插入突变法构建人肝细胞生长因子β链可表达基因序列
作者：解军 牛勃 吴玲 王惠珍 程牛亮 常冰梅 杨涛
单位：解军(山西医科大学生物化学与分子生物学教研室 太原 030001)；牛勃(山西医科大学生物化学与分子生物学教研室 太原 030001)；吴玲(太原市卫生防疫站稽察科)；王惠珍(山西医科大学生物化学与分子生物学教研室 太原 030001)；程牛亮(山西医科大学生物化学与分子生物学教研室 太原 030001)；常冰梅(山西医科大学生物化学与分子生物学教研室 太原 030001)；杨涛(山西医科大学生物化学与分子生物学教研室 太原 030001)
关键词：肝细胞生长因子；诱变，插入；肝细胞生长因子β基因；基因序列
山西医科大学学报000202 摘要：目的 通过插入突变法，转录前加工、修饰人肝细胞生长因子β基因，构建人肝细胞生长因子β基因的可表达全序列，以使肝细胞生长因子β基因可在细胞内单独表达，用于研究肝细胞生长因子β基因在生物体内的生物学作用。方法 从人肝细胞中提取总RNA，反转录成为含肝细胞生长因子β结构基因区序列的cDNA,在此cDNA序列结构基因区前插入翻译起始密码子、SD序列、SD序列间隔等调节序列和限制性内切酶接头；PCR扩增β基因；并对肝细胞生长因子β基因可表达全序列测序。结果和结论 成功地构建并扩增了肝细胞生长因子β基因可表达全序列。经序列分析，结果正确。
, http://www.100md.com
中图分类号：Q754 文献标识码：A
文章编号：1007-6611(2000)02-0098-03
Constructing human hepatocyte growth factor β expressible gene sequence by inserting genetic code mutation
Xie Jun,Niu Bo,Wu Ling,et al
(Dept. of Biochemistry and Molecular Biology,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001)
Abstract: Objective Human hepatocyte growth factor β expressible gene sequence was constructed by the method of inserting genetic code mutated element and was modified and proceeded before transcription.Methods Total RNA sequence of human hepatocyte growth factor β was extracted from human hepatocyte cells.Then,an inserting control element box,including translating initial code ATG,SD sequence and SD sequence interval,restriction enzyme joint,was added in the front of structural genes of human hepatocyte growth factor β.Human hepatocyte growth factor β was proliferated by PCR and then was sequenced.Results and Conclusion Human hepatocyte growth factor β expressible whole gene sequence was succeeded to construct,and its sequence was affirmed correct by sequence analysis.
, 百拇医药
Key words: hepatocyte growth factor; mutagenesis，insertional; hepatocyte growth factor β gene； gene sequence 肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)是人体内一个重要的生长因子。对多类细胞的增殖、趋散具有调控作用，是目前研究的热点[1，2]。野生型HGF是异源蛋白二聚体。在人体内，HGF全序列基因首先表达成一条由728个氨基酸组成的无活性的前体初肽，称为前初HGF(pre-pro-HGF)。该前初蛋白经过翻译后加工程序，在第440位Arg后和493位Ser前剪切，形成两条单链，α链由440个氨基酸组成，β链由230个氨基酸组成。两条链在空间盘曲、折绕，形成具有活性的野生HGF结构[2]。
目前认为，HGFβ链在其信号传导中发挥重要作用，其具体的作用机制尚不明确。由于HGF基因结构的特点，使HGFβ在细胞内无法单独直接表达。我们应用插入突变法成功地加工、修饰了HGFβ链基因，使之成为可表达的完整DNA序列。研究内容报道如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 大肠杆菌菌株：Plyss由本室冻存。质粒：pBV220:全长3.66 kb，含有EcoRI、smaLⅠ、BamHⅠ、SalI、HincⅡ、PstI、HandⅢ多克隆位点区，上游串联λ噬菌体PL、PR启动子，下游为核糖体基因终止信号，氨苄抗性。由本室冻存。组织：胎肝组织为水囊引产6月胎龄组织。
1.1.2 工具酶和试剂 限制性内切酶SamLⅠ、EcoRⅠ、BgLⅡ、HandⅢ、PstⅠ由Promega公司提供，T4连接酶，RNase、DNase、逆转录酶、Taq酶由GENE公司提供。RCR产物DNA分离魔力柱系统试剂盒(Wizard PCR Preps DNA Purification System)由Promega公司提供。DNA Marker由华美公司提供。其他试剂均为实验室专用分析纯。
, 百拇医药
1.1.3 引物
上游：5′-CATACCCGGGATGGTTGTAAATGGGATT -3′
下游：5′-ACATCTGCAGCTTCAGCTATGACTGT -3′
1.2 实验方法
1.2.1 HGF-β基因结构分析 从GENEBANK获取HGF cDNA全序列，应用基因分析软件GOLDKEY、GENEPRO、OLIGO分析HGF-β基因序列的结构基因区、调节基因区、翻译起始位点、翻译终止位点及基因的限制性内切酶谱。
1.2.2 HGF-β基因的插入突变引物设计 根据HGF-β基因序列分析结果，选择插入突变序列，包括正确的限制性内切酶接头、翻译调节序列、SD序列间隔、翻译起始密码子、翻译终止密码子等序列。
, http://www.100md.com
在引物设计软件PRIMER上确定HGF-β的阅读框架。对HGF-β基因酶切图谱进行分析，结合载体基因多克隆位点区及载体基因酶切图谱的特点，确定被研究基因两端限制性内切酶。设计了一端平头，一端粘头的定向克隆接头。
引物由上海生物工程有限公司合成。
1.2.3 人HGF-β基因完整表达序列的获得
1.2.3.1 人胎肝总RNA提取 取新鲜去被膜胎肝组织约1 g，在-70℃冰箱中速冻后，研磨粉碎，其后按Rneasy Total RNA kit Protocol进行。
1.2.3.2 反转录合成人HGF-β基因cDNA 将RNA逆转录为cDNA，逆转录成分如下：RNA提取物3 μl，200 U/μl的M-MLV逆转录酶1 μl，10 mmol/L各种dNTP2 μl，10×buffer2 μl，25 U/μl的RNasin 1 μl，330 mg/L P2(20)1 μl,共20 μl,混匀后37℃反应1 h，再经95℃ 5 min终止反应。
, http://www.100md.com
1.2.3.3 PCR扩增人HGF-β基因可表达序列 HGF-β基因cDNA作为PCR模板。PCR反应体系的总体积为50 μl，含模板10 μl，dNTP0.5 μl,primer (0.2 μmol/L)0.5 μl,10×buffer 5 μl,Taq酶(5 U/μl)0.8 μl,dH2O33.2 μl。第一步：94℃40 s启动Taq酶；第二步：92℃变性40 s；第三步：退火40℃ 40 s；第四步：延伸75℃1 min 30 s；第五步：循环35次。
2%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增带。
1.2.3.4 构建HGF-β克隆载体及HGF-β基因序列分析[4，5] 参照Molecular Cloning和现代分子生物学技术[4，5]的方法重组HGF-β基因，构建重组人HGF-β克隆载体并命名为PBJ4-HGFβ。PBJ4-HGFβ用正反向引物测序，重复2次。结果用PCGENE分析软件分析并与GENEBANK序列进行对比分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 HGF-β基因结构分析结果 通过对翻译调节序列、SD序列间隔、翻译起始密码子、翻译终止密码子等调节序列区元件及HGF-β的阅读框架和HGF-β基因酶切图谱的分析，确定了SmaLⅠ、PstⅠ作为限制性内切酶接头。在HGF-β基因序列前插入了翻译起始序列ATG和SD序列及SD序列间隔。设计并合成引物如下：
上游引物为：
5′-CATACCCGGGATGGTTGTAAATGGGATT -3′
下游引物为：
5′-ACATCTGCAGCTTCAGCTATGACTGT -3′
2.2 RT-PCR扩增结果 以总RNA为模板，15聚T寡核苷酸作为引物合成cDNA第一链，然后用设计的一对引物进行PCR扩增。结果见图1。
, http://www.100md.com
图1 HGF-βPCR扩增片断电泳图谱
从图1中可以看出：PCR产物是约为700 bp的双链DNA。与设计的HGFβ基因一致。
2.3 HGF-β基因的序列分析
HGF-β的基因序列为：
1gttgtaaatg ggattccaac acgaacaaac ataggatgga tggttagttt gagatacaga
61aataaacata tctgcggagg atcattgata aaggagagtt gggttcttac tgcacgacag
121tgtttccctt ctcgagactt gaaagattat gaagcttggc ttggaattca tgatgtccac
, http://www.100md.com
181ggaagaggag atgagaaatg caaacaggtt ctcaatgttt cccagctggt atatggccct
241gaaggatcag atctggtttt aatgaagctt gccaggcctg ctgtcctgga tgattttgtt
301agtacgattg atttacctaa ttatggatgc acaattcctg aaaagaccag ttgcagtgtt
361tatggctggg gctacactgg attgatcaac tatgatggcc tattacgagt ggcacatctc
421tatataatgg gaaatgagaa atgcagccag catcatcgag ggaaggtgac tctgaatgag
, 百拇医药
481tctgaaatat gtgctggggc tgaaaagatt ggatcaggac catgtgaggg ggattatggt
541ggcccacttg tttgtgagca acataaaatg agaatggttc ttggtgtcat tgttcctggt
601cgtggatgtg ccattccaaa tcgtcctggt atttttgtcc gagtagcata ttatgcaaaa
661tggatacaca aaattatttt aacatataag gtaccacagt catag
测定序列与GENEBANK中HGF的cDNA序列[序列号为M60718，长度为2306，cds=(72,2258)]的(1151，2259)区域的序列完全同源。与文献[1]报道一致。
, 百拇医药
3 讨论
3.1 在构建肝细胞生长因子β基因的可表达的完整基因序列时，对肝细胞生长因子β基因调节区的修饰加工是该工作的关键，我们在肝细胞生长因子β基因结构区序列前插入了翻译起始密码子ATG成为其表达起始的关键；恰当的SD序列及SD序列间隔是翻译起始及提高翻译效率的保证；安全的限制性内切酶接头是肝细胞生长因子β基因重组体构建的基础。
3.2 在真核细胞中，肝细胞生长因子原初表达产物是无活性的前体肽(pre-pro-HGF)，而活性形式为α、β两条多肽子链的聚合体，该聚合体的形成是在真核体系翻译后加工、修饰系统的作用下，由蛋白酶系酶解作用，切掉中间53个氨基酸而形成的。在肝细胞生长因子的表达过程中，β基因总是伴随α基因表达。β基因自身无转录起始序列、翻译起始序列和调节区，在人肝细胞中，单独直接表达肝细胞生长因子 β链蛋白是不可能的，这种状况影响了直接研究肝细胞生长因子β基因和蛋白在细胞中的生物学作用。我们通过对肝细胞生长因子β基因插入突变，修饰加工，构建了肝细胞生长因子β基因的可表达的完整基因序列。进一步，可通过转基因技术将肝细胞生长因子β基因的可表达完整序列注射入细胞体内，用于直接研究肝细胞生长因子β基因和蛋白的生物学功能及作用机制。
, 百拇医药
作者简介：解军，男，1968年6月生，硕士在读，讲师
参考文献：
[1] 牛勃.人肝细胞生长因子在CHO细胞中的表达.见：沈主编.医学分子生物学进展论文集(二)[M].北京：高等教育出版社，施普林格出版社，1999.117～119.
[2] Nakamura T，Nishizawa T，Hagiya M，et al.Molecular cloning and expression of human hepatocyte growth factor[J].Nature，1989，342:440～443.
[3] Jiang WG,Hicox S.Hepatocyte growth factor/Scatter factor,a cytokine playing multiple and converse roles[J]. Histrol Histopathol，1997,12(2):537～555.
[4] 卢圣栋.现代分子生物学实验技术[M].北京：高等教育出版社，1993.50，71，107.
[5] Sambrook J,Fritsh EF,Maniatis T.Molecular cloning[M].New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.16,34,304,672.
收稿日期：1999-11-29, http://www.100md.com
单位：解军(山西医科大学生物化学与分子生物学教研室 太原 030001)；牛勃(山西医科大学生物化学与分子生物学教研室 太原 030001)；吴玲(太原市卫生防疫站稽察科)；王惠珍(山西医科大学生物化学与分子生物学教研室 太原 030001)；程牛亮(山西医科大学生物化学与分子生物学教研室 太原 030001)；常冰梅(山西医科大学生物化学与分子生物学教研室 太原 030001)；杨涛(山西医科大学生物化学与分子生物学教研室 太原 030001)
关键词：肝细胞生长因子；诱变，插入；肝细胞生长因子β基因；基因序列
山西医科大学学报000202 摘要：目的 通过插入突变法，转录前加工、修饰人肝细胞生长因子β基因，构建人肝细胞生长因子β基因的可表达全序列，以使肝细胞生长因子β基因可在细胞内单独表达，用于研究肝细胞生长因子β基因在生物体内的生物学作用。方法 从人肝细胞中提取总RNA，反转录成为含肝细胞生长因子β结构基因区序列的cDNA,在此cDNA序列结构基因区前插入翻译起始密码子、SD序列、SD序列间隔等调节序列和限制性内切酶接头；PCR扩增β基因；并对肝细胞生长因子β基因可表达全序列测序。结果和结论 成功地构建并扩增了肝细胞生长因子β基因可表达全序列。经序列分析，结果正确。
, http://www.100md.com
中图分类号：Q754 文献标识码：A
文章编号：1007-6611(2000)02-0098-03
Constructing human hepatocyte growth factor β expressible gene sequence by inserting genetic code mutation
Xie Jun,Niu Bo,Wu Ling,et al
(Dept. of Biochemistry and Molecular Biology,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001)
Abstract: Objective Human hepatocyte growth factor β expressible gene sequence was constructed by the method of inserting genetic code mutated element and was modified and proceeded before transcription.Methods Total RNA sequence of human hepatocyte growth factor β was extracted from human hepatocyte cells.Then,an inserting control element box,including translating initial code ATG,SD sequence and SD sequence interval,restriction enzyme joint,was added in the front of structural genes of human hepatocyte growth factor β.Human hepatocyte growth factor β was proliferated by PCR and then was sequenced.Results and Conclusion Human hepatocyte growth factor β expressible whole gene sequence was succeeded to construct,and its sequence was affirmed correct by sequence analysis.
, 百拇医药
Key words: hepatocyte growth factor; mutagenesis，insertional; hepatocyte growth factor β gene； gene sequence 肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)是人体内一个重要的生长因子。对多类细胞的增殖、趋散具有调控作用，是目前研究的热点[1，2]。野生型HGF是异源蛋白二聚体。在人体内，HGF全序列基因首先表达成一条由728个氨基酸组成的无活性的前体初肽，称为前初HGF(pre-pro-HGF)。该前初蛋白经过翻译后加工程序，在第440位Arg后和493位Ser前剪切，形成两条单链，α链由440个氨基酸组成，β链由230个氨基酸组成。两条链在空间盘曲、折绕，形成具有活性的野生HGF结构[2]。
目前认为，HGFβ链在其信号传导中发挥重要作用，其具体的作用机制尚不明确。由于HGF基因结构的特点，使HGFβ在细胞内无法单独直接表达。我们应用插入突变法成功地加工、修饰了HGFβ链基因，使之成为可表达的完整DNA序列。研究内容报道如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 大肠杆菌菌株：Plyss由本室冻存。质粒：pBV220:全长3.66 kb，含有EcoRI、smaLⅠ、BamHⅠ、SalI、HincⅡ、PstI、HandⅢ多克隆位点区，上游串联λ噬菌体PL、PR启动子，下游为核糖体基因终止信号，氨苄抗性。由本室冻存。组织：胎肝组织为水囊引产6月胎龄组织。
1.1.2 工具酶和试剂 限制性内切酶SamLⅠ、EcoRⅠ、BgLⅡ、HandⅢ、PstⅠ由Promega公司提供，T4连接酶，RNase、DNase、逆转录酶、Taq酶由GENE公司提供。RCR产物DNA分离魔力柱系统试剂盒(Wizard PCR Preps DNA Purification System)由Promega公司提供。DNA Marker由华美公司提供。其他试剂均为实验室专用分析纯。
, 百拇医药
1.1.3 引物
上游：5′-CATACCCGGGATGGTTGTAAATGGGATT -3′
下游：5′-ACATCTGCAGCTTCAGCTATGACTGT -3′
1.2 实验方法
1.2.1 HGF-β基因结构分析 从GENEBANK获取HGF cDNA全序列，应用基因分析软件GOLDKEY、GENEPRO、OLIGO分析HGF-β基因序列的结构基因区、调节基因区、翻译起始位点、翻译终止位点及基因的限制性内切酶谱。
1.2.2 HGF-β基因的插入突变引物设计 根据HGF-β基因序列分析结果，选择插入突变序列，包括正确的限制性内切酶接头、翻译调节序列、SD序列间隔、翻译起始密码子、翻译终止密码子等序列。
, http://www.100md.com
在引物设计软件PRIMER上确定HGF-β的阅读框架。对HGF-β基因酶切图谱进行分析，结合载体基因多克隆位点区及载体基因酶切图谱的特点，确定被研究基因两端限制性内切酶。设计了一端平头，一端粘头的定向克隆接头。
引物由上海生物工程有限公司合成。
1.2.3 人HGF-β基因完整表达序列的获得
1.2.3.1 人胎肝总RNA提取 取新鲜去被膜胎肝组织约1 g，在-70℃冰箱中速冻后，研磨粉碎，其后按Rneasy Total RNA kit Protocol进行。
1.2.3.2 反转录合成人HGF-β基因cDNA 将RNA逆转录为cDNA，逆转录成分如下：RNA提取物3 μl，200 U/μl的M-MLV逆转录酶1 μl，10 mmol/L各种dNTP2 μl，10×buffer2 μl，25 U/μl的RNasin 1 μl，330 mg/L P2(20)1 μl,共20 μl,混匀后37℃反应1 h，再经95℃ 5 min终止反应。
, http://www.100md.com
1.2.3.3 PCR扩增人HGF-β基因可表达序列 HGF-β基因cDNA作为PCR模板。PCR反应体系的总体积为50 μl，含模板10 μl，dNTP0.5 μl,primer (0.2 μmol/L)0.5 μl,10×buffer 5 μl,Taq酶(5 U/μl)0.8 μl,dH2O33.2 μl。第一步：94℃40 s启动Taq酶；第二步：92℃变性40 s；第三步：退火40℃ 40 s；第四步：延伸75℃1 min 30 s；第五步：循环35次。
2%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增带。
1.2.3.4 构建HGF-β克隆载体及HGF-β基因序列分析[4，5] 参照Molecular Cloning和现代分子生物学技术[4，5]的方法重组HGF-β基因，构建重组人HGF-β克隆载体并命名为PBJ4-HGFβ。PBJ4-HGFβ用正反向引物测序，重复2次。结果用PCGENE分析软件分析并与GENEBANK序列进行对比分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 HGF-β基因结构分析结果 通过对翻译调节序列、SD序列间隔、翻译起始密码子、翻译终止密码子等调节序列区元件及HGF-β的阅读框架和HGF-β基因酶切图谱的分析，确定了SmaLⅠ、PstⅠ作为限制性内切酶接头。在HGF-β基因序列前插入了翻译起始序列ATG和SD序列及SD序列间隔。设计并合成引物如下：
上游引物为：
5′-CATACCCGGGATGGTTGTAAATGGGATT -3′
下游引物为：
5′-ACATCTGCAGCTTCAGCTATGACTGT -3′
2.2 RT-PCR扩增结果 以总RNA为模板，15聚T寡核苷酸作为引物合成cDNA第一链，然后用设计的一对引物进行PCR扩增。结果见图1。
, http://www.100md.com
图1 HGF-βPCR扩增片断电泳图谱
从图1中可以看出：PCR产物是约为700 bp的双链DNA。与设计的HGFβ基因一致。
2.3 HGF-β基因的序列分析
HGF-β的基因序列为：
1gttgtaaatg ggattccaac acgaacaaac ataggatgga tggttagttt gagatacaga
61aataaacata tctgcggagg atcattgata aaggagagtt gggttcttac tgcacgacag
121tgtttccctt ctcgagactt gaaagattat gaagcttggc ttggaattca tgatgtccac
, http://www.100md.com
181ggaagaggag atgagaaatg caaacaggtt ctcaatgttt cccagctggt atatggccct
241gaaggatcag atctggtttt aatgaagctt gccaggcctg ctgtcctgga tgattttgtt
301agtacgattg atttacctaa ttatggatgc acaattcctg aaaagaccag ttgcagtgtt
361tatggctggg gctacactgg attgatcaac tatgatggcc tattacgagt ggcacatctc
421tatataatgg gaaatgagaa atgcagccag catcatcgag ggaaggtgac tctgaatgag
, 百拇医药
481tctgaaatat gtgctggggc tgaaaagatt ggatcaggac catgtgaggg ggattatggt
541ggcccacttg tttgtgagca acataaaatg agaatggttc ttggtgtcat tgttcctggt
601cgtggatgtg ccattccaaa tcgtcctggt atttttgtcc gagtagcata ttatgcaaaa
661tggatacaca aaattatttt aacatataag gtaccacagt catag
测定序列与GENEBANK中HGF的cDNA序列[序列号为M60718，长度为2306，cds=(72,2258)]的(1151，2259)区域的序列完全同源。与文献[1]报道一致。
, 百拇医药
3 讨论
3.1 在构建肝细胞生长因子β基因的可表达的完整基因序列时，对肝细胞生长因子β基因调节区的修饰加工是该工作的关键，我们在肝细胞生长因子β基因结构区序列前插入了翻译起始密码子ATG成为其表达起始的关键；恰当的SD序列及SD序列间隔是翻译起始及提高翻译效率的保证；安全的限制性内切酶接头是肝细胞生长因子β基因重组体构建的基础。
3.2 在真核细胞中，肝细胞生长因子原初表达产物是无活性的前体肽(pre-pro-HGF)，而活性形式为α、β两条多肽子链的聚合体，该聚合体的形成是在真核体系翻译后加工、修饰系统的作用下，由蛋白酶系酶解作用，切掉中间53个氨基酸而形成的。在肝细胞生长因子的表达过程中，β基因总是伴随α基因表达。β基因自身无转录起始序列、翻译起始序列和调节区，在人肝细胞中，单独直接表达肝细胞生长因子 β链蛋白是不可能的，这种状况影响了直接研究肝细胞生长因子β基因和蛋白在细胞中的生物学作用。我们通过对肝细胞生长因子β基因插入突变，修饰加工，构建了肝细胞生长因子β基因的可表达的完整基因序列。进一步，可通过转基因技术将肝细胞生长因子β基因的可表达完整序列注射入细胞体内，用于直接研究肝细胞生长因子β基因和蛋白的生物学功能及作用机制。
, 百拇医药
作者简介：解军，男，1968年6月生，硕士在读，讲师
参考文献：
[1] 牛勃.人肝细胞生长因子在CHO细胞中的表达.见：沈主编.医学分子生物学进展论文集(二)[M].北京：高等教育出版社，施普林格出版社，1999.117～119.
[2] Nakamura T，Nishizawa T，Hagiya M，et al.Molecular cloning and expression of human hepatocyte growth factor[J].Nature，1989，342:440～443.
[3] Jiang WG,Hicox S.Hepatocyte growth factor/Scatter factor,a cytokine playing multiple and converse roles[J]. Histrol Histopathol，1997,12(2):537～555.
[4] 卢圣栋.现代分子生物学实验技术[M].北京：高等教育出版社，1993.50，71，107.
[5] Sambrook J,Fritsh EF,Maniatis T.Molecular cloning[M].New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.16,34,304,672.
收稿日期：1999-11-29, http://www.100md.com