蚕丝水解物对实验性糖尿病大鼠血糖调节作用的机制研究
作者：高建梅 白锦 满青青 刘刚
单位：中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京 100050
关键词：蚕丝水解物；Ⅱ型糖尿病；胰岛素受体；胰岛素的受体后作用
卫生研究000610 摘要：从胰岛素的受体和受体后作用机制来探讨蚕丝水解物(silk hydrates,SH)调节糖代谢的机理。选用若干只雄性成年Wistar大鼠随机分为2组：一组经尾静脉注射小剂量链脲佐菌素(STZ，30mg/kg BW)3周后，加喂高糖、高脂、高热量饲料。选择具有Ⅱ型糖尿病特征，即糖耐量异常、胰岛素高于或等于对照组的38只大鼠为糖尿病模型组。另一组36只大鼠不注射STZ，仅喂普通饲料，为对照组。再分别将2组大鼠各随机分为2小组：糠尿病对照组、糖尿病+SH组；正常对照组、正常+SH组。每日给予SH 1g/kg BW，观察12周，在实验末每组随机取半数大鼠做骨骼肌胰岛素受体结合实验；其余大鼠做葡萄糖摄取实验。结果表明：①SH能显著改善糖尿病大鼠的糖耐量，但对正常大鼠及糖尿病大鼠胰岛素的分泌基本没有影响；②给予SH后，糖尿病大鼠骨骼肌细胞膜胰岛素受体对125I-胰岛素的特异结合率没有明显提高，仍低于正常大鼠；仅低亲和力位点上的受体亲和力常数显著增加；③给予SH后，糖尿病大鼠的骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取显著增加；其自由摄食状态下的肝糖原、骨骼肌糖原的含量显著增加；④给予SH后，糖尿病大鼠部分血脂紊乱得以改善。结果提示SH主要是通过胰岛素的受体后作用机制来改善Ⅱ型糖尿病模型大鼠血糖代谢的紊乱。
, 百拇医药
中图分类号：R587.1 R459.3 Q591.4 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)06-0379-04
Mechanism of silk hydrates on modulating the blood glucose
metabolism in rats with experimental diabetes
Gao Jianmei Bai Jin Man Qingqing Liu Gang
(Institute of Nutrition and Food Hygiene,Chinese Academy of Preventive Medicine,Beijing 100050,China)
, 百拇医药
Abstract：Thirty eight adult male Wistar rats injected with streptozotocin(STZ) 30mg/kgBW via tail vein and fed on a diet of high fat,high sucrose and high calorie for 3 weeks and then for another 8 weeks were successfully established as the diabetes model(type Ⅱ diabetes mellitus).The effects of feeding silk hydrates(SH)for 12 weeks on the activities of insulin receptors and postreceptors were observed.The results showed that:1)SH greatly improved the glucose t olerance of diabetic rats,but no effect on the secretion of insulin in rats with or without diabetes; 2)Only the low-affinity constant of insulin binding rates(K2) in skeletal muscle cell membranes of diabetic rats fed with SH were obviously increased,the high-affinity binding constant and the number of receptors were not changed; 3)the uptake of glucose in skeletal muscle of diabetic rats fed on SH was significantly increased.4)SH partly improved the metabolism of serum lipids. The results indicated that SH could modulate the metabolism of blood glucose mainly through the mechanism on the activity of insulin postreceptor.
, 百拇医药
Key words:diabetes mellitus(type Ⅱ),silk hydrates(SH),insulin receptor,insulin postreceptor action
早在祖国传统医学中就有蚕丝水解物治疗糖尿病的记载，我们的动物实验也发现蚕丝水解物能够显著改善Ⅱ型糖尿病模型大鼠的糖耐量[1]，但其调节糖代谢的机理并不清楚。本文从胰岛素受体作用以及对葡萄糖的摄取、肝糖原和肌糖原的贮存等胰岛素受体后作用的机制来探讨蚕丝水解物调节血糖，改善糖耐量的机理。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)、3H-2脱氧葡萄糖、牛胰岛素标准品、牛血清球蛋白均购自美国Sigma公司；2-脱氧葡萄糖为英国进口分装；POPOP购自香港；PPO是瑞典Farck公司的产品；125I-胰岛素购自海军总医院放射免疫测定生物中心(比放射性5069 Bq/μg)。
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1.2 动物模型的建立[1]
38只Ⅱ型糖尿病模型大鼠随机分为糖尿病对照组(n=19)，糖尿病+SH组(n=19)；另36只正常大鼠随机分为正常对照组(n=18)，正常+SH组(n=18)。每日分别给予糖尿病+SH组和正常+SH组SH 1g/kgBW(配成200g/L的溶液，每日0.5ml/100g BW)。观察12周，实验末每组随机取一半在摄食状态下处死，取肝、骨骼肌做相应指标，其中仅对正常对照组、糖尿病对照组、糖尿病+SH组这3组做骨骼肌细胞膜胰岛素受体实验；此3组中其余大鼠做葡萄糖摄取实验，按要求做相应的处理。
1.3 骨骼肌细胞膜的制备
按Bonen等的实验方法，除去脂肪和结缔组织，称取骨骼肌，经多次离心后得到白色的膜制 品[2]。用缓冲液，制成2～4μg/μl悬浮液，液氮冷冻后，置于-70℃冰箱保存。用Lowery法测膜蛋白[3]，用Touster法测5′-核苷酸酶[4]。
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1.4 骨骼肌细胞膜胰岛素受体结合实验
参考Saucier等方法，在骨骼肌细胞膜缓慢解冻后，向冰浴中的小试管加入不同浓度的标准牛胰岛素0.1ml(0.1～10000ng)，每一浓度平行两管。各管再加入含125I-胰岛素5069 Bq/μg，每管约2万cpm)和2%牛血清白蛋白的0.025mol/L Tris-HCl(pH7.6)温育液0.05ml,然后每管加入100～110μg膜蛋白0.1ml，总反应体积0.25ml,4℃保温22h。反应终止时，加158mg/ml聚乙二醇(PEG6000)0.8ml、0.3%牛血清球蛋白0.1ml,混匀。4℃放置20min后，约2000g离心10min，抽吸去上清液，沉淀计数[5 ]。
1.5 大鼠骨骼肌和脂肪组织对葡萄糖的摄取实验
在实验的第12周时，大鼠禁食8h，按Turinsky方法，经尾静脉注射0.1ml含2.18×105Bq的3H-2-脱氧葡萄糖等渗磷酸盐缓冲液(pH7.4)/100g BW(比放射活性5.08MBq/mmol)，25min后断头处死。留取血液，离心取血清0.1ml；各称取0.1g后腿比目鱼肌和肾周脂肪，平行二管，剪碎，然后各管加入60%过氯酸0.4ml和30%H2O2 0.2ml。所有盛放样品的试管放于80℃水浴锅，消化至液体清亮。冷却后，各管加入10ml PPO/POPOP/甲苯-TritonX-100闪烁液，混匀、透明状，用LS Beckman 60000SE型自动液闪仪，测量放射性，换算成单位湿组织或血清中葡萄糖的pmol值[6]。
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1.6 其它项目测定
血糖采用葡萄糖氧化酶法；血脂(TC、TG、HDL-C)均采用酶法；胰岛素采用放免法；肝糖元和肌糖元用蒽酮法测定。
1.7 数据分析
各项结果运用SPSS统计软件进行方差分析和t检验。作结合抑制曲线和Scatchard图分析，用双位点受体计算机软件求受体各参数。
2 结果
2.1 正常大鼠和糖尿病大鼠在自由摄食状态下血糖、胰岛素、肝糖原和骨骼肌糖原的水平
给予SH12周后，糖尿病对照组在自由摄食状态下的血糖、胰岛素水平均显著高于正常对照组(P<0.01)。而糖尿病+SH组的血糖显著低于糖尿病对照组(P<0.01)，两组之间胰岛素水平无显著的差异。正常+SH组与正常对照组大鼠相比在血糖及胰岛素水平上差异均无显著性。糖尿病对照组的肝糖原和骨骼肌糖原含量显著低于正常对照组(P<0.05)；糖尿病+SH组的肝糖原含量显著高于糖尿病对照组(P<0.01)；骨骼肌糖原含量两组之间无显著的差异。正常+SH组的骨骼肌糖原含量显著高于正常对照组(P<0.05)，而肝糖原的含量在此两组间无显著差异(见表1)。
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表1 添加SH12周对大鼠肝糖原、肌糖原、血糖、血胰岛素水平的影响(
±s) 组别
n
血糖
(mmol/L)
胰岛素
肝 糖原
(g/g肝组织)
肌糖原
(mg/g肌组织)
正常对照组
9
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6.32±0.53
50.29±10.12
27.3±3.3
2.7±0.7
正常+SH组
9
5.76±0.52
47.91± 7.05
30.0±3.2
3.3±0.7(1)
糖尿病对照组
10
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10.65±3.25(2)
78.46±36.05(2)
22.1±3.2(2)
2.0±0.3(1)
糖尿病+SH组
9
7.99±1.42(3)
64.40±16.92
28.8±4.0(3)
2.3±0.5
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注：与正常对照组相比(1)P<0.05 (2)P<0.01 (3)与糖尿病对照组相比 P<0.01
2.2 正常大鼠和糖尿病大鼠的骨骼肌细胞膜胰岛素受体特征参数的变化
K表示受体亲和力常数。K≥109时称高亲和力常数(用K1表示)；K≤107称低亲和力常数(用K2表示)，高、低亲和力位点的受体数目分别用R1、R2表示。胰岛素结合百分率综合反映胰岛素受体的亲和力和数目的状况。
在不同浓度胰岛素的影响下，骨骼肌细胞膜与125I-胰岛素的结合率见图1。糖尿病对照组明显低于正常对照组(P<0.05)。糖尿病+SH组与糖尿病对照组相比虽未达到统计学上的显著性，但有所增加(见图1)。
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图1 骨骼肌细胞膜12sI-胰岛素特异结合率
Scatchard分析显示，糖尿病对照组的K1、K2和R1、R2与正常对照组相比，虽然差异无显著性，但有明显降低的趋势；糖尿病+SH组K1、R1和R2同糖尿病对照组相比差异无显著性，仅R2显著高于糖尿病对照组(P<0.05)，见表2和图2。
表2 大鼠骨骼肌细胞膜胰岛素受体的参数(±s) 组别
n
K1[×109,(mol/L)-1]
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R1
(×10-12,mol/mg)
K2
[×107,(mol/L)-1]
R1
(×10-11,mol/mg)
正常对照组
9
3.33±1.91
0.13±0.13
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0.27±0.20
3.71±1.64
糖尿病对照组
10
2.45±2.01
0.06±0.04
0.16±0.08
2.79±0.89
糖尿病+SH组
9
3.17±1.67
0.07±0.11
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0.40±0.35(1)
2.33±1.91
注：与糖尿病对照组相比(1)P<0.05
图2 骨骼肌细胞膜胰岛素受体结合Scatchard分析
2.3 正常大鼠和糖尿病大鼠的骨骼肌及脂肪组织对葡萄糖的摄取
如表3所示，骨骼肌及脂肪组织对葡萄糖的摄取，糖尿病对照组显著低于正常对照组(P<0.01)，糖尿病+SH组大鼠骨骼肌对葡萄糖的摄取高于糖尿病对照组(P<0.01)，但脂肪组织的摄取量在2组之间差异无显著性(P>0.05)。
表3 各组大鼠骨骼肌和脂肪组织对葡萄糖的摄取(±s)
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pmol/g组织 组别
骨骼肌
脂肪组织
正常对照组
34.6±6.5(1)
40.2±6.0(1)
糖尿病对照组
36.6±3.2(2)
27.5±2.7(2)
糖尿病+SH组
44.7±3.9(3)
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30.9±4.5(2)
注：与正常对照组相比(1)P<0.05，(2)P<0.01，与糖尿病对照组相比(3)P<0.01
3 讨论
蚕丝水解物(SH)含有多种氨基酸及一些小肽，早在《本草纲目》上就有缫丝汤治消渴大验的记载[7]；在《证治摘要》中称其治消渴如神(消渴即现代医学中的糖尿病)。我们的动物实验发现，糖尿病大鼠在给予SH4周后其糖耐量得到了显著的改善，胰岛素释放指数有增加的趋势，胰岛素抵抗的程度有所减轻，但胰岛素水平没有显著的改变。正常大鼠在给予SH后，胰岛素水平也没有增加。提示SH并不是通过刺激胰岛β细胞增加胰岛素的分泌来代偿组织对胰岛素的抵抗[1]。
目前大多数观点认为受胰岛素调节的葡萄糖摄取和贮存受损主要是因为胰岛素抵抗[8]。在本实验中给予糖尿病大鼠SH12周后，肝糖原的含量显著提高，提示SH能够改善肝脏对胰岛素的抵抗，可能是胰岛素相对缺乏的状态有所改善(胰岛素释放指数有所增加)，也可 能与肝糖原合成酶的改变有关，因为糖尿病大鼠的肝糖原合成酶活性降低[6]。SH改善糖耐量的作用是否与肝糖原合成酶有关还需要进一步研究。本实验还发现糖尿病大鼠骨骼肌糖原的含量也显著提高，提示SH能够通过改善对胰岛素敏感外周组织-骨骼组织的葡萄糖非氧化代谢途径的缺陷，而使糖原贮存增加。这一点具有一定的临床意义，因为临床实验发现Ⅱ型糖尿病患者体内胰岛素作用的葡萄糖氧化和非氧化代谢途径均受损，但非氧化代谢途径的损害尤为明显，其胰岛素抵抗的主要特点是糖原合成严重受损，其中骨骼肌的糖原合成占糖代谢非氧化途径的90%以上[10]。
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有研究运用葡萄糖钳夹和示踪技术发现：在胰岛素刺激状态下，骨骼肌组织是胰岛素抵抗的主要部位，骨骼肌组织葡萄糖的利用占全身糖利用的70%～75%；在高胰岛素血症和高血糖状态下，骨骼肌组织对葡萄糖的摄取利用占全身糖利用的95%；脂肪组织的摄取利用占全身糖利用的5%～20%[11]。它们对血糖和血脂的代谢具有重要的意义。在本实验中运用葡萄糖的相似物2-脱氧葡萄糖，用同位素示踪法，来研究SH对葡萄糖摄取的作用。2-脱氧葡萄糖能够通过与葡萄糖相似的途径进入肝外组织和被磷酸化，但不能被进一步代谢[12]。我们发现糖尿病+SH组大鼠骨骼肌组织对糖的摄取显著增加，是糖尿病对照组大鼠的1.2倍，脂肪组织对糖的摄取也有所增加，但尚未达到统计学上的显著性，提示SH能 够加强胰岛素的受体后作用，促进骨骼肌组织对糖的摄取，而对脂肪组织的作用不如对骨骼肌 组织那么明显。
众所周知，胰岛素要发挥其生理作用首先要与靶细胞膜表面的特异受体相结合，再通过跨膜的信号转导机理及一系列生化反应，产生最终的生物效应。因而胰岛素受体本身特性的变化与其生理效应的发挥有密切的关系。本实验对骨骼肌细胞膜胰岛素受体的分析发现受体的结合曲线呈内凹的形式，这与大多数的实验相似，一般可归诸于结合部位的异质性，即存在两种不同亲和力的结合部位[13]。给予SH后，糖尿病+SH组大鼠的骨骼肌细胞膜胰岛素受体高、低、亲和力常数和高亲和力部位的受体数目有增加的趋势，但尚未达到统计学显著意义，仅低亲和力部位的受体数目与糖尿病对照组大鼠相比有显著的增加，其意义还不明确。有观点认为数量少而对胰岛素具有高亲和性的受体可能是功能性受体，而数量多、低亲和性的受体，可能不起多大的作用，或者其作用目前还不清楚[14]。
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总而言之，实验结果显示SH对胰岛素受体水平作用的影响不大，SH改善胰岛素的受体后作用，增加对胰岛素的敏感性可能是其改善糖尿病大鼠糖耐量的主要机制；另外，SH能够改善部分血脂的紊乱，降低低密度脂蛋白胆固醇，提高高密度脂蛋白胆固醇使冠心病危险预测指数下降也可能是其能调节糖代谢异常的原因之一。最新的观点认为，通过葡萄糖-脂肪酸循环改善脂质代谢紊乱，将有利于促进胰岛素对糖代谢的作用[15]。对上述机制的研究发现，为更好地开发传统中医药，并为在糖尿病人合理应用提供了科学参考。
作者简介：高建梅，女，硕士研究生； 现工作单位：辽宁省大连市卫生防疫站
4 参考文献
1，高建梅，白锦，满青青，等.蚕丝水解物对实验性糖尿病大鼠血糖的调 节作用.卫生研究，2000，29(4)：223-225
2，Bonen A,Hood DA,Tan MH,et al.Insulin-binding in human skeleta l muscle.Bioch et Biophys Acta,1984,801:171-176
, 百拇医药
3，Lowery OH, Rosebrough NJ, Farr LA, et al. Protein measurement with th e folin phenol reagent. J Biol Chem,1951,193:265-275
4，Touster O, Aronson NN, Dulaney JT, et al. Isolation of rat liver plas ma membranes:use of nucleotide pyrophosphatase and phosphodiesterase I as marker enzymes. J Cell Biol,1970,47:604-618
5，Saucier J, Dube J Y, Tremblay RR. Specific insulin binding sites in r at testis characterization and variation. Endocrinol,1981.109(6):2220-2225
, 百拇医药
6，Turinsky J.Glucose metabolism in the region recovering from burn injury:effect of insulin on 2-deoxyglucose uptake in vivo.Endocrinol,1983,113:1370
7，李时珍.本草纲目.第三十九卷虫部.北京：人民卫生出版社，1981，2253
8，Thoburn AW,Gumbiner B.Intracellular glucose oxidation and glucogen synthase activity are reduced in non-insulin dependent(type Ⅱ)diabetes independent of impaired glucose uptake.J Clin Invest,1990,85:522-529
, http://www.100md.com 9，王艳荣，钱荣立，马晓伟.实验性糖尿病大鼠肝糖原合成酶活性的改变.北京：北京医科大学学报，1998，30(1)：46-48
10，Kelley DE,Mandarino LT.Hyperglycemia normalizes insulin stimulate skeletal muscle glucose oxidation and storage in non-iinsulin dependent diabetes mellitus.J Clin Invest,1990,86:1999-2004
11，Defronzo RA.The triumvirate:beta-cell,muscle,liver:a collusion responsible for NIDDM.Diabetes,1988,37:667-687
12，Wick AN,Drury DR,Nakada HI,et al.Locatization of the primary metabolic blook produced by 2-deoxyglucose.J Biol Chem,1957,224:963-969
, 百拇医药
13，Fregchet P,Roth J,Neville DM.Insulin receptors in the liver sspecific binding of 125I-insulin to the plasma membrane and its relation to insulin bioactivity.Proc Nat Acad Sci,1971,68(8):1833-1837
14，吕宝璋，田英编著.受体学概论.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1991，49-53
15，Paolisso G,Howard BV.Role of non-esterified fatty acids in the pathogenesis of type 2 diabetes mllitus.Diabetic Med,1998,15:360-366
(2000-03-30收稿), http://www.100md.com
单位：中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京 100050
关键词：蚕丝水解物；Ⅱ型糖尿病；胰岛素受体；胰岛素的受体后作用
卫生研究000610 摘要：从胰岛素的受体和受体后作用机制来探讨蚕丝水解物(silk hydrates,SH)调节糖代谢的机理。选用若干只雄性成年Wistar大鼠随机分为2组：一组经尾静脉注射小剂量链脲佐菌素(STZ，30mg/kg BW)3周后，加喂高糖、高脂、高热量饲料。选择具有Ⅱ型糖尿病特征，即糖耐量异常、胰岛素高于或等于对照组的38只大鼠为糖尿病模型组。另一组36只大鼠不注射STZ，仅喂普通饲料，为对照组。再分别将2组大鼠各随机分为2小组：糠尿病对照组、糖尿病+SH组；正常对照组、正常+SH组。每日给予SH 1g/kg BW，观察12周，在实验末每组随机取半数大鼠做骨骼肌胰岛素受体结合实验；其余大鼠做葡萄糖摄取实验。结果表明：①SH能显著改善糖尿病大鼠的糖耐量，但对正常大鼠及糖尿病大鼠胰岛素的分泌基本没有影响；②给予SH后，糖尿病大鼠骨骼肌细胞膜胰岛素受体对125I-胰岛素的特异结合率没有明显提高，仍低于正常大鼠；仅低亲和力位点上的受体亲和力常数显著增加；③给予SH后，糖尿病大鼠的骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取显著增加；其自由摄食状态下的肝糖原、骨骼肌糖原的含量显著增加；④给予SH后，糖尿病大鼠部分血脂紊乱得以改善。结果提示SH主要是通过胰岛素的受体后作用机制来改善Ⅱ型糖尿病模型大鼠血糖代谢的紊乱。
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中图分类号：R587.1 R459.3 Q591.4 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)06-0379-04
Mechanism of silk hydrates on modulating the blood glucose
metabolism in rats with experimental diabetes
Gao Jianmei Bai Jin Man Qingqing Liu Gang
(Institute of Nutrition and Food Hygiene,Chinese Academy of Preventive Medicine,Beijing 100050,China)
, 百拇医药
Abstract：Thirty eight adult male Wistar rats injected with streptozotocin(STZ) 30mg/kgBW via tail vein and fed on a diet of high fat,high sucrose and high calorie for 3 weeks and then for another 8 weeks were successfully established as the diabetes model(type Ⅱ diabetes mellitus).The effects of feeding silk hydrates(SH)for 12 weeks on the activities of insulin receptors and postreceptors were observed.The results showed that:1)SH greatly improved the glucose t olerance of diabetic rats,but no effect on the secretion of insulin in rats with or without diabetes; 2)Only the low-affinity constant of insulin binding rates(K2) in skeletal muscle cell membranes of diabetic rats fed with SH were obviously increased,the high-affinity binding constant and the number of receptors were not changed; 3)the uptake of glucose in skeletal muscle of diabetic rats fed on SH was significantly increased.4)SH partly improved the metabolism of serum lipids. The results indicated that SH could modulate the metabolism of blood glucose mainly through the mechanism on the activity of insulin postreceptor.
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Key words:diabetes mellitus(type Ⅱ),silk hydrates(SH),insulin receptor,insulin postreceptor action
早在祖国传统医学中就有蚕丝水解物治疗糖尿病的记载，我们的动物实验也发现蚕丝水解物能够显著改善Ⅱ型糖尿病模型大鼠的糖耐量[1]，但其调节糖代谢的机理并不清楚。本文从胰岛素受体作用以及对葡萄糖的摄取、肝糖原和肌糖原的贮存等胰岛素受体后作用的机制来探讨蚕丝水解物调节血糖，改善糖耐量的机理。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)、3H-2脱氧葡萄糖、牛胰岛素标准品、牛血清球蛋白均购自美国Sigma公司；2-脱氧葡萄糖为英国进口分装；POPOP购自香港；PPO是瑞典Farck公司的产品；125I-胰岛素购自海军总医院放射免疫测定生物中心(比放射性5069 Bq/μg)。
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1.2 动物模型的建立[1]
38只Ⅱ型糖尿病模型大鼠随机分为糖尿病对照组(n=19)，糖尿病+SH组(n=19)；另36只正常大鼠随机分为正常对照组(n=18)，正常+SH组(n=18)。每日分别给予糖尿病+SH组和正常+SH组SH 1g/kgBW(配成200g/L的溶液，每日0.5ml/100g BW)。观察12周，实验末每组随机取一半在摄食状态下处死，取肝、骨骼肌做相应指标，其中仅对正常对照组、糖尿病对照组、糖尿病+SH组这3组做骨骼肌细胞膜胰岛素受体实验；此3组中其余大鼠做葡萄糖摄取实验，按要求做相应的处理。
1.3 骨骼肌细胞膜的制备
按Bonen等的实验方法，除去脂肪和结缔组织，称取骨骼肌，经多次离心后得到白色的膜制 品[2]。用缓冲液，制成2～4μg/μl悬浮液，液氮冷冻后，置于-70℃冰箱保存。用Lowery法测膜蛋白[3]，用Touster法测5′-核苷酸酶[4]。
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1.4 骨骼肌细胞膜胰岛素受体结合实验
参考Saucier等方法，在骨骼肌细胞膜缓慢解冻后，向冰浴中的小试管加入不同浓度的标准牛胰岛素0.1ml(0.1～10000ng)，每一浓度平行两管。各管再加入含125I-胰岛素5069 Bq/μg，每管约2万cpm)和2%牛血清白蛋白的0.025mol/L Tris-HCl(pH7.6)温育液0.05ml,然后每管加入100～110μg膜蛋白0.1ml，总反应体积0.25ml,4℃保温22h。反应终止时，加158mg/ml聚乙二醇(PEG6000)0.8ml、0.3%牛血清球蛋白0.1ml,混匀。4℃放置20min后，约2000g离心10min，抽吸去上清液，沉淀计数[5 ]。
1.5 大鼠骨骼肌和脂肪组织对葡萄糖的摄取实验
在实验的第12周时，大鼠禁食8h，按Turinsky方法，经尾静脉注射0.1ml含2.18×105Bq的3H-2-脱氧葡萄糖等渗磷酸盐缓冲液(pH7.4)/100g BW(比放射活性5.08MBq/mmol)，25min后断头处死。留取血液，离心取血清0.1ml；各称取0.1g后腿比目鱼肌和肾周脂肪，平行二管，剪碎，然后各管加入60%过氯酸0.4ml和30%H2O2 0.2ml。所有盛放样品的试管放于80℃水浴锅，消化至液体清亮。冷却后，各管加入10ml PPO/POPOP/甲苯-TritonX-100闪烁液，混匀、透明状，用LS Beckman 60000SE型自动液闪仪，测量放射性，换算成单位湿组织或血清中葡萄糖的pmol值[6]。
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1.6 其它项目测定
血糖采用葡萄糖氧化酶法；血脂(TC、TG、HDL-C)均采用酶法；胰岛素采用放免法；肝糖元和肌糖元用蒽酮法测定。
1.7 数据分析
各项结果运用SPSS统计软件进行方差分析和t检验。作结合抑制曲线和Scatchard图分析，用双位点受体计算机软件求受体各参数。
2 结果
2.1 正常大鼠和糖尿病大鼠在自由摄食状态下血糖、胰岛素、肝糖原和骨骼肌糖原的水平
给予SH12周后，糖尿病对照组在自由摄食状态下的血糖、胰岛素水平均显著高于正常对照组(P<0.01)。而糖尿病+SH组的血糖显著低于糖尿病对照组(P<0.01)，两组之间胰岛素水平无显著的差异。正常+SH组与正常对照组大鼠相比在血糖及胰岛素水平上差异均无显著性。糖尿病对照组的肝糖原和骨骼肌糖原含量显著低于正常对照组(P<0.05)；糖尿病+SH组的肝糖原含量显著高于糖尿病对照组(P<0.01)；骨骼肌糖原含量两组之间无显著的差异。正常+SH组的骨骼肌糖原含量显著高于正常对照组(P<0.05)，而肝糖原的含量在此两组间无显著差异(见表1)。
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表1 添加SH12周对大鼠肝糖原、肌糖原、血糖、血胰岛素水平的影响(
±s) 组别n
血糖
(mmol/L)
胰岛素
肝 糖原
(g/g肝组织)
肌糖原
(mg/g肌组织)
正常对照组
9
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6.32±0.53
50.29±10.12
27.3±3.3
2.7±0.7
正常+SH组
9
5.76±0.52
47.91± 7.05
30.0±3.2
3.3±0.7(1)
糖尿病对照组
10
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10.65±3.25(2)
78.46±36.05(2)
22.1±3.2(2)
2.0±0.3(1)
糖尿病+SH组
9
7.99±1.42(3)
64.40±16.92
28.8±4.0(3)
2.3±0.5
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注：与正常对照组相比(1)P<0.05 (2)P<0.01 (3)与糖尿病对照组相比 P<0.01
2.2 正常大鼠和糖尿病大鼠的骨骼肌细胞膜胰岛素受体特征参数的变化
K表示受体亲和力常数。K≥109时称高亲和力常数(用K1表示)；K≤107称低亲和力常数(用K2表示)，高、低亲和力位点的受体数目分别用R1、R2表示。胰岛素结合百分率综合反映胰岛素受体的亲和力和数目的状况。
在不同浓度胰岛素的影响下，骨骼肌细胞膜与125I-胰岛素的结合率见图1。糖尿病对照组明显低于正常对照组(P<0.05)。糖尿病+SH组与糖尿病对照组相比虽未达到统计学上的显著性，但有所增加(见图1)。
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图1 骨骼肌细胞膜12sI-胰岛素特异结合率
Scatchard分析显示，糖尿病对照组的K1、K2和R1、R2与正常对照组相比，虽然差异无显著性，但有明显降低的趋势；糖尿病+SH组K1、R1和R2同糖尿病对照组相比差异无显著性，仅R2显著高于糖尿病对照组(P<0.05)，见表2和图2。
表2 大鼠骨骼肌细胞膜胰岛素受体的参数(
±s) 组别n
K1[×109,(mol/L)-1]
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R1
(×10-12,mol/mg)
K2
[×107,(mol/L)-1]
R1
(×10-11,mol/mg)
正常对照组
9
3.33±1.91
0.13±0.13
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0.27±0.20
3.71±1.64
糖尿病对照组
10
2.45±2.01
0.06±0.04
0.16±0.08
2.79±0.89
糖尿病+SH组
9
3.17±1.67
0.07±0.11
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0.40±0.35(1)
2.33±1.91
注：与糖尿病对照组相比(1)P<0.05
图2 骨骼肌细胞膜胰岛素受体结合Scatchard分析
2.3 正常大鼠和糖尿病大鼠的骨骼肌及脂肪组织对葡萄糖的摄取
如表3所示，骨骼肌及脂肪组织对葡萄糖的摄取，糖尿病对照组显著低于正常对照组(P<0.01)，糖尿病+SH组大鼠骨骼肌对葡萄糖的摄取高于糖尿病对照组(P<0.01)，但脂肪组织的摄取量在2组之间差异无显著性(P>0.05)。
表3 各组大鼠骨骼肌和脂肪组织对葡萄糖的摄取(
±s), http://www.100md.com
pmol/g组织 组别
骨骼肌
脂肪组织
正常对照组
34.6±6.5(1)
40.2±6.0(1)
糖尿病对照组
36.6±3.2(2)
27.5±2.7(2)
糖尿病+SH组
44.7±3.9(3)
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30.9±4.5(2)
注：与正常对照组相比(1)P<0.05，(2)P<0.01，与糖尿病对照组相比(3)P<0.01
3 讨论
蚕丝水解物(SH)含有多种氨基酸及一些小肽，早在《本草纲目》上就有缫丝汤治消渴大验的记载[7]；在《证治摘要》中称其治消渴如神(消渴即现代医学中的糖尿病)。我们的动物实验发现，糖尿病大鼠在给予SH4周后其糖耐量得到了显著的改善，胰岛素释放指数有增加的趋势，胰岛素抵抗的程度有所减轻，但胰岛素水平没有显著的改变。正常大鼠在给予SH后，胰岛素水平也没有增加。提示SH并不是通过刺激胰岛β细胞增加胰岛素的分泌来代偿组织对胰岛素的抵抗[1]。
目前大多数观点认为受胰岛素调节的葡萄糖摄取和贮存受损主要是因为胰岛素抵抗[8]。在本实验中给予糖尿病大鼠SH12周后，肝糖原的含量显著提高，提示SH能够改善肝脏对胰岛素的抵抗，可能是胰岛素相对缺乏的状态有所改善(胰岛素释放指数有所增加)，也可 能与肝糖原合成酶的改变有关，因为糖尿病大鼠的肝糖原合成酶活性降低[6]。SH改善糖耐量的作用是否与肝糖原合成酶有关还需要进一步研究。本实验还发现糖尿病大鼠骨骼肌糖原的含量也显著提高，提示SH能够通过改善对胰岛素敏感外周组织-骨骼组织的葡萄糖非氧化代谢途径的缺陷，而使糖原贮存增加。这一点具有一定的临床意义，因为临床实验发现Ⅱ型糖尿病患者体内胰岛素作用的葡萄糖氧化和非氧化代谢途径均受损，但非氧化代谢途径的损害尤为明显，其胰岛素抵抗的主要特点是糖原合成严重受损，其中骨骼肌的糖原合成占糖代谢非氧化途径的90%以上[10]。
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有研究运用葡萄糖钳夹和示踪技术发现：在胰岛素刺激状态下，骨骼肌组织是胰岛素抵抗的主要部位，骨骼肌组织葡萄糖的利用占全身糖利用的70%～75%；在高胰岛素血症和高血糖状态下，骨骼肌组织对葡萄糖的摄取利用占全身糖利用的95%；脂肪组织的摄取利用占全身糖利用的5%～20%[11]。它们对血糖和血脂的代谢具有重要的意义。在本实验中运用葡萄糖的相似物2-脱氧葡萄糖，用同位素示踪法，来研究SH对葡萄糖摄取的作用。2-脱氧葡萄糖能够通过与葡萄糖相似的途径进入肝外组织和被磷酸化，但不能被进一步代谢[12]。我们发现糖尿病+SH组大鼠骨骼肌组织对糖的摄取显著增加，是糖尿病对照组大鼠的1.2倍，脂肪组织对糖的摄取也有所增加，但尚未达到统计学上的显著性，提示SH能 够加强胰岛素的受体后作用，促进骨骼肌组织对糖的摄取，而对脂肪组织的作用不如对骨骼肌 组织那么明显。
众所周知，胰岛素要发挥其生理作用首先要与靶细胞膜表面的特异受体相结合，再通过跨膜的信号转导机理及一系列生化反应，产生最终的生物效应。因而胰岛素受体本身特性的变化与其生理效应的发挥有密切的关系。本实验对骨骼肌细胞膜胰岛素受体的分析发现受体的结合曲线呈内凹的形式，这与大多数的实验相似，一般可归诸于结合部位的异质性，即存在两种不同亲和力的结合部位[13]。给予SH后，糖尿病+SH组大鼠的骨骼肌细胞膜胰岛素受体高、低、亲和力常数和高亲和力部位的受体数目有增加的趋势，但尚未达到统计学显著意义，仅低亲和力部位的受体数目与糖尿病对照组大鼠相比有显著的增加，其意义还不明确。有观点认为数量少而对胰岛素具有高亲和性的受体可能是功能性受体，而数量多、低亲和性的受体，可能不起多大的作用，或者其作用目前还不清楚[14]。
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总而言之，实验结果显示SH对胰岛素受体水平作用的影响不大，SH改善胰岛素的受体后作用，增加对胰岛素的敏感性可能是其改善糖尿病大鼠糖耐量的主要机制；另外，SH能够改善部分血脂的紊乱，降低低密度脂蛋白胆固醇，提高高密度脂蛋白胆固醇使冠心病危险预测指数下降也可能是其能调节糖代谢异常的原因之一。最新的观点认为，通过葡萄糖-脂肪酸循环改善脂质代谢紊乱，将有利于促进胰岛素对糖代谢的作用[15]。对上述机制的研究发现，为更好地开发传统中医药，并为在糖尿病人合理应用提供了科学参考。
作者简介：高建梅，女，硕士研究生； 现工作单位：辽宁省大连市卫生防疫站
4 参考文献
1，高建梅，白锦，满青青，等.蚕丝水解物对实验性糖尿病大鼠血糖的调 节作用.卫生研究，2000，29(4)：223-225
2，Bonen A,Hood DA,Tan MH,et al.Insulin-binding in human skeleta l muscle.Bioch et Biophys Acta,1984,801:171-176
, 百拇医药
3，Lowery OH, Rosebrough NJ, Farr LA, et al. Protein measurement with th e folin phenol reagent. J Biol Chem,1951,193:265-275
4，Touster O, Aronson NN, Dulaney JT, et al. Isolation of rat liver plas ma membranes:use of nucleotide pyrophosphatase and phosphodiesterase I as marker enzymes. J Cell Biol,1970,47:604-618
5，Saucier J, Dube J Y, Tremblay RR. Specific insulin binding sites in r at testis characterization and variation. Endocrinol,1981.109(6):2220-2225
, 百拇医药
6，Turinsky J.Glucose metabolism in the region recovering from burn injury:effect of insulin on 2-deoxyglucose uptake in vivo.Endocrinol,1983,113:1370
7，李时珍.本草纲目.第三十九卷虫部.北京：人民卫生出版社，1981，2253
8，Thoburn AW,Gumbiner B.Intracellular glucose oxidation and glucogen synthase activity are reduced in non-insulin dependent(type Ⅱ)diabetes independent of impaired glucose uptake.J Clin Invest,1990,85:522-529
, http://www.100md.com 9，王艳荣，钱荣立，马晓伟.实验性糖尿病大鼠肝糖原合成酶活性的改变.北京：北京医科大学学报，1998，30(1)：46-48
10，Kelley DE,Mandarino LT.Hyperglycemia normalizes insulin stimulate skeletal muscle glucose oxidation and storage in non-iinsulin dependent diabetes mellitus.J Clin Invest,1990,86:1999-2004
11，Defronzo RA.The triumvirate:beta-cell,muscle,liver:a collusion responsible for NIDDM.Diabetes,1988,37:667-687
12，Wick AN,Drury DR,Nakada HI,et al.Locatization of the primary metabolic blook produced by 2-deoxyglucose.J Biol Chem,1957,224:963-969
, 百拇医药
13，Fregchet P,Roth J,Neville DM.Insulin receptors in the liver sspecific binding of 125I-insulin to the plasma membrane and its relation to insulin bioactivity.Proc Nat Acad Sci,1971,68(8):1833-1837
14，吕宝璋，田英编著.受体学概论.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1991，49-53
15，Paolisso G,Howard BV.Role of non-esterified fatty acids in the pathogenesis of type 2 diabetes mllitus.Diabetic Med,1998,15:360-366
(2000-03-30收稿), http://www.100md.com