IL-2基因修饰对树突状细胞表达细胞因子的影响
作者：孙黎飞 曹雪涛 田野苹 章卫平 张明徽 黄欣 于益芝
单位：孙黎飞 曹雪涛 田野苹 章卫平 明徽 黄欣 于益芝(第二军医大学免疫学教研室 上海 200433)
关键词：白细胞介素2；树突状细胞；基因修饰；细胞因子；趋化因子
中国肿瘤生物治疗杂志000107 摘 要 目的： 观察用白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)基因修饰小鼠骨髓来源的树突状细胞(dendritic cells, DC)后，DC表达细胞因子和趋化因子的变化及DC体内免疫后，小鼠体内主要脏器中IL-2表达情况。探讨其对抗原提呈微环境的改善及其可能的机制。方法:用ELISA方法检测DC培养上清和小鼠血清及脏器中IL-2的含量，用RT-PCR方法检测DC中IL-2,IFN-γ,IL-12,GM-CSF,IL-4,IL-10,TNF-α,IL-1β,MIP-1β,MCP-1,RANTES和IP10等的表达，用FACS分析DC表面IL-2受体的变化。结果： 经IL-2基因修饰后，DC除了分泌高水平的IL-2外，尚能分泌一定水平的IFN-γ和IL-12，其表面表达的IL-2Rα密度增加。RT-PCR分析表明其表达多种细胞因子和趋化因子，用IL-2基因修饰的DC免疫小鼠后，血清和脏器中能检测到高水平的IL-2。结论： IL-2基因修饰DC，能促进DC表达IL-2受体，并以自分泌形式分泌高水平的IL-2，优化其抗原提呈的微环境，提示可增强DC的抗原提呈功能。
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《中国图书资料分类法》分类号 R392.1
Effect of IL-2 Gene Modification on the Cytokine Expression in Dendritic Cells
Sun Lifei, Cao Xuetao, Tian Yieping, Zhang Weiping, Zhang Minghui, Huang Xin, Yu Yizhi
(Department of Immunology, Second Military Medical University, Shanghai 200433)
Abstract Objective: To investigate the effect of IL-2 gene modification on expression of cytokines and chemokines in dendritic cells (DCs) and IL-2 expression in mouse organs after in vivo DC immunization and to determine the improvement of microenvironment of antigen presentation and its potential mechanism. Methods: The IL-2 levels in DC culture, mouse serum and organs after IL-2 gene-modified DC(DC-IL-2) injection in vivo were examined by ELISA. The mRNA expressions of cytokine and chemokines (IL-2, IFN-γ, IL-12, GM-CSF, IL-4, IL-10, TNF-α, IL-1β, MIP-1β, MCP-1, RANTES and IP10) in DC-IL-2 were analyzed by RT-PCR. The expression of IL-2Rα on surface of DC-IL-2 was analyzed by FACS. Results: After IL-2 gene modification, DCs could secret high level of IL-2, IFN-γ and IL-12. The expression of IL-2Rα on the surface of DC-IL-2 was increased. mRNAs of various cytokines and chemokines were detected. The levels of IL-2 increased immediately in mouse serum, lung, spleen and liver after DC-IL-2 injection in vivo. Conclusion: The IL-2 gene modification could enhance the biologic activity of the DCs and the microenvironment of antigen presentation was optimized.
, 百拇医药
Key words interleukin 2; dendritic cells; gene modification; cytokine; chemokines
树突状细胞(dendritic cells, DC)是抗原提呈功能最强的抗原提呈细胞，其在肿瘤治疗中的应用是近年来的热点课题。利用细胞因子基因修饰DC，通过选择性增强DC与T细胞体内的相互作用，优化体内抗原提呈的微环境，是目前肿瘤免疫治疗研究的重要方法之一。本文研究了白细胞素2(inderleukin-2),IL-2基因修饰DC后，DC分泌有关细胞因子的含量和DC表达IL-2受体的变化，探讨IL-2基因修饰对DC生物活性的影响。并用IL-2基因修饰的DC(DC-IL-2)体内免疫小鼠后，观察了IL-2在体内某些脏器中的表达情况，以期了解DC-IL-2在体内这些脏器中的分布情况，以及对这些脏器中免疫细胞能否起到有效激活作用，对其抗原提呈微环境是否有利等提供实验依据。
1 材料与方法
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1.1 主要试剂
小鼠IL-2重组腺病毒Ad-IL-2,LacZ重组腺病毒Ad-LacZ由日本癌症研究会Hamada博士惠赠,病毒滴度分别为3×109,1.9×109 pfu/ml。重组小鼠GM-CSF,IL-4,重组人IL-2购自Sigma公司。小鼠IL-2和IL-12p70 ELISA检测试剂盒购自Endogen公司。Taq 酶为TAKARA公司产品。PCR引物由中科院上海细胞所合成。琼脂糖购自Amecesoc公司。PCR Marker购自华美公司。荧光标记的大鼠抗小鼠Ia和IL-2Rα抗体购自PharMingen公司。
1.2 动物
C57BL/6小鼠(H-2Kb)雌性，6～8周龄，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司。
1.3 IL-2基因修饰的DC 培养上清中细胞因子含量的测定
, 百拇医药
用补体介溶法以大鼠抗小鼠CD4，CD8，B220/CD45R，Ia和FcR单抗加低毒性兔补体溶解阴性选择的骨髓细胞(1×106/ml)，用含10%FCS和重组小鼠GM-CSF(5 ng/ml)加重组小鼠IL-4(1 ng/ml)的RPMI 1640培养基在24孔板中常规制备正常小鼠骨髓来源的DC细胞。培养至第7天，收集悬浮细胞及疏松贴附于巨噬细胞的DC，置于另一培养板中(1×106/ml)，将Ad-mIL-2，Ad-LacZ腺病毒，分别对1×106/ml DC转染4 h，(MOI值＝100)，用Hank's洗涤2次，去除病毒后重悬基因转染过的DC以1×106/ml浓度在DC条件培养液中继续培养48 h，于转染后24,48 h分别收集培养上清，-20℃保存，以ELISA 法检测上清中IL-2,IL-12和IFN-γ的分泌水平。
1.4 相当剂量重组IL-2培养的DC制备
, 百拇医药 我们以往的研究中已证实IL-2基因修饰DC 24 h和48 h，DC的培养上清中IL-2的分泌量分别为3.25 ng/ml和5.0 ng/ml。故将正常培养至第7天的DC，以同等条件在其培养基中加入人重组白细胞介素2(rhIL-2) 5 ng /ml，继续培养24 h后，用Hank's液洗涤2次，按上述方法处理备用。无菌收取rhIL-2培养DC 24 h的上清，-20℃保存备用。
1.5 IL-2基因修饰的DC细胞因子m RNA的表达
1.5.1 实验分组，取上述处理的DC共分5组：(1)培养至第7天的正常DC(N7-DC)；(2)培养至第8天的正常DC(N8-DC)；(3) IL-2基因修饰的DC(DC-IL-2)；(4)LacZ 基因修饰的DC(DC-LacZ)；(5)相当剂量(5 ng/ml)rhIL-2培养的DC(rhIL-2-DC)。
1.5.2 RT-PCR操作步骤，取5组细胞各2×106，以PolyATtrct System 1000(Promega)提得mRNA，OligodT12～18引导下AMV(promega)将其反转录成cDNA后，PCR检测IL-2，IFN-γ，GM-CSF，IL-4，IL-10，TNF-α，IL-12p40，IL-11β，MCP-1，RANTES，MIP-1β和IP10的表达。检测对照基因为β-actin。PCR反应在PE公司9600型DNA扩增仪上完成。反应参数为95℃ 10 s；55℃ 30 s；72℃ 20 s；30个循环，以2%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳分析。所用的PCR引物序列分别为：
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小鼠β-actin: 上游：5'GCT GAG AGG GAA ATC GTG
下游：5'GGG TGT AAA ACG CAG CTC
小鼠IL-2： 上游：5'TCC ACT TCA AGC TCT ACA G
下游：5'GAG TCA AAT CCA GAA CAT GCC
小鼠IFN-γ： 上游：5'CAT GAA AAT CCT GCA GAG CC
下游：5'GGA CAA TCT CTT CCC CAC CC
小鼠IL-10： 上游：5'ACA ACA TAC TGC TAA CCG AC
, http://www.100md.com 下游：5'CAC CTT GGT CTT GGA GCT TA
小鼠TNF-α： 上游：5'GCA GGT CTA CTT TGG AGT CA
下游：5'ACA TTC GAG GCT CCA GTG AA
小鼠IL-12p40： 上游：5'TCA CAG GTG GAG GTC AGC
下游：5'GGC CAA GTG GAA TGC TAG
小鼠IL-1β： 上游：5'TGG ACC TTC CAG GAT GAG
下游：5'TGG GTA TTG CTT GGG ATC
小鼠MCP-1： 上游：5'CAG TAC GAT CCT CAC GAA TG
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下游：5'TGT CCA ATT TCT CAA ACC TG
小鼠RANTES： 上游：5'ATG AAG ATC TCT GCA GCT GC
下游：5'TGA ACC CAC TTC TTC TCT GG
小鼠MIP-1β： 上游：5'CTC TCT CTC CTC TTG CTC GT
下游：5'CAT GTA CTC AGT GAC CCA GG
小鼠IP10： 上游：5'GTC ATT TTC TGC CTC ATC CT
下游：5'GAC CTT TTT TGG CTA AAC G
小鼠GM-CSF： 上游：5'TAA ATG ATA ATT GTT ACC CGG CCT TGG
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下游：5'AAG GAT CCT CAT TTT TGG CTT GGT TTT TTG
小鼠IL-4： 上游：5'ATT ATG CAT ATC CAC GGA TGC GAC AA
下游：5'AAG GAT CCT TAC GAG TAA TCC ATT TGC ATG A
1.6 IL-2基因修饰的DC表面IL-2受体的表达
采用荧光抗体直接标记法，分别对上述正常培养第8天的DC，及经基因修饰的DC和rhIL-2培养的DC，用PE标记的小鼠IL-2Rα和FITC 标记的小鼠Ia单克隆荧光抗体4℃标记1 h，以小鼠血清封闭非特异性荧光染色，无关抗体作阴性对照。流式细胞仪(FACS)进行IL-2Rα和Ia双标记检测DC表面IL-2 Rα密度的几何平均数。
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1.7 用IL-2基因修饰的DC尾静脉注射后小鼠血清和脏器中IL-2含量的变化
将DC-IL-2细胞浓度调整为1×106/ml，每只小鼠尾静脉注射细胞数为1×105/100 μl，共分DC-LacZ和DC-IL-2两组。于注射后第1，3，5，7，10天，每天处死3只小鼠，取血清，并取其肺脏、脾脏和肝脏称重后，剪碎组织，匀浆， 4℃，4 000 r/min，离心30 min，收集上清，-20℃冻存，用ELISA试剂盒检测IL-2水平，以推测IL-2基因修饰的DC在这些器官中的聚集情况。
2 结 果
2.1 IL-2基因修饰的DC 培养上清中细胞因子含量的测定
ELISA检测结果显示，正常DC和LacZ基因修饰的DC培养上清中均未检测到IL-2和IFN-γ，而IL-2基因修饰后培养24 h DC培养上清中可检测到较高的IL-2和IFN-γ；用5 ng /ml rhIL-2培养24 h后的DC培养上清中已不能检测出IL-2的含量，而培养24 h亦能检测出较高的IFN-γ。正常培养第8天的DC培养上清IL-12的含量为18 pg/ml，rIL-2处理和IL-2和LacZ基因修饰均能使IL-12的分泌增高，以IL-2基因修饰的DC培养上清中IL-12的检测值最高，培养24 h达56.2 pg/ml(详见表1)。
, 百拇医药
表1 IL-2基因修饰的 DC培养上清中细胞因子含量(pg/ml)
Tab. 1 Levels of cytokines in the supernatants from IL-2
gene-modified DCs Groups
IL-2
IFN-γ
IL-12
24 h
48 h
24 h
48 h
, 百拇医药 24 h
48 h
Normal-DC
0
0
0
0
18.0
18.0
DC-IL-2
3250.0
5000.0
193.0
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791.2
56.2
78.4
DC-LacZ
0
0
0
190
33.7
38.5
DC-rhIL-2
0
0
, 百拇医药
130.0
276.0
33.2
40.1
2.2 IL-2基因修饰的DC细胞因子和趋化因子mRNA的表达
RT-PCR的结果如表2所示，除IL-2基因修饰的DC表达较高丰度的IL-2 mRNA外，正常条件培养的DC和其他各处理组的DC均未见IL-2 mRNA的表达。结果表明，正常DC并不表达IL-2 mRNA，经IL-2基因修饰后，DC中成功地表达IL-2基因。正常培养7 d的DC 并不表达IFN-γ mRNA。在IL-2基因修饰DC组和rhIL-2培养的DC组均可见到IFN-γ mRNA表达。正常培养第8天DC组和LacZ基因修饰的DC组未见IFN-γ mRNA表达。另外，除MCP-1 mRNA在各组DC中均不表达外，IL-12，GM-CSF，IL-4，IL-10，TNF-α，IL-1β等细胞因子和MIPβ，RANTES，IP10等趋化因子在各组DC中均呈不同程度的表达。
, 百拇医药
2.3 IL-2基因修饰的DC IL-2受体的表达
从图1 的FACS结果可见，正常培养8 d的DC可表达一定量的IL-2Rα，而培养7 d，经IL-2基因修饰24 h后的DC和经相当剂量rIL-2培养的DC面IL-2Rα密度明显增加，LacZ基因修饰的DC则无此现象。
2.4 IL-2基因修饰的DC尾静脉注射后小鼠血清和脏器中IL-2含量变化
DC-IL-2经尾静脉注入小鼠体内后，第1,3天肺脏和脾脏匀浆上清中IL-2含量升高，肝脏中较低。至第5天肺脏和脾脏中IL-2的含量明显降低，肝脏中已测不出IL-2，第10天后，上述脏器中均测不出IL-2。血清中IL-2水平在免疫24 h后迅速升高(612 pg/ml)，第3天最高(732 pg/ml)，第5天开始下降(440 pg/ml)，至第10天已基本降至正常水平(见表3)。表2 IL-2基因修饰的DC中细胞因子和趋化因子mRNA的表达
, 百拇医药
Tab.2 The cytokine and chemokine mRNA expression in IL-2
gene-modified DC analysed by RT-PCR Groups
DC-IL-2
DC-LacZ
DC-rhIL-2
Normal-DC
β-actin
+
+
+
, 百拇医药 +
IL-2
+
-
-
-
IFN-γ
+
-
+
-
IL-12
+
+
, 百拇医药
+
+
GM-CSF
+
+
+
+
IL-4
+
+
+
+
IL-10
+
, 百拇医药
+
+
+
TNF-α
+
+
+
+
IL-1β
+
+
+
+
MIP-1β
, 百拇医药
+
+
+
+
MCP-1
-
-
-
-
RANTES
+
+
+
+
, 百拇医药
IP10
+
+
+
+
图1 IL-2基因修饰的DC表面IL-2Rα的FACS分析结果
Fig. 1 Flowing cytometric analysis for surface expression
of IL-2Rα on DCs modified with IL-2 gene
3 讨 论
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T细胞介导的免疫应答在机体抗肿瘤过程中起着主导作用，T细胞的致敏、活化和增殖依赖于抗原提呈细胞(APC)对抗原的识别和有效提呈。某些恶性肿瘤细胞的免疫原性低下或变异，肿瘤细胞自身又缺乏共刺激信号，导致T细胞的失能，而且在恶性肿瘤生长的同时还能分泌多种免疫抑制因子，如IL-10，TGF-β和VEGF[1]等，对肿瘤局部的淋巴细胞和抗原提呈细胞都有很强的抑制作用，致使肿瘤抗原不能有效被APC提呈给淋巴细胞，这是肿瘤细胞逃逸免疫监视的主要机制之一。因此，如何优化肿瘤抗原提呈的微环境，降低抑制因子的分泌水平，解除对APC和T细胞的抑制作用，更有效地调动机体特异性抗肿瘤免疫应答，成为肿瘤免疫治疗中具有实际意义的研究方向。
表3 注射DC-IL-2后小鼠脏器中IL-2的含量(pg/ml)
Tab. 3 Levels of IL-2 in organs of the mice injected with
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IL-2 gene-modified DC Groups
IL-2 levels
day1
day3
day5
day7
day10
Lung
908
695
333
108
, 百拇医药
0
Spleen
690
998
434
148
0
Liver
612
206
0
0
0
, http://www.100md.com DC是目前已知的体内抗原提呈功能最强的APC，DC表面表达丰富的MHC 分子、共刺激分子、粘附分子，以及DC所分泌的IL-12和趋化因子，在DC介导的抗原提呈过程中，对DC的抗原识别、迁移和激发T细胞增殖等多环节，起着重要的作用[2]。
许多细胞因子参与了DC的成熟和功能的调节[3,4]，其中，IL-2是众多淋巴细胞因子中生物活性比较明确，在机体免疫应答中起关键作用的细胞因子。IL-2不但在激活T淋巴细胞增殖中起着重要作用，而且在B细胞和巨噬细胞活化中亦起着协同作用[5]。近来，有研究提示IL-2对DC的迁移和定向分化都有一定的正向调节作用。IL-2能增加DC的迁移运动，并可调节其它Th1细胞产生促进因子吸引DC到炎症部位[6]。用IL-2或GM-CSF基因修饰的肿瘤细胞瘤苗能促进APC对肿瘤抗原的加工处理，激活CTL前体，增强CTL活化和产生[7]。因此，我们设想将IL-2基因导入DC，在提高其抗原提呈功能的同时分泌IL-2，优化DC对肿瘤抗原提呈的微环境，以期更有效地诱导机体特异性抗肿瘤免疫效应。
, 百拇医药
结果显示，IL-2基因修饰的DC不但能分泌高水平的IL-2，而且还能促进IFN-γ和IL-12的分泌，而LacZ基因修饰的DC和相同条件下以重组IL-2培养的DC则无此显著性作用。用DC-IL-2免疫小鼠后，短时间即在小鼠的肺脏、脾脏和血清内检测到较高浓度的IL-2水平，这或许是DC-IL-2免疫后，载有IL-2基因的DC增加了迁移性，在这些器官的集聚；同时亦不能排除DC-IL-2在体内持续分泌高浓度的IL-2释放入血，活化了这些脏器中的其它免疫细胞(如T淋巴细胞和单核-巨噬细胞)共同分泌IL-2和IFN-γ所起的协同作用。
趋化因子及其受体在DC的体内迁移、免疫调控功能及HIV感染过程中起着重要作用。研究发现小鼠骨髓来源的DC高丰度表达趋化因子C-C家族成员：正常T细胞表达、分泌调节活化的因子(RANTES)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1β)和γ干扰素诱导蛋白(IP-10)，而单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)在基因修饰前后的DC中均不表达，表明小鼠骨髓来源的DC与人外周血来源的DC分泌的趋化因子不尽相同[8,9]。
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综上所述，用 IL-2基因修饰DC能促进DC自身分泌高水平的IL-2， IFN-γ和IL-12，在体内短时间能进一步增强T细胞的增殖和活化，能优化其抗原提呈的微环境，增强诱导机体特异性抗肿瘤免疫应答，本研究为增强DC的抗原提呈功能并将其更有效地用于肿瘤的免疫治疗提供了一定的实验依据。
参 考 文 献
1，Shibusa T, Shijubo N, Abe S. Tumor angiogenesis and vascular endothelial growth factor expression in stage Ⅰ lung adenocarcinoma. Clin Cancer Res, 1998， 4(6): 1483
2，曹雪涛. 树突状细胞的基础与临床研究新进展. 中国免疫学杂志， 1998， 14(3)： 161
, 百拇医药
3，章卫平， 曹雪涛， 张明徽， 等. GM-CSF重组腺病毒扩增的骨髓树突状细胞体外经肿瘤抗原刺激后诱导抗肿瘤免疫应答. 中华医学杂志， 1997， 13： 29
4，Korskaja SN, Buffo MJ, Bunker M, et al. Interleukin 2 induces development of dendritic cell from cord blood CD34+ cell. J Leukoc Biol， 1998, 63: 620
5，Porgador A， Gilboa E. Bone marrow-generated dendritic cells pulsed with a class Ⅰ-restricted peptide are potent inducers of cytotoxic T lymphcytes. J Exp Med, 1995, 182: 255
, http://www.100md.com
6，Kradin RL, Xia W, Pike M， et al. Interleukin-2 promotes the motility of dendritic cells and their accumulation in lung and skin. Pathobiology， 1996, 64(4): 180
7，Javier G, Ana G,Carlos MA, et al. IL-2-induced events. Crit Rev Immunol， 1998, 18: 185
8，Sozzani S, Luini W, Borsatti A, et al. Receptor expression and responsiveness of human dendritic cells to a defined set of CC and CXC chemokines. J Immunol, 1997， 159(4): 1993
9，Schaniel C, Pardali E, Sallusto F, et al. Activated murine B lymphocytes and dendritic cells produce a novel CC chemokine which acts selectively on activated T cells. J Exp Med, 1998, 188(3): 451
(1999-03-05收稿； 1999-05-12修回), http://www.100md.com
单位：孙黎飞 曹雪涛 田野苹 章卫平 明徽 黄欣 于益芝(第二军医大学免疫学教研室 上海 200433)
关键词：白细胞介素2；树突状细胞；基因修饰；细胞因子；趋化因子
中国肿瘤生物治疗杂志000107 摘 要 目的： 观察用白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)基因修饰小鼠骨髓来源的树突状细胞(dendritic cells, DC)后，DC表达细胞因子和趋化因子的变化及DC体内免疫后，小鼠体内主要脏器中IL-2表达情况。探讨其对抗原提呈微环境的改善及其可能的机制。方法:用ELISA方法检测DC培养上清和小鼠血清及脏器中IL-2的含量，用RT-PCR方法检测DC中IL-2,IFN-γ,IL-12,GM-CSF,IL-4,IL-10,TNF-α,IL-1β,MIP-1β,MCP-1,RANTES和IP10等的表达，用FACS分析DC表面IL-2受体的变化。结果： 经IL-2基因修饰后，DC除了分泌高水平的IL-2外，尚能分泌一定水平的IFN-γ和IL-12，其表面表达的IL-2Rα密度增加。RT-PCR分析表明其表达多种细胞因子和趋化因子，用IL-2基因修饰的DC免疫小鼠后，血清和脏器中能检测到高水平的IL-2。结论： IL-2基因修饰DC，能促进DC表达IL-2受体，并以自分泌形式分泌高水平的IL-2，优化其抗原提呈的微环境，提示可增强DC的抗原提呈功能。
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Effect of IL-2 Gene Modification on the Cytokine Expression in Dendritic Cells
Sun Lifei, Cao Xuetao, Tian Yieping, Zhang Weiping, Zhang Minghui, Huang Xin, Yu Yizhi
(Department of Immunology, Second Military Medical University, Shanghai 200433)
Abstract Objective: To investigate the effect of IL-2 gene modification on expression of cytokines and chemokines in dendritic cells (DCs) and IL-2 expression in mouse organs after in vivo DC immunization and to determine the improvement of microenvironment of antigen presentation and its potential mechanism. Methods: The IL-2 levels in DC culture, mouse serum and organs after IL-2 gene-modified DC(DC-IL-2) injection in vivo were examined by ELISA. The mRNA expressions of cytokine and chemokines (IL-2, IFN-γ, IL-12, GM-CSF, IL-4, IL-10, TNF-α, IL-1β, MIP-1β, MCP-1, RANTES and IP10) in DC-IL-2 were analyzed by RT-PCR. The expression of IL-2Rα on surface of DC-IL-2 was analyzed by FACS. Results: After IL-2 gene modification, DCs could secret high level of IL-2, IFN-γ and IL-12. The expression of IL-2Rα on the surface of DC-IL-2 was increased. mRNAs of various cytokines and chemokines were detected. The levels of IL-2 increased immediately in mouse serum, lung, spleen and liver after DC-IL-2 injection in vivo. Conclusion: The IL-2 gene modification could enhance the biologic activity of the DCs and the microenvironment of antigen presentation was optimized.
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Key words interleukin 2; dendritic cells; gene modification; cytokine; chemokines
树突状细胞(dendritic cells, DC)是抗原提呈功能最强的抗原提呈细胞，其在肿瘤治疗中的应用是近年来的热点课题。利用细胞因子基因修饰DC，通过选择性增强DC与T细胞体内的相互作用，优化体内抗原提呈的微环境，是目前肿瘤免疫治疗研究的重要方法之一。本文研究了白细胞素2(inderleukin-2),IL-2基因修饰DC后，DC分泌有关细胞因子的含量和DC表达IL-2受体的变化，探讨IL-2基因修饰对DC生物活性的影响。并用IL-2基因修饰的DC(DC-IL-2)体内免疫小鼠后，观察了IL-2在体内某些脏器中的表达情况，以期了解DC-IL-2在体内这些脏器中的分布情况，以及对这些脏器中免疫细胞能否起到有效激活作用，对其抗原提呈微环境是否有利等提供实验依据。
1 材料与方法
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1.1 主要试剂
小鼠IL-2重组腺病毒Ad-IL-2,LacZ重组腺病毒Ad-LacZ由日本癌症研究会Hamada博士惠赠,病毒滴度分别为3×109,1.9×109 pfu/ml。重组小鼠GM-CSF,IL-4,重组人IL-2购自Sigma公司。小鼠IL-2和IL-12p70 ELISA检测试剂盒购自Endogen公司。Taq 酶为TAKARA公司产品。PCR引物由中科院上海细胞所合成。琼脂糖购自Amecesoc公司。PCR Marker购自华美公司。荧光标记的大鼠抗小鼠Ia和IL-2Rα抗体购自PharMingen公司。
1.2 动物
C57BL/6小鼠(H-2Kb)雌性，6～8周龄，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司。
1.3 IL-2基因修饰的DC 培养上清中细胞因子含量的测定
, 百拇医药
用补体介溶法以大鼠抗小鼠CD4，CD8，B220/CD45R，Ia和FcR单抗加低毒性兔补体溶解阴性选择的骨髓细胞(1×106/ml)，用含10%FCS和重组小鼠GM-CSF(5 ng/ml)加重组小鼠IL-4(1 ng/ml)的RPMI 1640培养基在24孔板中常规制备正常小鼠骨髓来源的DC细胞。培养至第7天，收集悬浮细胞及疏松贴附于巨噬细胞的DC，置于另一培养板中(1×106/ml)，将Ad-mIL-2，Ad-LacZ腺病毒，分别对1×106/ml DC转染4 h，(MOI值＝100)，用Hank's洗涤2次，去除病毒后重悬基因转染过的DC以1×106/ml浓度在DC条件培养液中继续培养48 h，于转染后24,48 h分别收集培养上清，-20℃保存，以ELISA 法检测上清中IL-2,IL-12和IFN-γ的分泌水平。
1.4 相当剂量重组IL-2培养的DC制备
, 百拇医药 我们以往的研究中已证实IL-2基因修饰DC 24 h和48 h，DC的培养上清中IL-2的分泌量分别为3.25 ng/ml和5.0 ng/ml。故将正常培养至第7天的DC，以同等条件在其培养基中加入人重组白细胞介素2(rhIL-2) 5 ng /ml，继续培养24 h后，用Hank's液洗涤2次，按上述方法处理备用。无菌收取rhIL-2培养DC 24 h的上清，-20℃保存备用。
1.5 IL-2基因修饰的DC细胞因子m RNA的表达
1.5.1 实验分组，取上述处理的DC共分5组：(1)培养至第7天的正常DC(N7-DC)；(2)培养至第8天的正常DC(N8-DC)；(3) IL-2基因修饰的DC(DC-IL-2)；(4)LacZ 基因修饰的DC(DC-LacZ)；(5)相当剂量(5 ng/ml)rhIL-2培养的DC(rhIL-2-DC)。
1.5.2 RT-PCR操作步骤，取5组细胞各2×106，以PolyATtrct System 1000(Promega)提得mRNA，OligodT12～18引导下AMV(promega)将其反转录成cDNA后，PCR检测IL-2，IFN-γ，GM-CSF，IL-4，IL-10，TNF-α，IL-12p40，IL-11β，MCP-1，RANTES，MIP-1β和IP10的表达。检测对照基因为β-actin。PCR反应在PE公司9600型DNA扩增仪上完成。反应参数为95℃ 10 s；55℃ 30 s；72℃ 20 s；30个循环，以2%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳分析。所用的PCR引物序列分别为：
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小鼠β-actin: 上游：5'GCT GAG AGG GAA ATC GTG
下游：5'GGG TGT AAA ACG CAG CTC
小鼠IL-2： 上游：5'TCC ACT TCA AGC TCT ACA G
下游：5'GAG TCA AAT CCA GAA CAT GCC
小鼠IFN-γ： 上游：5'CAT GAA AAT CCT GCA GAG CC
下游：5'GGA CAA TCT CTT CCC CAC CC
小鼠IL-10： 上游：5'ACA ACA TAC TGC TAA CCG AC
, http://www.100md.com 下游：5'CAC CTT GGT CTT GGA GCT TA
小鼠TNF-α： 上游：5'GCA GGT CTA CTT TGG AGT CA
下游：5'ACA TTC GAG GCT CCA GTG AA
小鼠IL-12p40： 上游：5'TCA CAG GTG GAG GTC AGC
下游：5'GGC CAA GTG GAA TGC TAG
小鼠IL-1β： 上游：5'TGG ACC TTC CAG GAT GAG
下游：5'TGG GTA TTG CTT GGG ATC
小鼠MCP-1： 上游：5'CAG TAC GAT CCT CAC GAA TG
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下游：5'TGT CCA ATT TCT CAA ACC TG
小鼠RANTES： 上游：5'ATG AAG ATC TCT GCA GCT GC
下游：5'TGA ACC CAC TTC TTC TCT GG
小鼠MIP-1β： 上游：5'CTC TCT CTC CTC TTG CTC GT
下游：5'CAT GTA CTC AGT GAC CCA GG
小鼠IP10： 上游：5'GTC ATT TTC TGC CTC ATC CT
下游：5'GAC CTT TTT TGG CTA AAC G
小鼠GM-CSF： 上游：5'TAA ATG ATA ATT GTT ACC CGG CCT TGG
, http://www.100md.com
下游：5'AAG GAT CCT CAT TTT TGG CTT GGT TTT TTG
小鼠IL-4： 上游：5'ATT ATG CAT ATC CAC GGA TGC GAC AA
下游：5'AAG GAT CCT TAC GAG TAA TCC ATT TGC ATG A
1.6 IL-2基因修饰的DC表面IL-2受体的表达
采用荧光抗体直接标记法，分别对上述正常培养第8天的DC，及经基因修饰的DC和rhIL-2培养的DC，用PE标记的小鼠IL-2Rα和FITC 标记的小鼠Ia单克隆荧光抗体4℃标记1 h，以小鼠血清封闭非特异性荧光染色，无关抗体作阴性对照。流式细胞仪(FACS)进行IL-2Rα和Ia双标记检测DC表面IL-2 Rα密度的几何平均数。
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1.7 用IL-2基因修饰的DC尾静脉注射后小鼠血清和脏器中IL-2含量的变化
将DC-IL-2细胞浓度调整为1×106/ml，每只小鼠尾静脉注射细胞数为1×105/100 μl，共分DC-LacZ和DC-IL-2两组。于注射后第1，3，5，7，10天，每天处死3只小鼠，取血清，并取其肺脏、脾脏和肝脏称重后，剪碎组织，匀浆， 4℃，4 000 r/min，离心30 min，收集上清，-20℃冻存，用ELISA试剂盒检测IL-2水平，以推测IL-2基因修饰的DC在这些器官中的聚集情况。
2 结 果
2.1 IL-2基因修饰的DC 培养上清中细胞因子含量的测定
ELISA检测结果显示，正常DC和LacZ基因修饰的DC培养上清中均未检测到IL-2和IFN-γ，而IL-2基因修饰后培养24 h DC培养上清中可检测到较高的IL-2和IFN-γ；用5 ng /ml rhIL-2培养24 h后的DC培养上清中已不能检测出IL-2的含量，而培养24 h亦能检测出较高的IFN-γ。正常培养第8天的DC培养上清IL-12的含量为18 pg/ml，rIL-2处理和IL-2和LacZ基因修饰均能使IL-12的分泌增高，以IL-2基因修饰的DC培养上清中IL-12的检测值最高，培养24 h达56.2 pg/ml(详见表1)。
, 百拇医药
表1 IL-2基因修饰的 DC培养上清中细胞因子含量(pg/ml)
Tab. 1 Levels of cytokines in the supernatants from IL-2
gene-modified DCs Groups
IL-2
IFN-γ
IL-12
24 h
48 h
24 h
48 h
, 百拇医药 24 h
48 h
Normal-DC
0
0
0
0
18.0
18.0
DC-IL-2
3250.0
5000.0
193.0
, http://www.100md.com
791.2
56.2
78.4
DC-LacZ
0
0
0
190
33.7
38.5
DC-rhIL-2
0
0
, 百拇医药
130.0
276.0
33.2
40.1
2.2 IL-2基因修饰的DC细胞因子和趋化因子mRNA的表达
RT-PCR的结果如表2所示，除IL-2基因修饰的DC表达较高丰度的IL-2 mRNA外，正常条件培养的DC和其他各处理组的DC均未见IL-2 mRNA的表达。结果表明，正常DC并不表达IL-2 mRNA，经IL-2基因修饰后，DC中成功地表达IL-2基因。正常培养7 d的DC 并不表达IFN-γ mRNA。在IL-2基因修饰DC组和rhIL-2培养的DC组均可见到IFN-γ mRNA表达。正常培养第8天DC组和LacZ基因修饰的DC组未见IFN-γ mRNA表达。另外，除MCP-1 mRNA在各组DC中均不表达外，IL-12，GM-CSF，IL-4，IL-10，TNF-α，IL-1β等细胞因子和MIPβ，RANTES，IP10等趋化因子在各组DC中均呈不同程度的表达。
, 百拇医药
2.3 IL-2基因修饰的DC IL-2受体的表达
从图1 的FACS结果可见，正常培养8 d的DC可表达一定量的IL-2Rα，而培养7 d，经IL-2基因修饰24 h后的DC和经相当剂量rIL-2培养的DC面IL-2Rα密度明显增加，LacZ基因修饰的DC则无此现象。
2.4 IL-2基因修饰的DC尾静脉注射后小鼠血清和脏器中IL-2含量变化
DC-IL-2经尾静脉注入小鼠体内后，第1,3天肺脏和脾脏匀浆上清中IL-2含量升高，肝脏中较低。至第5天肺脏和脾脏中IL-2的含量明显降低，肝脏中已测不出IL-2，第10天后，上述脏器中均测不出IL-2。血清中IL-2水平在免疫24 h后迅速升高(612 pg/ml)，第3天最高(732 pg/ml)，第5天开始下降(440 pg/ml)，至第10天已基本降至正常水平(见表3)。表2 IL-2基因修饰的DC中细胞因子和趋化因子mRNA的表达
, 百拇医药
Tab.2 The cytokine and chemokine mRNA expression in IL-2
gene-modified DC analysed by RT-PCR Groups
DC-IL-2
DC-LacZ
DC-rhIL-2
Normal-DC
β-actin
+
+
+
, 百拇医药 +
IL-2
+
-
-
-
IFN-γ
+
-
+
-
IL-12
+
+
, 百拇医药
+
+
GM-CSF
+
+
+
+
IL-4
+
+
+
+
IL-10
+
, 百拇医药
+
+
+
TNF-α
+
+
+
+
IL-1β
+
+
+
+
MIP-1β
, 百拇医药
+
+
+
+
MCP-1
-
-
-
-
RANTES
+
+
+
+
, 百拇医药
IP10
+
+
+
+
图1 IL-2基因修饰的DC表面IL-2Rα的FACS分析结果
Fig. 1 Flowing cytometric analysis for surface expression
of IL-2Rα on DCs modified with IL-2 gene
3 讨 论
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T细胞介导的免疫应答在机体抗肿瘤过程中起着主导作用，T细胞的致敏、活化和增殖依赖于抗原提呈细胞(APC)对抗原的识别和有效提呈。某些恶性肿瘤细胞的免疫原性低下或变异，肿瘤细胞自身又缺乏共刺激信号，导致T细胞的失能，而且在恶性肿瘤生长的同时还能分泌多种免疫抑制因子，如IL-10，TGF-β和VEGF[1]等，对肿瘤局部的淋巴细胞和抗原提呈细胞都有很强的抑制作用，致使肿瘤抗原不能有效被APC提呈给淋巴细胞，这是肿瘤细胞逃逸免疫监视的主要机制之一。因此，如何优化肿瘤抗原提呈的微环境，降低抑制因子的分泌水平，解除对APC和T细胞的抑制作用，更有效地调动机体特异性抗肿瘤免疫应答，成为肿瘤免疫治疗中具有实际意义的研究方向。
表3 注射DC-IL-2后小鼠脏器中IL-2的含量(pg/ml)
Tab. 3 Levels of IL-2 in organs of the mice injected with
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IL-2 gene-modified DC Groups
IL-2 levels
day1
day3
day5
day7
day10
Lung
908
695
333
108
, 百拇医药
0
Spleen
690
998
434
148
0
Liver
612
206
0
0
0
, http://www.100md.com DC是目前已知的体内抗原提呈功能最强的APC，DC表面表达丰富的MHC 分子、共刺激分子、粘附分子，以及DC所分泌的IL-12和趋化因子，在DC介导的抗原提呈过程中，对DC的抗原识别、迁移和激发T细胞增殖等多环节，起着重要的作用[2]。
许多细胞因子参与了DC的成熟和功能的调节[3,4]，其中，IL-2是众多淋巴细胞因子中生物活性比较明确，在机体免疫应答中起关键作用的细胞因子。IL-2不但在激活T淋巴细胞增殖中起着重要作用，而且在B细胞和巨噬细胞活化中亦起着协同作用[5]。近来，有研究提示IL-2对DC的迁移和定向分化都有一定的正向调节作用。IL-2能增加DC的迁移运动，并可调节其它Th1细胞产生促进因子吸引DC到炎症部位[6]。用IL-2或GM-CSF基因修饰的肿瘤细胞瘤苗能促进APC对肿瘤抗原的加工处理，激活CTL前体，增强CTL活化和产生[7]。因此，我们设想将IL-2基因导入DC，在提高其抗原提呈功能的同时分泌IL-2，优化DC对肿瘤抗原提呈的微环境，以期更有效地诱导机体特异性抗肿瘤免疫效应。
, 百拇医药
结果显示，IL-2基因修饰的DC不但能分泌高水平的IL-2，而且还能促进IFN-γ和IL-12的分泌，而LacZ基因修饰的DC和相同条件下以重组IL-2培养的DC则无此显著性作用。用DC-IL-2免疫小鼠后，短时间即在小鼠的肺脏、脾脏和血清内检测到较高浓度的IL-2水平，这或许是DC-IL-2免疫后，载有IL-2基因的DC增加了迁移性，在这些器官的集聚；同时亦不能排除DC-IL-2在体内持续分泌高浓度的IL-2释放入血，活化了这些脏器中的其它免疫细胞(如T淋巴细胞和单核-巨噬细胞)共同分泌IL-2和IFN-γ所起的协同作用。
趋化因子及其受体在DC的体内迁移、免疫调控功能及HIV感染过程中起着重要作用。研究发现小鼠骨髓来源的DC高丰度表达趋化因子C-C家族成员：正常T细胞表达、分泌调节活化的因子(RANTES)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1β)和γ干扰素诱导蛋白(IP-10)，而单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)在基因修饰前后的DC中均不表达，表明小鼠骨髓来源的DC与人外周血来源的DC分泌的趋化因子不尽相同[8,9]。
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综上所述，用 IL-2基因修饰DC能促进DC自身分泌高水平的IL-2， IFN-γ和IL-12，在体内短时间能进一步增强T细胞的增殖和活化，能优化其抗原提呈的微环境，增强诱导机体特异性抗肿瘤免疫应答，本研究为增强DC的抗原提呈功能并将其更有效地用于肿瘤的免疫治疗提供了一定的实验依据。
参 考 文 献
1，Shibusa T, Shijubo N, Abe S. Tumor angiogenesis and vascular endothelial growth factor expression in stage Ⅰ lung adenocarcinoma. Clin Cancer Res, 1998， 4(6): 1483
2，曹雪涛. 树突状细胞的基础与临床研究新进展. 中国免疫学杂志， 1998， 14(3)： 161
, 百拇医药
3，章卫平， 曹雪涛， 张明徽， 等. GM-CSF重组腺病毒扩增的骨髓树突状细胞体外经肿瘤抗原刺激后诱导抗肿瘤免疫应答. 中华医学杂志， 1997， 13： 29
4，Korskaja SN, Buffo MJ, Bunker M, et al. Interleukin 2 induces development of dendritic cell from cord blood CD34+ cell. J Leukoc Biol， 1998, 63: 620
5，Porgador A， Gilboa E. Bone marrow-generated dendritic cells pulsed with a class Ⅰ-restricted peptide are potent inducers of cytotoxic T lymphcytes. J Exp Med, 1995, 182: 255
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6，Kradin RL, Xia W, Pike M， et al. Interleukin-2 promotes the motility of dendritic cells and their accumulation in lung and skin. Pathobiology， 1996, 64(4): 180
7，Javier G, Ana G,Carlos MA, et al. IL-2-induced events. Crit Rev Immunol， 1998, 18: 185
8，Sozzani S, Luini W, Borsatti A, et al. Receptor expression and responsiveness of human dendritic cells to a defined set of CC and CXC chemokines. J Immunol, 1997， 159(4): 1993
9，Schaniel C, Pardali E, Sallusto F, et al. Activated murine B lymphocytes and dendritic cells produce a novel CC chemokine which acts selectively on activated T cells. J Exp Med, 1998, 188(3): 451
(1999-03-05收稿； 1999-05-12修回), http://www.100md.com