现，VacA基因有3种不同的信号区和2个不同的中间区(S1a，S1b，Si，m1和m2)，其等位基因有5种重组体(sla/m1，sla/m2，slb/m1，slb/m2和s2/m2)。其中只有s1/m1产生的VacA活性高；而s2/m2株几乎测不到细胞毒性，说明VacA的表达及活性与其基因亚型有关。临床上发现，约有60%Hp可产生VacA，也是由于VacA基因亚型的不同所致。本实验中，抗VacA抗体的阳性率低于Hp菌的感染率，也说明不同基因亚型产生的VacA活性不同，诱发机体产生免疫应答的程度不同所致。Timothy等〔5〕对VacA蛋白的N端氨基酸序列分析发现，VacA与大肠杆菌K+-Na+ATP酶的β链、人K+-Na+ATP酶的α亚单位及人胃K+-Na+ATP酶的α亚单位等离子通道或转运蛋白部分同源。由于胃酸的分泌是由壁细胞H+-K+ATP酶所介导，因此，VacA可能通过作用于壁细胞中的H+-K+ATP酶而影响胃酸的分泌，从而使Hp菌逃避胃酸对其损害，定植于胃粘膜上。另外，细胞膜内外K+-Na+浓度的维持需K+-Na+ATP酶；而K+-Na+浓度的变化又可通过影响细胞中细胞器的毒素系统而导致VacA异常分泌，引起上皮细胞空泡样改变。VacA诱导上皮细胞空泡样改变的机制，可能是干扰了细胞膜内外K+-Na+的正常转运，使膜内外K+-Na+浓度发生异常变化而导致VacA异常释放。
, 百拇医药
VacA在Hp致病性中的作用，尤其是其与消化性溃疡及胃癌的关系已引起众多学者的重视。早期诊断并消除VacA+株感染，可大大降低消化性溃疡和胃癌的发病率。进一步阐明VacA蛋白的结构、功能及其致病机制，对Hp与胃炎、消化性溃疡和胃癌的病因学关系，以及对Hp感染的选择性治疗都将有十分重要的意义。另外，还可研制VacA佐剂疫苗，通过消除Hp感染，治疗消化性溃疡和预防胃癌的发生。■
作者简介:鲁东水，男，36岁，实验师重庆市高滩岩，Tel.(023)68752315
参考文献：
〔1〕 范 学 工 ， 夏 华 向 . 幽 门 螺 杆 菌 感 染 — 基 础 与 临 床 〔M〕 .长 沙 ： 湖 南 科 学 技 术 出 版 社 ， 1997： 7- 37.
〔2〕 leunk RD, Johnson PT, David BC, et al. Cytotoxin activity in broth culture filtrates of Campylobacter pylori〔J〕 . J Med Microbiol, 1988; 26: 93.
, 百拇医药
〔3〕 Easton KA, Brooks CL, Morgan DR, et al. Serology detection of antibodies to Helicobacter pylori in children and adolescents using ELISA〔J〕 . Infect Immun, 1991; 59: 2470- 2475.
〔4〕 Tummuru MKR, Cover TL, Blase MJ. Cloning and expression of a high molecular mass major antigen of Helicobacter pylori: evidence of linkage to cytotoxin production〔J〕 . Infect Immun, 1993; 61: 1799.
〔5〕 Cover TL, Tummuru, MKR, Cao P, et al. Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori〔J〕 . J Biol Chem, 1994; 269: 10566.
, http://www.100md.com
〔6〕 Atherton JC, Ping C, Peek PM, et al. Divergence of genetic sequences for the vacuolating cytotoxin among Helicobacter pylori strains〔J〕 . J Biol Chem, 1996; 270: 17771.
〔7〕 Timothy L, Cover TL, Martin JB, et al. Purification and characterization of the vacuolating toxin from Helicobacter pylori〔J〕 . Am J Biol Chem, 1992; 267:10570- 10575.
收稿日期：1999-08-03
修回日期：1999-10-25, 百拇医药