苯丙-甲硫-精-苯丙氨酸多肽对豚鼠心室肌细胞Na＋／Ca2+交换尾电流的影响
作者：武冬梅 张炜芳 吕吉元 吴博威
单位：武冬梅(山西医科大学 030001)；张炜芳(山西医科大学 030001)；吕吉元(山西医科大学 030001)；吴博威(山西医科大学 030001)
关键词：苯丙-甲硫-精-苯丙氨酸多肽；膜片钳技术；心室肌细胞；Na+/Ca2+交换尾电流
山西医药杂志000210 摘 要：目的 研究苯丙-甲硫-精-苯丙氨酸(FMRFa)多肽对心肌细胞膜钙瞬变触发的Na+/Ca2+交换尾电流的影响。方法 采用蛋白酶E急性分离的豚鼠心室肌细胞。利用全细胞膜片钳技术观察FMRFa多肽对心肌细胞膜Na+/Ca2+交换尾电流的作用。结果 FMRFa多肽1、5、10、20 μm可分别抑制Na+/Ca2+交换尾电流(13±3)%，(25±7)%，(73±9)%和(110±10)%。结论 FMRFa多肽可剂量依赖性地抑制豚鼠心室肌细胞膜钙瞬变触发的Na+/Ca2+交换尾电流。
, http://www.100md.com
Effect of Phe-Met-Arg-Phe-NH2-related peptides on the Na+/Ca2+ exchange tail current in guinea pig ventricular myocytes
Wu Dongmei Zhang Weifang Lü Jiyuan et al
(Shanxi Medical University,Taiyuan，030001,China)
Abstract：Objective To study effect of Phe-Met-Arg-Phe-NH2(FMRFa)-related peptides on Na+/Ca2+ exchange tail current in single guinea pig ventricular myocytes;Method In isolated guinea pig ventricular myocytes,effect of FMRFa-related peptides on the Na+/Ca2+ exchange tail current was observed by the whole cell patch-clamp technique.Result FMRFa-related peptides 1、5、10、20 μm,inhibited Na+/Ca2+ exchange tail current by (13±3)%,(25±7)%,(73±9)% and (110±10)%,respectively.Conclusion FMRFa-related peptides can dose-dependently inhibit Na+/Ca2+ exchange tail current induced by calcium transient.
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Key words：FMRFa-related peptide; Patch-clamp technique; Ventricular myocyte；
Na+/Ca2+ exchange tail current
Na+/Ca2+交换体在调节心室肌细胞钙转运中起着非常重要的作用，该电流呈双向性，不仅排出兴奋收缩耦联经钙通道进入细胞的钙，而且还转运进入细胞内产生钙激活的肌浆网释放钙反应，进而触发兴奋收缩耦联[1]，由于它是以3Na+∶1Ca2+的比例进行交换，必然产生电现象[2]。但是，Na+/Ca2+交换体的细胞内活性，以及其催化和调节机制了解甚少。虽然氨氯吡咪及其衍生物作为Na+/Ca2+交换抑制剂已被证实[3]，但在生物医学实验中的应用受到一定的限制。其主要问题是氨氯吡咪及其衍生物同时可抑制其他转运系统(如Na+-K+-ATP酶，Na+-H+交换)[3]。因此，急需寻找一个选择性高，效应力强的Na+/Ca2+交换抑制剂。最近证明FMRFa多肽对神经轴突的Na+/Ca2+交换有抑制作用，然而FMRFa多肽是否对豚鼠心肌细胞膜的Na+/Ca2+交换尾电流有抑制作用未见报道。本文采用膜片钳技术，用急性分离的豚鼠心室肌细胞，观察FMRFa多肽对豚鼠心肌细胞膜钙瞬变触发的Na+/Ca2+交换尾电流的影响。
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1 材料与方法
1.1 单个豚鼠心室肌细胞急性分离：分离方法大致与文献[4]相同。豚鼠体重250～380 g，雌雄不拘(由山西医科大学实验动物中心提供)。经叩击枕部致昏后迅速开胸取出心脏，放入冰冷的无钙台氏液中，修剪后用无钙台氏液经主动脉逆行灌流，灌流液温度35～36℃并通以100% O2，灌流压70 mm H2O，8 min后改用加入蛋白酶E(pronase E)0.1 g/L，CaCl2 200 μmol/L和去脂肪酸牛血清白蛋白0.5 g/L的低钙台氏液消化5～7 min。将消化后的心肌剪碎，放入KB液中冷藏保存备用。
1.2 全细胞电压钳记录：将细胞悬液滴入倒置显微镜工作台上的灌流小室，细胞沉降后即可灌流，灌流速度为1 ml/min。温度为32℃台氏液。用常规全细胞电压钳方法[5]，记录单个心室肌细胞电流。电极电阻3～5 MΩ，内充电极内液。电流信号由Axopatch 200 A膜片钳放大器(Axon Instrument,美国)放大、滤波(滤波频率2 Hz)后经Lab master数据采集卡(Scientific Solution′s Incoporated,美国)贮存于计算机(AST 386)硬盘，刺激信号的控制，数据的采集和分析均由Pclamp 5.51软件(Axon Instrument,美国)完成。
, 百拇医药
1.3 溶液：台氏液成分(mmol/L)：NaCl 135.0，KCl 5.4,CaCl2 1.8，MgCl2 1.0，NaH2PO4 0.33，HEPES 10.0和葡萄糖10.0，用NaOH调酸度至pH 7.4。无钙台氏液除不含CaCl2外，其余与台氏液成分相同。电极内液成分(mmol/L):KCl 140.0，HEPES 5.0，EGTA 10.0，Na2ATP 2.0，MgCl2 1.0，用KOH调酸度至pH 7.3。KB液成份(mmol/L)：KOH 85.0，L-门冬氨酸50.0，KCl 30.0，牛磺酸20.0，KH2PO2 30.0，MgCl2 1.0，HEPES 10.0，葡萄糖10.0和EGTA 0.5，用KOH调酸度至pH 7.4。
1.4 药品：FMRFa多肽由上海生物制品研究院提供。蛋白酶E(E.Merck)，去脂肪酸牛血清白蛋白(Sigma)。
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2 结 果
FMRFa多肽对Na+/Ca2+交换尾电流的抑制作用：维持电压-40 mV，去极化至+10 mV，持续50 ms的阶跃脉冲激活Ca2+电流引起的Ca2+瞬变，脉冲频率0.2 Hz，Ca2+瞬变激活产电性钠/钙交换尾电流。钠/钙交换尾电流幅值以50 ms后的内相电流峰值与200 ms后的电流值之差计算。用不同浓度的FMRFa多肽灌流8 min后，显示出浓度依赖性抑制Na+/Ca2+交换尾电流，见表1。
表1 不同浓度FMRFa多肽对豚鼠心室肌细胞
Na+/Ca2+交换尾电流的抑制作用(
±s) FMRFa多肽
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μmol/L
Na+/Ca2+交换尾电流
pA
抑制
%
P值
0(对照)
334±21
1
294±18
13±3
<0.01
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5
267±17
25±5
<0.01
10
193±18
73±9
<0.01
20
158±8
110±10
<0.01
3 讨 论
, 百拇医药
在本研究中，我们首次证实了FMRFa多肽对钙瞬变触发的Na+/Ca2+交换尾电流的抑制作用。这与Khananshvili等[6]在心肌小泡上的作用相一致。而FMRFa多肽对其他离子通道(如Na+-K+-
ATP酶,Ca2+通道)的影响小。FMRFa多肽作为选择性高，效应力强的Na+/Ca2+交换抑制剂，对研究Na+/Ca2+交换体在生理和病理状态下的机能作用和研究药物对Na+/Ca2+交换体作用的构效关系都有重要意义。
作者简介：武冬梅，女，1952年12月生，副教授，山西医科大学，030001
参考文献：
, http://www.100md.com
1，Schulze D,Kofuji P,Hadley R,Kirby SM,et al.Sodium/calcium exchanger in heart muscle:molecular biology,cellular function,and its special role in excitation-contraction coupling.Cardiovasc Res,1993,27:1726-1734
2，Allan J,Kenneth WS,Osami K,et al.Depolarization-induced Ca entry via Na+-Ca2+ exchange triggers SR release in guinea pig cardiac myocytes.Am Physiol Society,1994,266:1422-433
3，Daniel K,Gilat S,Eveline WM,et al.Positively charged cyclic hexapeptides,novel blockers for the cardiac sarcolemma Na+-Ca2+ exchanger.J Biol Chem,1995,270(27):16182-16188
, 百拇医药
4，华 峥，王晓良.黄连素对豚鼠心肌钾离子通道的抑制作用.中国药学学报，1994，29：576
5，Harmill OP,Marty A,Neher E,et al.Improved patch-clamp technique for high-resolution current recording from cell and cell-free membrane patches.Pfluegers Arch,1981,391:85-100
6，Khananshvili D,Price DC,Greenberg MJ.Phe-Met-Arg-phe-NH2(FMRFa)-related peptides inhibits Na+-Ca2+ exchange in cardiac sarcolemmal vesicles.J Biol Chem,1993,268:200-205
7，Eylen FV,Gacrlet P,Vandermeers A,et al.Inhibition of Na+-Ca2+ exchange by Phe-Met-Arg-Phe-NH2(FMRFa)-related peptides in intact rat pancreatic B-cells.Mole Cellul Endocrinol,1994,106(1):1-5
收稿日期：1999-10-15, http://www.100md.com
单位：武冬梅(山西医科大学 030001)；张炜芳(山西医科大学 030001)；吕吉元(山西医科大学 030001)；吴博威(山西医科大学 030001)
关键词：苯丙-甲硫-精-苯丙氨酸多肽；膜片钳技术；心室肌细胞；Na+/Ca2+交换尾电流
山西医药杂志000210 摘 要：目的 研究苯丙-甲硫-精-苯丙氨酸(FMRFa)多肽对心肌细胞膜钙瞬变触发的Na+/Ca2+交换尾电流的影响。方法 采用蛋白酶E急性分离的豚鼠心室肌细胞。利用全细胞膜片钳技术观察FMRFa多肽对心肌细胞膜Na+/Ca2+交换尾电流的作用。结果 FMRFa多肽1、5、10、20 μm可分别抑制Na+/Ca2+交换尾电流(13±3)%，(25±7)%，(73±9)%和(110±10)%。结论 FMRFa多肽可剂量依赖性地抑制豚鼠心室肌细胞膜钙瞬变触发的Na+/Ca2+交换尾电流。
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Effect of Phe-Met-Arg-Phe-NH2-related peptides on the Na+/Ca2+ exchange tail current in guinea pig ventricular myocytes
Wu Dongmei Zhang Weifang Lü Jiyuan et al
(Shanxi Medical University,Taiyuan，030001,China)
Abstract：Objective To study effect of Phe-Met-Arg-Phe-NH2(FMRFa)-related peptides on Na+/Ca2+ exchange tail current in single guinea pig ventricular myocytes;Method In isolated guinea pig ventricular myocytes,effect of FMRFa-related peptides on the Na+/Ca2+ exchange tail current was observed by the whole cell patch-clamp technique.Result FMRFa-related peptides 1、5、10、20 μm,inhibited Na+/Ca2+ exchange tail current by (13±3)%,(25±7)%,(73±9)% and (110±10)%,respectively.Conclusion FMRFa-related peptides can dose-dependently inhibit Na+/Ca2+ exchange tail current induced by calcium transient.
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Key words：FMRFa-related peptide; Patch-clamp technique; Ventricular myocyte；
Na+/Ca2+ exchange tail current
Na+/Ca2+交换体在调节心室肌细胞钙转运中起着非常重要的作用，该电流呈双向性，不仅排出兴奋收缩耦联经钙通道进入细胞的钙，而且还转运进入细胞内产生钙激活的肌浆网释放钙反应，进而触发兴奋收缩耦联[1]，由于它是以3Na+∶1Ca2+的比例进行交换，必然产生电现象[2]。但是，Na+/Ca2+交换体的细胞内活性，以及其催化和调节机制了解甚少。虽然氨氯吡咪及其衍生物作为Na+/Ca2+交换抑制剂已被证实[3]，但在生物医学实验中的应用受到一定的限制。其主要问题是氨氯吡咪及其衍生物同时可抑制其他转运系统(如Na+-K+-ATP酶，Na+-H+交换)[3]。因此，急需寻找一个选择性高，效应力强的Na+/Ca2+交换抑制剂。最近证明FMRFa多肽对神经轴突的Na+/Ca2+交换有抑制作用，然而FMRFa多肽是否对豚鼠心肌细胞膜的Na+/Ca2+交换尾电流有抑制作用未见报道。本文采用膜片钳技术，用急性分离的豚鼠心室肌细胞，观察FMRFa多肽对豚鼠心肌细胞膜钙瞬变触发的Na+/Ca2+交换尾电流的影响。
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1 材料与方法
1.1 单个豚鼠心室肌细胞急性分离：分离方法大致与文献[4]相同。豚鼠体重250～380 g，雌雄不拘(由山西医科大学实验动物中心提供)。经叩击枕部致昏后迅速开胸取出心脏，放入冰冷的无钙台氏液中，修剪后用无钙台氏液经主动脉逆行灌流，灌流液温度35～36℃并通以100% O2，灌流压70 mm H2O，8 min后改用加入蛋白酶E(pronase E)0.1 g/L，CaCl2 200 μmol/L和去脂肪酸牛血清白蛋白0.5 g/L的低钙台氏液消化5～7 min。将消化后的心肌剪碎，放入KB液中冷藏保存备用。
1.2 全细胞电压钳记录：将细胞悬液滴入倒置显微镜工作台上的灌流小室，细胞沉降后即可灌流，灌流速度为1 ml/min。温度为32℃台氏液。用常规全细胞电压钳方法[5]，记录单个心室肌细胞电流。电极电阻3～5 MΩ，内充电极内液。电流信号由Axopatch 200 A膜片钳放大器(Axon Instrument,美国)放大、滤波(滤波频率2 Hz)后经Lab master数据采集卡(Scientific Solution′s Incoporated,美国)贮存于计算机(AST 386)硬盘，刺激信号的控制，数据的采集和分析均由Pclamp 5.51软件(Axon Instrument,美国)完成。
, 百拇医药
1.3 溶液：台氏液成分(mmol/L)：NaCl 135.0，KCl 5.4,CaCl2 1.8，MgCl2 1.0，NaH2PO4 0.33，HEPES 10.0和葡萄糖10.0，用NaOH调酸度至pH 7.4。无钙台氏液除不含CaCl2外，其余与台氏液成分相同。电极内液成分(mmol/L):KCl 140.0，HEPES 5.0，EGTA 10.0，Na2ATP 2.0，MgCl2 1.0，用KOH调酸度至pH 7.3。KB液成份(mmol/L)：KOH 85.0，L-门冬氨酸50.0，KCl 30.0，牛磺酸20.0，KH2PO2 30.0，MgCl2 1.0，HEPES 10.0，葡萄糖10.0和EGTA 0.5，用KOH调酸度至pH 7.4。
1.4 药品：FMRFa多肽由上海生物制品研究院提供。蛋白酶E(E.Merck)，去脂肪酸牛血清白蛋白(Sigma)。
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2 结 果
FMRFa多肽对Na+/Ca2+交换尾电流的抑制作用：维持电压-40 mV，去极化至+10 mV，持续50 ms的阶跃脉冲激活Ca2+电流引起的Ca2+瞬变，脉冲频率0.2 Hz，Ca2+瞬变激活产电性钠/钙交换尾电流。钠/钙交换尾电流幅值以50 ms后的内相电流峰值与200 ms后的电流值之差计算。用不同浓度的FMRFa多肽灌流8 min后，显示出浓度依赖性抑制Na+/Ca2+交换尾电流，见表1。
表1 不同浓度FMRFa多肽对豚鼠心室肌细胞
Na+/Ca2+交换尾电流的抑制作用(
±s) FMRFa多肽, http://www.100md.com
μmol/L
Na+/Ca2+交换尾电流
pA
抑制
%
P值
0(对照)
334±21
1
294±18
13±3
<0.01
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5
267±17
25±5
<0.01
10
193±18
73±9
<0.01
20
158±8
110±10
<0.01
3 讨 论
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在本研究中，我们首次证实了FMRFa多肽对钙瞬变触发的Na+/Ca2+交换尾电流的抑制作用。这与Khananshvili等[6]在心肌小泡上的作用相一致。而FMRFa多肽对其他离子通道(如Na+-K+-
ATP酶,Ca2+通道)的影响小。FMRFa多肽作为选择性高，效应力强的Na+/Ca2+交换抑制剂，对研究Na+/Ca2+交换体在生理和病理状态下的机能作用和研究药物对Na+/Ca2+交换体作用的构效关系都有重要意义。
作者简介：武冬梅，女，1952年12月生，副教授，山西医科大学，030001
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1，Schulze D,Kofuji P,Hadley R,Kirby SM,et al.Sodium/calcium exchanger in heart muscle:molecular biology,cellular function,and its special role in excitation-contraction coupling.Cardiovasc Res,1993,27:1726-1734
2，Allan J,Kenneth WS,Osami K,et al.Depolarization-induced Ca entry via Na+-Ca2+ exchange triggers SR release in guinea pig cardiac myocytes.Am Physiol Society,1994,266:1422-433
3，Daniel K,Gilat S,Eveline WM,et al.Positively charged cyclic hexapeptides,novel blockers for the cardiac sarcolemma Na+-Ca2+ exchanger.J Biol Chem,1995,270(27):16182-16188
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4，华 峥，王晓良.黄连素对豚鼠心肌钾离子通道的抑制作用.中国药学学报，1994，29：576
5，Harmill OP,Marty A,Neher E,et al.Improved patch-clamp technique for high-resolution current recording from cell and cell-free membrane patches.Pfluegers Arch,1981,391:85-100
6，Khananshvili D,Price DC,Greenberg MJ.Phe-Met-Arg-phe-NH2(FMRFa)-related peptides inhibits Na+-Ca2+ exchange in cardiac sarcolemmal vesicles.J Biol Chem,1993,268:200-205
7，Eylen FV,Gacrlet P,Vandermeers A,et al.Inhibition of Na+-Ca2+ exchange by Phe-Met-Arg-Phe-NH2(FMRFa)-related peptides in intact rat pancreatic B-cells.Mole Cellul Endocrinol,1994,106(1):1-5
收稿日期：1999-10-15, http://www.100md.com