慢性粒细胞白血病和真性红细胞增多症bcr/abl融合基因表达及临床意义
作者：陈燕 李惠玉 吴裕丹
单位：同济医科大学附属协和医院血液病研究所 邮政编码：武汉，430022
关键词：白血病，慢性/粒细胞；红细胞，真性/增多症；bcr/abl基因
临床血液学杂志990405 摘要 目的：探讨慢性粒细胞白血病和真性红细胞增多症bcr/abl融合基因出现的频率及临床意义。方法：采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术，研究了慢性粒细胞白血病(CML)、真性红细胞增多症(PV)bcr/abl基因的变化。结果：48例慢性期CML，43例呈现bcr/abl基因阳性，占89.6%，14例加速，急变期CML，6例出现bcr/abl基因，阳性率为42.9%，与慢性期CML相比P<0.01；10例PV出现1例bcr/abl基因阳性，占10.0%。结论：bcr/abl基因检测对于CML的临床分型有重要意义，bcr/abl阴性的CML预后差，而bcr/abl基因的阳性有助于初诊时的CML急变与急性非淋巴细胞白血病(AML)M2的鉴别和CML与慢性粒单细胞白血病(CMML)的鉴别。
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Expression of Bcr/abl Fusion Gene in Chronic Myelogenous Leukemia,Polycythemia Vera and Their Clinical Significance
Chen Yan,Li Huiyu,Wu Yudan
Institute of Hematology,Union Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430022
Abstract Objective:To study on frequencies of bcr/abl fusion gene in chronic myelogenous leukemia,polycythemia vera and their clinical significance.Method:Using RT-PCR technique,the change of bcr/abl genes in chronic myelogenous leukemia (CML) and polycythemia vera (PV) were investigated.Result:43 cases showed positive bcr/abl gene out of 48 cases of chronic phase with CML.It accounted for 90%.6 cases showed positive bcr/abl gene out of 14 cases of accelerated phase and blast crisis of CML.It accounted for 43%.Compared with chronic phase,there was statistical difference.(P<0.01)1 case showed positive bcr/abl gene out of 10 cases with PV.It accounted for 10%.Conclusion:There was an important clinical typing significance in CML using bcr/abl gene detecting technique.The prognosis showed worse in patients of negative bcr/abl gene.When bcr/abl gene showed positive,it contributed to differential diagnosis in blast crisis of CML and acute myelogenous leukemia (AML) M2 subtype at the first diagnosis,and in CML and chronic myelomonocytic leukemia (CMML).
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Key words Leaukemia Chronic/Myelogenous Polycythemia vera Bcr/abl gene
abl为一原癌基因，位于9号染色体q34，基因产物是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶，但通常没有激酶活性。bcr基因位于22
号染色体q11，正常的bcr基因产物是160Kd的胞质磷酸蛋白。由于t(9；22)(q34；q11)的易位，形成bcr/abl融合基因，其能编码P210融合蛋白，它的表达，激活了酪氨酸蛋白激酶活性，改变了细胞的蛋白酪氨酸磷酸化水平和肌动蛋白结合能力，从而扰乱了正常的信号传导途径，使细胞失去了对周围环境的反应性，从而抑制了凋亡的发生〔1〕。t(9；22)(q34；q11)是慢性粒细胞白血病(CML)的标记染色体，即Ph染色体，所以bcr/abl融合基因的出现在诊断CML中有决定性意义，然而真性红细胞增多症是否有bcr/abl融合基因，慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的出现有何鉴别诊断和预后意义，对此我们进行了较深入的研究，现将结果报道如下。
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1 材料和方法
1.1 病例 本院1996年6月～1998年6月门诊和住院病人。慢性粒细胞白血病(CML)62例，男32例，女30例，年龄19～62岁，其中慢性期48例，加速、急变期14例。真性红细胞增多症(PV)10例，男8例，女2例，年龄35～53岁。全部病例诊断符合全国统一标准。
1.2 RT-PCR扩增 CML诊断试剂盒购于上海复兴高科技有限公司。①取患者血1 ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离出有核细胞，异硫氢酸胍一步法提取RNA。②第1次PCR扩增：将反应液A(含引物，四种dNTP)14 μl，加1 μl的RNA酶，2 μl的反转录酶，加3 μl RNA，总反应体系20 μl，按下列条件进行扩增：42℃保温30 min后，93℃变性45 s，55℃煺火45 s，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸5 min。③第2次PCR扩增：将17 μl反应液B加入1 μl的Taq酶中，再加入2 μl的第1次扩增产物，总体积20 μl作PCR扩增，条件同前。④PCR产物检测：将第2次PCR产物10 μl，加样于含EB染色剂的2%琼脂糖中电泳20～30 min(5 V/cm)，在紫外光分析仪上检测结果。每次实验均有阳性对照和阴性对照，只有阳性对照为阳性，阴性对照为阴性时结果才视为可靠。
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2 结果
2.1 bcr/abl基因扩增的结果 见表1。CML慢性期和加速、急变期bcr/abl基因阳性率比较P<0.01。
附表 慢性粒细胞白血病、真性红细胞增多症bcr/abl基因出现的频率 分组
例数
bcr/
abl(+)
%
bcr/
abl(-)
%
CML慢性期
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48
43
89.58
5
10.42
CML加速，急变期
14
6
42.85
8
57.15
PV
10
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1
10.00
9
90.00
2.2 确诊情况 临床有2例患者首次骨髓细胞学诊断为急性非淋巴细胞白血病(AML)M2型，因患者脾肿大而高度怀疑为CML急变，经bcr/abl基因检测为阳性，得到确诊。另有1例院外诊断为CML的患者，因外周血单核细胞绝对数>1.8×109/L，临床高度怀疑为慢性粒单细胞性白血病(CMML)，经PCR检测bcr/abl基因为阴性得到确诊。
3 讨论
约有5%～10% CML Ph染色体为阴性，其中1/3的患者bcr/abl基因为阳性。现已知CML BCR断裂点从集区有三种形式，即m-bcr，编码蛋白为P210，我们检测的即为此种：m-bcr，编码蛋白为P190；μ-bcr，编码蛋白为P230〔2〕。我们的结果：48例CML中，bcr/abl阳性者90%，略低于文献报道，但如能同时检测P190和P230，则可能提高bcr/abl的阳性率。在14例CML加速，急变期的病人中bcr/abl基因阳性率仅43%，和慢性期病人比较P<0.01，这就说明bcr/abl阴性者病情易恶化。文献阐明CML转化、急变者bcr/abl基因有三种情况：①在P210的CML中出现P190转录本，有人分析了62例各期间的CML患者，发现6/8例加速期，10/11急变期的患者出现m-bcr/abl mRNA，而慢性期的CML仅有50%出现m-bcr/abl mRNA。②具有P230，μ-bcr断裂点的CML易发生急变。③bcr/abl阴性者易发生急变。Cortes指出，Ph染色体阳性者患者的平均生存期为73个月，而Ph阴性，bcr阳性者生存期为60个月，Ph阴性，bcr阴性者生存期仅25个月〔3〕。我们曾经追踪观察了1例CML bcr/abl阴性患者，虽然使用羟基脲和α-干扰素治疗半年以上，患者仍在CML诊断8个月后发生急变。CML的bcr/abl基因检测还具有鉴别诊断意义，我们从中发现了误将CML急变诊断为AML M2亚型的病例和误将CMML诊断为CML的病例。CMML的诊断有时比较困难，在CML基因分型中将CML分为Ph+/bcr+,Ph-/bcr+和Ph-/bcr-三种亚型，前两类属于典型的CML，而后一类为可能属于CMML的一个型别或两者同属于MDS的两个不同亚型。因此，在CMML中的诊断中，除外周血单核细胞绝对值>1.0×109/L外，bcr/abl基因阴性有决定性诊断意义。
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CML和PV同属骨髓增殖性疾病，它们同属造血髓系干细胞恶性克隆起源，彼此之间可以互相转化。但从我们的实验来看，仅有少数PV具有bcr/abl基因，10例PV患者中仅1例bcr/abl基因阳性，而这一患者能否转变为CML尚在观察之中。 参考文献
1 Clarkson B,Strife A.Linkage of proliferative abnormalities in chronic myelogenous leukemia and relevance to treatment.Leukemia,1993,17:1683～1721
2 Cotes JE.Talpaz M,Beran M,et al.Philadelphia chromosome-negative chronic myelogenous leukemia with rearrangement of the breakpoint cluster region.Cancer,1995,75:464～470
, 百拇医药
3 Kantarjian HM,Deisseroth A,Kurzrock R,et al.Chronic myelogenous leukemia:A concise update.Blood,1993,62:691～703
4 隋雪梅，褚建新.慢性粒细胞白血病急变的发病机理研究进展.国外医学输血及血液学分，1997，20：368～372
5 杨崇礼，冯宝璋.BCR-ABL融合蛋白多样性及其与白血病表型的关系.国外医学输血及血液学分册，1997，20：372～375
6 朱易萍，陶元
，郝玉书.慢性髓系白血病的分型问题.国外医学输血及血液学分册，1997，20：65～67
(1998-11-14 收稿 1999-04-09 修回), 百拇医药
单位：同济医科大学附属协和医院血液病研究所 邮政编码：武汉，430022
关键词：白血病，慢性/粒细胞；红细胞，真性/增多症；bcr/abl基因
临床血液学杂志990405 摘要 目的：探讨慢性粒细胞白血病和真性红细胞增多症bcr/abl融合基因出现的频率及临床意义。方法：采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术，研究了慢性粒细胞白血病(CML)、真性红细胞增多症(PV)bcr/abl基因的变化。结果：48例慢性期CML，43例呈现bcr/abl基因阳性，占89.6%，14例加速，急变期CML，6例出现bcr/abl基因，阳性率为42.9%，与慢性期CML相比P<0.01；10例PV出现1例bcr/abl基因阳性，占10.0%。结论：bcr/abl基因检测对于CML的临床分型有重要意义，bcr/abl阴性的CML预后差，而bcr/abl基因的阳性有助于初诊时的CML急变与急性非淋巴细胞白血病(AML)M2的鉴别和CML与慢性粒单细胞白血病(CMML)的鉴别。
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Expression of Bcr/abl Fusion Gene in Chronic Myelogenous Leukemia,Polycythemia Vera and Their Clinical Significance
Chen Yan,Li Huiyu,Wu Yudan
Institute of Hematology,Union Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430022
Abstract Objective:To study on frequencies of bcr/abl fusion gene in chronic myelogenous leukemia,polycythemia vera and their clinical significance.Method:Using RT-PCR technique,the change of bcr/abl genes in chronic myelogenous leukemia (CML) and polycythemia vera (PV) were investigated.Result:43 cases showed positive bcr/abl gene out of 48 cases of chronic phase with CML.It accounted for 90%.6 cases showed positive bcr/abl gene out of 14 cases of accelerated phase and blast crisis of CML.It accounted for 43%.Compared with chronic phase,there was statistical difference.(P<0.01)1 case showed positive bcr/abl gene out of 10 cases with PV.It accounted for 10%.Conclusion:There was an important clinical typing significance in CML using bcr/abl gene detecting technique.The prognosis showed worse in patients of negative bcr/abl gene.When bcr/abl gene showed positive,it contributed to differential diagnosis in blast crisis of CML and acute myelogenous leukemia (AML) M2 subtype at the first diagnosis,and in CML and chronic myelomonocytic leukemia (CMML).
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Key words Leaukemia Chronic/Myelogenous Polycythemia vera Bcr/abl gene
abl为一原癌基因，位于9号染色体q34，基因产物是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶，但通常没有激酶活性。bcr基因位于22
号染色体q11，正常的bcr基因产物是160Kd的胞质磷酸蛋白。由于t(9；22)(q34；q11)的易位，形成bcr/abl融合基因，其能编码P210融合蛋白，它的表达，激活了酪氨酸蛋白激酶活性，改变了细胞的蛋白酪氨酸磷酸化水平和肌动蛋白结合能力，从而扰乱了正常的信号传导途径，使细胞失去了对周围环境的反应性，从而抑制了凋亡的发生〔1〕。t(9；22)(q34；q11)是慢性粒细胞白血病(CML)的标记染色体，即Ph染色体，所以bcr/abl融合基因的出现在诊断CML中有决定性意义，然而真性红细胞增多症是否有bcr/abl融合基因，慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的出现有何鉴别诊断和预后意义，对此我们进行了较深入的研究，现将结果报道如下。
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1 材料和方法
1.1 病例 本院1996年6月～1998年6月门诊和住院病人。慢性粒细胞白血病(CML)62例，男32例，女30例，年龄19～62岁，其中慢性期48例，加速、急变期14例。真性红细胞增多症(PV)10例，男8例，女2例，年龄35～53岁。全部病例诊断符合全国统一标准。
1.2 RT-PCR扩增 CML诊断试剂盒购于上海复兴高科技有限公司。①取患者血1 ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离出有核细胞，异硫氢酸胍一步法提取RNA。②第1次PCR扩增：将反应液A(含引物，四种dNTP)14 μl，加1 μl的RNA酶，2 μl的反转录酶，加3 μl RNA，总反应体系20 μl，按下列条件进行扩增：42℃保温30 min后，93℃变性45 s，55℃煺火45 s，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸5 min。③第2次PCR扩增：将17 μl反应液B加入1 μl的Taq酶中，再加入2 μl的第1次扩增产物，总体积20 μl作PCR扩增，条件同前。④PCR产物检测：将第2次PCR产物10 μl，加样于含EB染色剂的2%琼脂糖中电泳20～30 min(5 V/cm)，在紫外光分析仪上检测结果。每次实验均有阳性对照和阴性对照，只有阳性对照为阳性，阴性对照为阴性时结果才视为可靠。
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2 结果
2.1 bcr/abl基因扩增的结果 见表1。CML慢性期和加速、急变期bcr/abl基因阳性率比较P<0.01。
附表 慢性粒细胞白血病、真性红细胞增多症bcr/abl基因出现的频率 分组
例数
bcr/
abl(+)
%
bcr/
abl(-)
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CML慢性期
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48
43
89.58
5
10.42
CML加速，急变期
14
6
42.85
8
57.15
PV
10
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1
10.00
9
90.00
2.2 确诊情况 临床有2例患者首次骨髓细胞学诊断为急性非淋巴细胞白血病(AML)M2型，因患者脾肿大而高度怀疑为CML急变，经bcr/abl基因检测为阳性，得到确诊。另有1例院外诊断为CML的患者，因外周血单核细胞绝对数>1.8×109/L，临床高度怀疑为慢性粒单细胞性白血病(CMML)，经PCR检测bcr/abl基因为阴性得到确诊。
3 讨论
约有5%～10% CML Ph染色体为阴性，其中1/3的患者bcr/abl基因为阳性。现已知CML BCR断裂点从集区有三种形式，即m-bcr，编码蛋白为P210，我们检测的即为此种：m-bcr，编码蛋白为P190；μ-bcr，编码蛋白为P230〔2〕。我们的结果：48例CML中，bcr/abl阳性者90%，略低于文献报道，但如能同时检测P190和P230，则可能提高bcr/abl的阳性率。在14例CML加速，急变期的病人中bcr/abl基因阳性率仅43%，和慢性期病人比较P<0.01，这就说明bcr/abl阴性者病情易恶化。文献阐明CML转化、急变者bcr/abl基因有三种情况：①在P210的CML中出现P190转录本，有人分析了62例各期间的CML患者，发现6/8例加速期，10/11急变期的患者出现m-bcr/abl mRNA，而慢性期的CML仅有50%出现m-bcr/abl mRNA。②具有P230，μ-bcr断裂点的CML易发生急变。③bcr/abl阴性者易发生急变。Cortes指出，Ph染色体阳性者患者的平均生存期为73个月，而Ph阴性，bcr阳性者生存期为60个月，Ph阴性，bcr阴性者生存期仅25个月〔3〕。我们曾经追踪观察了1例CML bcr/abl阴性患者，虽然使用羟基脲和α-干扰素治疗半年以上，患者仍在CML诊断8个月后发生急变。CML的bcr/abl基因检测还具有鉴别诊断意义，我们从中发现了误将CML急变诊断为AML M2亚型的病例和误将CMML诊断为CML的病例。CMML的诊断有时比较困难，在CML基因分型中将CML分为Ph+/bcr+,Ph-/bcr+和Ph-/bcr-三种亚型，前两类属于典型的CML，而后一类为可能属于CMML的一个型别或两者同属于MDS的两个不同亚型。因此，在CMML中的诊断中，除外周血单核细胞绝对值>1.0×109/L外，bcr/abl基因阴性有决定性诊断意义。
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CML和PV同属骨髓增殖性疾病，它们同属造血髓系干细胞恶性克隆起源，彼此之间可以互相转化。但从我们的实验来看，仅有少数PV具有bcr/abl基因，10例PV患者中仅1例bcr/abl基因阳性，而这一患者能否转变为CML尚在观察之中。 参考文献
1 Clarkson B,Strife A.Linkage of proliferative abnormalities in chronic myelogenous leukemia and relevance to treatment.Leukemia,1993,17:1683～1721
2 Cotes JE.Talpaz M,Beran M,et al.Philadelphia chromosome-negative chronic myelogenous leukemia with rearrangement of the breakpoint cluster region.Cancer,1995,75:464～470
, 百拇医药
3 Kantarjian HM,Deisseroth A,Kurzrock R,et al.Chronic myelogenous leukemia:A concise update.Blood,1993,62:691～703
4 隋雪梅，褚建新.慢性粒细胞白血病急变的发病机理研究进展.国外医学输血及血液学分，1997，20：368～372
5 杨崇礼，冯宝璋.BCR-ABL融合蛋白多样性及其与白血病表型的关系.国外医学输血及血液学分册，1997，20：372～375
6 朱易萍，陶元
，郝玉书.慢性髓系白血病的分型问题.国外医学输血及血液学分册，1997，20：65～67(1998-11-14 收稿 1999-04-09 修回), 百拇医药