神经肌肉性疾病的病理与血液PCR检测线粒体DNA缺失分析
作者：伏洁 魏丽珠 刘光陵 郑晓刚
单位：伏洁(南京军区南京总医院儿科，江苏南京 210002)；魏丽珠(南京军区南京总医院儿科，江苏南京 210002)；刘光陵(南京军区南京总医院儿科，江苏南京 210002)；郑晓刚(南京军区南京总医院病理科，江苏南京 210002)
关键词：神经肌肉性疾病；肌肉活检；血PCR；线粒体肌病
医学研究生学报000402摘要： 目的：探讨神经肌肉性疾病的临床表现与病理、血液PCR检测之间的关系。 方法：采用肌肉活检病理检查与血液PCR 检测有无线粒体脱氧核糖核酸(mtDNA)缺失的方法，对20例神经肌肉性疾病患儿进行临床分析研究。 结果：神经肌肉性疾病主要表现为肌无力，肌肉病理检查多为非特异性的肌萎缩、肌营养不良改变，血PCR分析发现6例有mtDNA缺失。 结论：神经肌肉性疾病病因复杂、表现多样， 肌肉病理改变是该病发生的结果而不是原因，血液PCR 检测对线粒体肌病的诊断有很高的价值。
, http://www.100md.com
中图分类号： R746 文献标识码： A
文章编号： 1008-8199(2000)04-0216-02
PCR analysis of mitochondrial DNA deletion in children with neuromuscular diseases
FU Jie WEI Li-zhu LIU Guang-ling
(Department of Paediatrics)
ZHENG Xiao-gang
(Department of Pathology, Jinling Hospital, Nanjing 210002,Jiangsu,China)
, 百拇医药
Abstract: Objectives: To investigate the relationship between the clinic symptoms of neuromuscular diseases and muscle pathologic and mitochondrial DNA(mtDNA). Methods: 20 cases of neuromuscular diseases patients were analysed clinically by pathological biopsying in patients skeletal muscle and detecting whether existing mtDNA deletion by PCR assay. Results: The main clinical characteristics of neuromuscular diseases was muscle weakness,the results of muscle pathologic checking were atrophy not particularly and variation of malnutrition.It was detected existing mt DNA deletion in 6 cases by PCR assay. Conclusions:Neuromuscular diseases were complex on the pathogeny and varied on clinical characteristics. The changes of skeletal muscles were the result, not the cause of this diseases. The blood detecting with PCR method was of value to diagnose the mtDNA muscle disorders.
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Key words: Neuromuscular diseases； Muscle biopsying; PCR； Mitochondrial muscles disorders
0 引 言
神经肌肉性疾病是运动单位以及感觉性和自主神经周围性的病变，其临床表现较为复杂(主要为肌无力，病理性疲劳，感觉异常，自主神经功能异常，有时伴有中枢神经系统异常或眼病等表现)[1]。本研究从临床表现、肌肉病理检查、血液PCR检测等几个方面对该病作一初步分析。
1 对象与方法
1.1 对象 本组20例均为1996年1月至1997年5月间以肌无力为主要表现来儿科就诊者，其中男11例，女9例，年龄2.5～14(平均6)岁。 根据临床表现分为两组：一组为单纯表现为肌无力或运动无耐受性者，共10例，临床主要诊断为重症肌无力、神经肌病、进行性肌营养不良、多发性肌炎等；一组除肌无力表现外，尚伴有中枢神经功能障碍或眼病表现者，共10例。中枢神经功能障碍主要包括间歇性头痛、智力下降、局部或全身肌阵挛、小脑共济失调、失语、偏瘫等，眼病包括视力下降、眼肌麻痹、视神经病等，临床诊断为扭转痉挛、脑神经肌病、癫、痉挛性截瘫、线粒体肌病、劳蒙毕综合征(Laurence-Moon-Biedl syndrome)等。
, 百拇医药
1.2 病理检查 20例于就诊后即日作右侧腓肠肌活检，常规局麻下切开皮肤，分离皮下组织，切开肌膜，取骨骼肌组织0.5 g，均分2份，1份以甲醛溶液固定作光镜检查，另1份以戊二醛液固定作电镜观察。
1.3 血液PCR检测 用抗凝空针取外周静脉血5 ml，用碘化钠法提取基因组DNA(包括mtDNA)溶于TE，保存于冰箱，采用Perkin-Elmer公司2400热循环仪，上海华美生物工程公司PCR试剂盒，取0.3 μg DNA作为扩增模板，经PCR扩增反应后电泳观察结果，分析有无mtDNA缺失。
2 结 果
病理检查中，20例肌肉标本诊断为肌萎缩、 肌营养不良等改变。光镜下观察发现绝大部分(19例)活检标本呈现肌萎缩的非特异性改变，程度不等，主要表现肌纤维排列尚整齐，肌核多位于肌膜下呈丛集或短链状排列，未见明显坏死及炎细胞浸润，部分有代偿性肥大，部分有间质纤维组织及脂肪组织增生现象。光镜下仅1例呈现线粒体肌病的特征图像，为锯齿样红纤维(RRF)改变。电镜下肌纤维结构清晰，排列尚规则，各带结构完整,仅有2 例肌丝变性，结构欠清;有5例发现线粒体减少，体积变小， 糖原颗粒较少；有2例见脂滴增多，未见典型线粒体聚集现象。
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血液PCR分析结果6例有mtDNA缺失，缺失率达30%(6/20)
3 讨 论
神经肌肉性疾病是一组同时累及神经和肌肉的疾病，其临床表现多为肌无力、肌疲劳(指重复运动后出现肌力减退，但休息后症状减轻)、肌疼痛、肌强直、肌张力减低、腱反射亢进等；伴有中枢神经功能障碍或眼病表现者，则可出现局限性或全身肌阵挛、小脑共济失调、智力下降、失语、偏瘫、视力下降、眼肌麻痹等。对于大多数患者，根据病史及体格检查即可对该病作出诊断。但该病病因比较复杂，有遗传性、炎症性、内分泌性和代谢性、中毒性及其他如肿瘤等多种原因。
骨骼肌病理改变与其他组织一样不仅有其共性，而且也有其本身对损伤或疾病反应的特殊性。第一，肌纤维是由许多肌原纤维组成的，每块肌肉又由无数肌纤维组成，这意味着一种损害可以仅累及一条肌纤维或一块肌肉的一小部分， 或在疾病中一种先天性病灶可在肌肉的不同部位于不同时期表现出来。 第二，每条肌原纤维的80%由收缩成分的粗细肌丝组成，内含钙离子，其含量改变亦可导致肌肉继发性异常。第三，在评价病变肌肉的形态学变化要注意鉴别取材过程人为操作的影响。第四，发现特征性的病理变化对特殊疾病诊断有一定意义，但遗憾的是一般所见到的绝大多数变化都是非特异性的，如本次病理检查就是如此。不过有一点是共性的，在所有病理改变中绝大多数表现为不同程度的肌萎缩，占18/20，也有部分出现代偿性肌肥大、 脂肪及纤维组织增生等继发性的改变。电镜下仅见2例肌丝变性，结构欠清晰，5例出现线粒体减少、糖原颗粒较少等非特异性改变。 从而说明组织学检查对于该病并无特定的意义，因为神经及肌肉仅能以有限的方式对疾病过程发生反应[1]。
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在所有患神经肌肉疾病的患儿中，因线粒体生化功能异常而致病者则称为线粒体肌病。该病主要是由于线粒体DNA 发生突变或缺失引起氧化磷酸化过程障碍，从而导致肌无力及人体多系统多器官的功能障碍，出现复杂多样的临床症状[2]。 其病理光镜下特异性改变可见肌膜下有块状聚积，可见破碎的肌原纤维改变；电镜下可见线粒体呈多形型增大，部分可见包涵体存在。在本次观察中，病理改变仅有1 例出现RRF改变，而血液PCR检测却发现6例有mtDNA的缺失，说明PCR 分析作为特异性检测手段对线粒体肌病的诊断有很高的价值，但肌病理与血液检测之间有较大悬殊，分析其原因可能有：①细胞诱变所致，②线粒体DNA在不同组织中表达的特异性在肌肉中未测出， 有可能在神经组织中有表达[3]，而本实验未作神经组织检测。
在本观察中，有mtDNA缺失与无mtDNA缺失患儿的肌肉病理改变上未发现有明显不同，正说明病理改变是疾病发生的结果而不是原因。在本组20例患儿中即检出6例缺失， 可见在儿童发病中线粒体疾病实际的发病率比我们估计的要高，值得进一步广泛深入地研究下去。
, 百拇医药
伏洁(1969-),女,江苏阜宁人,医师,医学本科,从事儿科专业.
参考文献：
[1] 赵华月 主编.哈里逊内科学(下册)[M]. 北京:人民卫生出版社,1994.2448.
[2] Johns DR.Mitochondrial DNA and diseases[J].N Engl J Med, 1995,333(10):638-644.
[3] Handing AE.Neurological diseases and mitochondrial genes[J].Trends Neurosci,1991,14(4):132-138.
收稿日期：1999-12-28, 百拇医药
单位：伏洁(南京军区南京总医院儿科，江苏南京 210002)；魏丽珠(南京军区南京总医院儿科，江苏南京 210002)；刘光陵(南京军区南京总医院儿科，江苏南京 210002)；郑晓刚(南京军区南京总医院病理科，江苏南京 210002)
关键词：神经肌肉性疾病；肌肉活检；血PCR；线粒体肌病
医学研究生学报000402摘要： 目的：探讨神经肌肉性疾病的临床表现与病理、血液PCR检测之间的关系。 方法：采用肌肉活检病理检查与血液PCR 检测有无线粒体脱氧核糖核酸(mtDNA)缺失的方法，对20例神经肌肉性疾病患儿进行临床分析研究。 结果：神经肌肉性疾病主要表现为肌无力，肌肉病理检查多为非特异性的肌萎缩、肌营养不良改变，血PCR分析发现6例有mtDNA缺失。 结论：神经肌肉性疾病病因复杂、表现多样， 肌肉病理改变是该病发生的结果而不是原因，血液PCR 检测对线粒体肌病的诊断有很高的价值。
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中图分类号： R746 文献标识码： A
文章编号： 1008-8199(2000)04-0216-02
PCR analysis of mitochondrial DNA deletion in children with neuromuscular diseases
FU Jie WEI Li-zhu LIU Guang-ling
(Department of Paediatrics)
ZHENG Xiao-gang
(Department of Pathology, Jinling Hospital, Nanjing 210002,Jiangsu,China)
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Abstract: Objectives: To investigate the relationship between the clinic symptoms of neuromuscular diseases and muscle pathologic and mitochondrial DNA(mtDNA). Methods: 20 cases of neuromuscular diseases patients were analysed clinically by pathological biopsying in patients skeletal muscle and detecting whether existing mtDNA deletion by PCR assay. Results: The main clinical characteristics of neuromuscular diseases was muscle weakness,the results of muscle pathologic checking were atrophy not particularly and variation of malnutrition.It was detected existing mt DNA deletion in 6 cases by PCR assay. Conclusions:Neuromuscular diseases were complex on the pathogeny and varied on clinical characteristics. The changes of skeletal muscles were the result, not the cause of this diseases. The blood detecting with PCR method was of value to diagnose the mtDNA muscle disorders.
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Key words: Neuromuscular diseases； Muscle biopsying; PCR； Mitochondrial muscles disorders
0 引 言
神经肌肉性疾病是运动单位以及感觉性和自主神经周围性的病变，其临床表现较为复杂(主要为肌无力，病理性疲劳，感觉异常，自主神经功能异常，有时伴有中枢神经系统异常或眼病等表现)[1]。本研究从临床表现、肌肉病理检查、血液PCR检测等几个方面对该病作一初步分析。
1 对象与方法
1.1 对象 本组20例均为1996年1月至1997年5月间以肌无力为主要表现来儿科就诊者，其中男11例，女9例，年龄2.5～14(平均6)岁。 根据临床表现分为两组：一组为单纯表现为肌无力或运动无耐受性者，共10例，临床主要诊断为重症肌无力、神经肌病、进行性肌营养不良、多发性肌炎等；一组除肌无力表现外，尚伴有中枢神经功能障碍或眼病表现者，共10例。中枢神经功能障碍主要包括间歇性头痛、智力下降、局部或全身肌阵挛、小脑共济失调、失语、偏瘫等，眼病包括视力下降、眼肌麻痹、视神经病等，临床诊断为扭转痉挛、脑神经肌病、癫、痉挛性截瘫、线粒体肌病、劳蒙毕综合征(Laurence-Moon-Biedl syndrome)等。
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1.2 病理检查 20例于就诊后即日作右侧腓肠肌活检，常规局麻下切开皮肤，分离皮下组织，切开肌膜，取骨骼肌组织0.5 g，均分2份，1份以甲醛溶液固定作光镜检查，另1份以戊二醛液固定作电镜观察。
1.3 血液PCR检测 用抗凝空针取外周静脉血5 ml，用碘化钠法提取基因组DNA(包括mtDNA)溶于TE，保存于冰箱，采用Perkin-Elmer公司2400热循环仪，上海华美生物工程公司PCR试剂盒，取0.3 μg DNA作为扩增模板，经PCR扩增反应后电泳观察结果，分析有无mtDNA缺失。
2 结 果
病理检查中，20例肌肉标本诊断为肌萎缩、 肌营养不良等改变。光镜下观察发现绝大部分(19例)活检标本呈现肌萎缩的非特异性改变，程度不等，主要表现肌纤维排列尚整齐，肌核多位于肌膜下呈丛集或短链状排列，未见明显坏死及炎细胞浸润，部分有代偿性肥大，部分有间质纤维组织及脂肪组织增生现象。光镜下仅1例呈现线粒体肌病的特征图像，为锯齿样红纤维(RRF)改变。电镜下肌纤维结构清晰，排列尚规则，各带结构完整,仅有2 例肌丝变性，结构欠清;有5例发现线粒体减少，体积变小， 糖原颗粒较少；有2例见脂滴增多，未见典型线粒体聚集现象。
, http://www.100md.com
血液PCR分析结果6例有mtDNA缺失，缺失率达30%(6/20)
3 讨 论
神经肌肉性疾病是一组同时累及神经和肌肉的疾病，其临床表现多为肌无力、肌疲劳(指重复运动后出现肌力减退，但休息后症状减轻)、肌疼痛、肌强直、肌张力减低、腱反射亢进等；伴有中枢神经功能障碍或眼病表现者，则可出现局限性或全身肌阵挛、小脑共济失调、智力下降、失语、偏瘫、视力下降、眼肌麻痹等。对于大多数患者，根据病史及体格检查即可对该病作出诊断。但该病病因比较复杂，有遗传性、炎症性、内分泌性和代谢性、中毒性及其他如肿瘤等多种原因。
骨骼肌病理改变与其他组织一样不仅有其共性，而且也有其本身对损伤或疾病反应的特殊性。第一，肌纤维是由许多肌原纤维组成的，每块肌肉又由无数肌纤维组成，这意味着一种损害可以仅累及一条肌纤维或一块肌肉的一小部分， 或在疾病中一种先天性病灶可在肌肉的不同部位于不同时期表现出来。 第二，每条肌原纤维的80%由收缩成分的粗细肌丝组成，内含钙离子，其含量改变亦可导致肌肉继发性异常。第三，在评价病变肌肉的形态学变化要注意鉴别取材过程人为操作的影响。第四，发现特征性的病理变化对特殊疾病诊断有一定意义，但遗憾的是一般所见到的绝大多数变化都是非特异性的，如本次病理检查就是如此。不过有一点是共性的，在所有病理改变中绝大多数表现为不同程度的肌萎缩，占18/20，也有部分出现代偿性肌肥大、 脂肪及纤维组织增生等继发性的改变。电镜下仅见2例肌丝变性，结构欠清晰，5例出现线粒体减少、糖原颗粒较少等非特异性改变。 从而说明组织学检查对于该病并无特定的意义，因为神经及肌肉仅能以有限的方式对疾病过程发生反应[1]。
, http://www.100md.com
在所有患神经肌肉疾病的患儿中，因线粒体生化功能异常而致病者则称为线粒体肌病。该病主要是由于线粒体DNA 发生突变或缺失引起氧化磷酸化过程障碍，从而导致肌无力及人体多系统多器官的功能障碍，出现复杂多样的临床症状[2]。 其病理光镜下特异性改变可见肌膜下有块状聚积，可见破碎的肌原纤维改变；电镜下可见线粒体呈多形型增大，部分可见包涵体存在。在本次观察中，病理改变仅有1 例出现RRF改变，而血液PCR检测却发现6例有mtDNA的缺失，说明PCR 分析作为特异性检测手段对线粒体肌病的诊断有很高的价值，但肌病理与血液检测之间有较大悬殊，分析其原因可能有：①细胞诱变所致，②线粒体DNA在不同组织中表达的特异性在肌肉中未测出， 有可能在神经组织中有表达[3]，而本实验未作神经组织检测。
在本观察中，有mtDNA缺失与无mtDNA缺失患儿的肌肉病理改变上未发现有明显不同，正说明病理改变是疾病发生的结果而不是原因。在本组20例患儿中即检出6例缺失， 可见在儿童发病中线粒体疾病实际的发病率比我们估计的要高，值得进一步广泛深入地研究下去。
, 百拇医药
伏洁(1969-),女,江苏阜宁人,医师,医学本科,从事儿科专业.
参考文献：
[1] 赵华月 主编.哈里逊内科学(下册)[M]. 北京:人民卫生出版社,1994.2448.
[2] Johns DR.Mitochondrial DNA and diseases[J].N Engl J Med, 1995,333(10):638-644.
[3] Handing AE.Neurological diseases and mitochondrial genes[J].Trends Neurosci,1991,14(4):132-138.
收稿日期：1999-12-28, 百拇医药