白细胞介素2-重组毒素对活化T淋巴细胞的靶向杀伤效应*
作者：杨渝珍 毕美霞 舒平 韩玲
单位：同济医科大学实验医学研究中心分子生物学研究室，武汉 430030
关键词：重组毒素；白细胞介素2；靶向杀伤；绿脓杆菌外毒素
同济医科大学学报990306 摘要 利用PCR-Cloning技术和DNA重组技术,构建了两类IL-2-PE40' 嵌合基因的表达载体,分别由IPTG和温度(42 ℃)诱导表达。在对表达产物进行了酶切位点和片段大小、 电泳迁移率、 分子量的初步鉴定后,又对融合蛋白的白细胞介素2(IL-2)和PE40'组分的抗原性进行了ELISA鉴定。从菌体蛋白中初步分离纯化了重组毒素，并测定其对细胞表面表达IL- 2受体的活化T淋巴细胞的靶向杀伤效应及对混合淋巴细胞反应的抑制作用。结果表明,IL-2-PE40'融合蛋白确实对IL-2R+ 细胞具有明显的靶向杀伤效应并呈剂量依赖关系,与对照组相比,随着保温时间的延长(6、24、48 h)，杀伤效应趋于增强(P<0.05)。 混合淋巴细胞培养结果显示，该融合蛋白对单相和双相反应均有不同程度的免疫抑制作用(P<0.01)。
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The Targeted Killing Effect of Recombination Pseudomonas Exotoxin
(IL-2-PE40') on Activated and IL-2R+ T-lymphocytes
Yang Yuzhen, Bi Meixia, ShuPing et al
Department of Medical Molecular Biology, Reseach Center of
Experimental Medicine, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract Two type of prokaryote express vectors into which chimeric IL-2-PE40' gene fragment was inserted were constructed by using PCR-cloning technique and DNA recombinant technique and expressed after addition of IPTG or change of temperature (up to 42 ℃). Furthermore the fusion proteins expressed in host cells were also identified by using SDS-PAG electrophoresis and immunological ELISA. The experimental results showed that expressing products of chimeric gene containing both IL-2 and PE antigen components and the expressed IL-2-PE40' fusion protein was very toxic to the activated IL-2R+ T lymphocytes (compared with the control group, P<0.05) and able to inhibite the reaction of mixed lymphocytes with signal or double direction in vitro(P<0.01)。
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Key words interleukin 2; pseudomonas exotoxin; chimeric toxin
PE(Pseudomonas Exotoxin A)是绿脓杆菌分泌的外毒素,其分子由3个结构域组成[1]。利用DNA重组技术,用白细胞介素2(IL-2)的cDNA片段取代PE基因的细胞识别功能区(domain 1a) 后构建成嵌合基因[2],所表达的融合蛋白特异性地作用于白细胞介素-2受体阳性细胞(IL-2R+), 由受体介导的内吞途径进入细胞内,使多肽延长因子EF-2因ADP核糖基化而失活,导致细胞死亡。IL-2重组毒素可发展为一种新型的免疫抑制剂,可用于抗移植排斥反应、自身免疫性疾病、IL-2R+的淋巴细胞性白血病、淋巴瘤的治疗[3、4]。本文报道了IL-2重组毒素的粗制品在体外抑制混合淋巴细胞反应及靶向杀伤活化的T淋巴细胞的作用,肯定了这种融合蛋白的免疫抑制效应。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、菌株及细胞系:克隆载体pUC19为本室保存; 表达载体pRSET(A)、(B)、(C)为Invitrogen公司产品;表达载体pBV200和pBV201由中国预防医学院病毒所构建。HL60细胞、JM109、DH5α、BL21(DE3)本组自存;绿脓杆菌产外毒素标准株PA103 由美籍华人张延龄教授惠赠。
1.1.2 酶及各种试剂:各种限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、PCR扩增试剂、羊抗鼠HRP-IgG、IPTG、GSH、GSSG等购于华美生物工程公司，IL-2单克隆抗体由卫生部武汉生物制品所提供，PA103抗血清购于军事医学科学院微生物及流行病研究所。
1.1.3 仪器：PE4800 DNA热循环仪、HYA恒温摇床、DG3022型酶标仪、超净工作台、CO2培养箱及其它基因工程实验所需的仪器设备。
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1.2 方法
1.2.1 IL-2-PE40'重组毒素原核表达载体的构建:我们分别构建了IPTG 诱导和温度诱导的两类重组毒素表达载体,构建流程详见文献[5]。
1.2.2 重组毒素的诱导表达和表达产物的鉴定:经酶切、电泳、免疫学ELISA 鉴定证实表达产物的分子量约5.5 ku,表达效率为18%左右,具体实验方法见文献[5,6]。用双抗夹心法鉴定融合蛋白中IL-2和PE部分的抗原活性,分别采用抗IL-2单克隆抗体或PA抗血清进行ELISA 检测。
1.2.3 IL-2-PE40'融合蛋白粗制品的制备:转化菌经超声破碎后, 离心收集包涵体沉淀,用4 mol/L 尿素洗涤2遍,再用 7 mol/L 盐酸胍[7]( 含 0.1 mol/L NH4AC, 0.1 g/L Tween 80 )于4 °C溶解包涵体,14 000 r/min 离心30 min,取上清,弃沉淀。在上清中加入复性液(5 mmol/L KH2PO4,1 mmol/L EDTA, 50 mmol/L NaCl, 2 mmol/L GSH 及 1 mmol/L GSSG), 于0.01 mol/L、pH 7.2的PBS中透析48 h,此期间共换液6次。取透析前、透 析中、透析后以及透析后不同稀释度的样品,分别加入到每孔含1×106/ml的HL60 细胞的培养孔(96孔板)中,同时设加PBS、盐酸胍、RPMI-1640的对照孔。于12、24、48 h测定细胞活度，观察盐酸胍、PBS等外界因素对HL60细胞的毒性作用,以确定最大无毒浓度。
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1.2.4 IL-2-PE40'粗制品对活化淋巴细胞杀伤效应的测定：参照文献[8]取健康人抗凝外周血，用淋巴细胞分层液分离出单个核细胞,用PHA(100 μg/ml)刺激并悬浮于RPMI-1640 完全培养基(含100 ml/L灭活的健康人AB型血清)中,37 ℃培养72 h,再重新分层和悬浮培养,同时加入适当浓度的IL-2以维持活化淋巴细胞的生长,继续培养。然后按2×106/ml的密度、100 μl/孔的量重新铺于96孔培养板中,分别加入不同稀释度的IL-2-PE40'粗制品,于6、24、48 h各取上清用MTT法测定IL-2-PE40'对淋巴细胞的毒性作用。为维持活化淋巴细胞的正常生长,曾经使用过0、1.0、5.0、10.0 U/ml 4种不同浓度的 rIL-2,以确定对IL-2-PE40'杀伤活性测定干扰最小的必需浓度。
1.2.5 IL-2-PE40'抑制混合淋巴细胞反应的生物活性检测:取AB型、B 型健康人外周血各20 ml,分离出淋巴细胞，进行下属两种方式的培养。①双相混合淋巴细胞培养，将两种淋巴细胞等量混合，按2×106/ml的密度加入96孔板的培养孔中,100 μl/每孔,5% CO2,37 ℃条件下培养5 d,待淋巴细胞转化后,将IL-2-PE40'粗制品原液(98 μg/ml)、1∶2稀释液(RPMI-1640稀释,49 μg/ml)、同样处理的未转化菌[简称空白菌,BL21(DE3)]的提取原液(87 μg/ml)及其1∶2稀释液各100 μl加入96 孔培养板小孔中,一式三份,同时设PBS 与 RPMI-1640对照。培养24 h后用MTT法测定细胞的增殖率。②单向混合淋巴细胞培养。将从AB型抗凝血中分离的淋巴细胞(1×106/ml)为刺激细胞,与丝裂霉素C(50 μg/ml)在37 ℃ 共孵育45 min后,再与B型血中分离的淋巴细胞(1×106/ml)等量混合培养,同时设有PHA刺激的对照组,其余步骤同①。
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2 结果
2.1 IL-2-PE40'融合蛋白表达产物的免疫学鉴定
诱导表达后转化菌超声匀浆的SDS-PAGE电泳显示在约54.6 ku处有一明显的新的蛋白质条带(图1),空载菌中则无此条带。用IL-2的单克隆抗体及PA103全菌匀浆免疫血清鉴定表达产物中IL-2和PE40'部分抗原性存在与否，结果表明，转化菌超声破菌后的上清及包涵体沉淀中均有相应的抗原-抗体反应成分存在,但包涵体中反应性强于上清(表1)。
表1 融合蛋白中各组份抗原性的鉴定(A570值) 类 别
IL-2抗原性鉴定*
PE40部分抗
原性鉴定*
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1∶50
1∶100
1∶200
1∶50
1∶100
表达菌包涵体
0.13
0.10
0.09
0.28
0.25
空白菌沉淀
0.04
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0.02
0.01
0.15
0.13
表达菌上清
0.08
0.07
0.04
0.21
0.17
空白菌上清
0.03
0.01
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0.01
0.15
0.12
*检测IL-2和PE40组分抗原性时,包被抗原的浓度 分别为4.2、2.8 g/L
图1 IL-2-PE40'嵌合基因表达产物的 SDS-PAGE 图谱
1 表示空载菌体对照; 2、3、4 分别表示表达菌在42 ℃诱导3、6、12 h; 5 为 MW Marker; 6、7、8 表示用IPTG诱导3、6、12 h; → 箭头方向示融合蛋白条带
2.2 IL-2-PE40'粗制品最大无毒量的确定
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IL-2-PE40'表达产物经变性、复性后取样, 观察其中所含杂质对细胞有无直接毒性作用。结果表明:①透析后的粗制品对细胞生长影响最小。与细胞共孵育6、12、24、48 h后,细胞活度分别为90%、85%、80%、60%，与同时设立的RPMI-1640对照组的细胞活度基本相同。未透析或透析不彻底的粗制品中由于盐酸胍存在,孵育后48 h可致细胞全部死亡。 ②对照盐酸胍经1∶64倍稀释后,与细胞保温6 h的细胞活度为80%,24 h后,细胞全部死亡。由此可认为透析 48 h后样品中盐酸胍已基本去除,即透析后的粗制品浓度(Lowry法定量, 蛋白浓度为98 μg/ml)指定为它的最大无毒浓度。
2.3 IL-2-PE40'粗制品对活化淋巴细胞杀伤效应的测定
经PHA刺激后,活化的淋巴细胞表面可表达大量的IL-2受体。此后,淋巴母细胞的增殖和生长均依赖IL-2的存在,我们测定了IL-2-PE40'对不同IL-2浓度下(0、1.0、5.0、10.0 U/ml)生长的淋巴母细胞的最大杀伤效应和作用持续时间。当IL-2浓度为0和1.0 U/ml时,对照组细胞本身就生长不良或生长停滞;当IL-2浓度大于5.0 U/ml时,对照细胞生长和增殖良好,因此,至少5.0 U/ml的IL-2浓度为较佳的选择。从表2可见,随着IL-2-PE40'融合蛋白的倍比稀释,杀伤效应逐步降低,呈现剂量依赖关系;而且融合蛋白对细胞的杀伤效应可持续48 h以上,其间对照组的细胞却依然增殖良好(图2)。
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图2 IL-2-PE40粗制品与活化淋巴细胞保温不同时间后细胞的存活状况(×40)
2.4 IL-2-PE40'对混合淋巴细胞培养的抑制作用
表达的融合蛋白对单向和双向混合淋巴细胞培养均有不同程度的抑制作用,结果见表3。
A：加RPMI-1640的对照组(48 h)；B：加RPMI-1640的对照组(48 h，加MTT后示大量甲月 替结晶)；C：加IL-2-PE40实验组(6 h,细胞开始坏死)；D：加IL-2-PE40实验组(24 h，细胞部分坏死，仍有较多存活细胞)；E：加IL-2-PE40实验组(48 h，细胞大部分坏死)
3 讨论
我们利用PCR-cloning技术,成功地构建了两类分别由IPTG和温度诱导的原核表达载体pBIP40'和pBVIP400/pBVIP401,并对其表达产物进行了酶切、电泳、抗原活性、 生物学活性等方面的检测和鉴定。在对表达产物的粗制品进行细胞免疫学实验时,为排除各种杂质的干扰影响实验结果,我们设计了多种不同的实验对照, 如透析至不同程度的融合蛋白的细胞毒效应的检测、维持活化淋巴细胞增殖生长的最低IL-2浓度的选择、空载菌胞浆中细菌蛋白的影响、变性剂盐酸胍的细胞毒性作用等。
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表2 IL-2-PE40'对活化淋巴细胞的杀伤效应(
±s,A570,n=6) IL-2
浓度
(U/ml)
保温时间
(h)
样品稀释度(98 μg/ml)
对 照
1∶0
1∶2
1∶4
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0.75±0.00
0.62±0.02*
0.67±0.01*
0.74±0.01
0.0
24
0.67±0.02
0.47±0.01*
0.59±0.03*
0.66±0.02
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48
0.65±0.01
0.40±0.01*
0.51±0.01*
0.62±0.01*
6
0.80±0.02
0.62±0.02*
0.78±0.01
0.80±0.01
1.0
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24
0.83±0.01
0.46±0.02*
0.61±0.01*
0.72±0.01*
48
0.88±0.00
0.41±0.01*
0.52±0.01*
0.70±0.01*
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6
0.80±0.01
0.68±0.01*
0.79±0.01
0.82±0.01
5.0
24
0.81±0.01
0.42±0.02*
0.65±0.01*
0.70±0.02
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48
1.00±0.30
0.38±0.02*
0.55±0.02*
0.60±0.03*
6
0.80±0.01
0.62±0.02*
0.70±0.02*
0.77±0.03
10.0
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24
0.82±0.02
0.36±0.02*
0.65±0.03*
0.72±0.02*
48
1.00±0.01
0.23±0.01*
0.50±0.02*
0.66±0.02*
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与对照组比较 P<0.01
表3 IL-2-PE40'对混合淋巴细胞反应的抑制作用(±s,A570,n=6) 稀释度
单向MLC
双向MLC
对 照
对照组
毒素组
对照组
毒素组
对照组
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毒素组
原 液
0.39±0.01
0.28±0.01*
0.51±0.01
0.47±0.01*
0.78±0.01
0.51±0.01*
1∶2稀释
0.51±0.01
0.45±0.01*
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0.67±0.01
0.53±0.01*
0.78±0.01
0.58±0.01*
与对照组空白菌比较 *P<0.01
其中,盐酸胍对细胞的毒性最大, 在至少48 h的透析后,盐酸胍可完全去除。因此,在进行重组毒素的细胞杀伤效应研究时, 样品必需充分透析,以排除残留盐酸胍的毒性作用。
活化后的淋巴母细胞表面表达IL-2受体,细胞的增殖和生长均需依赖IL-2,表2 的结果也说明当细胞对照中不加IL-2时,6～48 h期间,细胞生长不良,MTT法测定的吸光度有所下降,加入1.0 U/ml的IL-2后,细胞才能维持生长, IL-2浓度大于 5.0 U/ml时,细胞还有所增殖,不管是何种情况,IL-2-PE-40'的杀伤效应总是肯定的。考虑到IL-2和IL-2-PE40' 都能竞争性结合IL-2R,故必需控制所加入的IL-2浓度。由于实验中使用的IL-2-PE40'的浓度较大, 在竞争中完全可占优势。从表2结果看,在IL-2浓度大于5.0 U/ml时,杀伤效果最能说明问题。
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活化淋巴细胞反应是器官移植前的组织配型检测指标之一,以测定受体和供体之间HLA抗原相容程度和移植后排除反应的强烈程度。IL-2-PE40' 对单相和双相混合淋巴细胞反应均有抑制作用。从表2、表3看,可初步肯定IL-2-PE40'的体外免疫抑制效果, 但整体实验结果如何,还有待进一步研究。
* 国家自然科学基金资助项目(No.39370701)
作者简介:杨渝珍，女，1941年生，教授
参考文献
1 Allured V S, Collier R J, Carroll S F et al. Structure of extoxin A of pseudomonas aeruginosa at 3.0-angstrom resolution. Proc Natl Acad Sci USA, 1986,83:1320
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2 Haya L G, David F, Vijay C et al. Cytotoxic activity of an interleukin 2-pseudomonas exotoxin chimeric protein produced in escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85:1922
3 John P C, Haya L G, Robert L et al. Chimeric cytotoxin IL2-PE40 delays and mitigates adjuvant-induced arthritis in rats. Proc Natl Acad Sci USA,1989, 86:287
4 Kozak R W, Haya L G, Jonesl P K et al. IL-2-PE40 prevents the development of tumors in mice injected with IL-2 receptor expressing el4 transfectant tumor cells. J Immunol, 1990,145:2766
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5 杨渝珍,舒平,祁学忠等. 重组毒素IL-2-PE40'的克隆和初步表达.武汉大学学报(自然科学版),1996，41(生物工程专刊)：121
6 毕美霞,杨渝珍,韩玲等. 一种快速筛选和鉴定重组体的方法——改良菌落PCR.同济医科大学学报,1998,27(1):78
7 卢圣栋主编. 现代分子生物学实验技术. 北京： 高等教育出版社, 1995.370～380
8 Pascal B, David V W, Maurice G et al. Purification and partial characterization of an interleukin 2-pseudomonas exotoxin fusion protein. Bio Technology, 1988,6:1326
(1998-11-24 收稿), 百拇医药
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关键词：重组毒素；白细胞介素2；靶向杀伤；绿脓杆菌外毒素
同济医科大学学报990306 摘要 利用PCR-Cloning技术和DNA重组技术,构建了两类IL-2-PE40' 嵌合基因的表达载体,分别由IPTG和温度(42 ℃)诱导表达。在对表达产物进行了酶切位点和片段大小、 电泳迁移率、 分子量的初步鉴定后,又对融合蛋白的白细胞介素2(IL-2)和PE40'组分的抗原性进行了ELISA鉴定。从菌体蛋白中初步分离纯化了重组毒素，并测定其对细胞表面表达IL- 2受体的活化T淋巴细胞的靶向杀伤效应及对混合淋巴细胞反应的抑制作用。结果表明,IL-2-PE40'融合蛋白确实对IL-2R+ 细胞具有明显的靶向杀伤效应并呈剂量依赖关系,与对照组相比,随着保温时间的延长(6、24、48 h)，杀伤效应趋于增强(P<0.05)。 混合淋巴细胞培养结果显示，该融合蛋白对单相和双相反应均有不同程度的免疫抑制作用(P<0.01)。
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The Targeted Killing Effect of Recombination Pseudomonas Exotoxin
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Yang Yuzhen, Bi Meixia, ShuPing et al
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Experimental Medicine, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract Two type of prokaryote express vectors into which chimeric IL-2-PE40' gene fragment was inserted were constructed by using PCR-cloning technique and DNA recombinant technique and expressed after addition of IPTG or change of temperature (up to 42 ℃). Furthermore the fusion proteins expressed in host cells were also identified by using SDS-PAG electrophoresis and immunological ELISA. The experimental results showed that expressing products of chimeric gene containing both IL-2 and PE antigen components and the expressed IL-2-PE40' fusion protein was very toxic to the activated IL-2R+ T lymphocytes (compared with the control group, P<0.05) and able to inhibite the reaction of mixed lymphocytes with signal or double direction in vitro(P<0.01)。
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Key words interleukin 2; pseudomonas exotoxin; chimeric toxin
PE(Pseudomonas Exotoxin A)是绿脓杆菌分泌的外毒素,其分子由3个结构域组成[1]。利用DNA重组技术,用白细胞介素2(IL-2)的cDNA片段取代PE基因的细胞识别功能区(domain 1a) 后构建成嵌合基因[2],所表达的融合蛋白特异性地作用于白细胞介素-2受体阳性细胞(IL-2R+), 由受体介导的内吞途径进入细胞内,使多肽延长因子EF-2因ADP核糖基化而失活,导致细胞死亡。IL-2重组毒素可发展为一种新型的免疫抑制剂,可用于抗移植排斥反应、自身免疫性疾病、IL-2R+的淋巴细胞性白血病、淋巴瘤的治疗[3、4]。本文报道了IL-2重组毒素的粗制品在体外抑制混合淋巴细胞反应及靶向杀伤活化的T淋巴细胞的作用,肯定了这种融合蛋白的免疫抑制效应。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、菌株及细胞系:克隆载体pUC19为本室保存; 表达载体pRSET(A)、(B)、(C)为Invitrogen公司产品;表达载体pBV200和pBV201由中国预防医学院病毒所构建。HL60细胞、JM109、DH5α、BL21(DE3)本组自存;绿脓杆菌产外毒素标准株PA103 由美籍华人张延龄教授惠赠。
1.1.2 酶及各种试剂:各种限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、PCR扩增试剂、羊抗鼠HRP-IgG、IPTG、GSH、GSSG等购于华美生物工程公司，IL-2单克隆抗体由卫生部武汉生物制品所提供，PA103抗血清购于军事医学科学院微生物及流行病研究所。
1.1.3 仪器：PE4800 DNA热循环仪、HYA恒温摇床、DG3022型酶标仪、超净工作台、CO2培养箱及其它基因工程实验所需的仪器设备。
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1.2 方法
1.2.1 IL-2-PE40'重组毒素原核表达载体的构建:我们分别构建了IPTG 诱导和温度诱导的两类重组毒素表达载体,构建流程详见文献[5]。
1.2.2 重组毒素的诱导表达和表达产物的鉴定:经酶切、电泳、免疫学ELISA 鉴定证实表达产物的分子量约5.5 ku,表达效率为18%左右,具体实验方法见文献[5,6]。用双抗夹心法鉴定融合蛋白中IL-2和PE部分的抗原活性,分别采用抗IL-2单克隆抗体或PA抗血清进行ELISA 检测。
1.2.3 IL-2-PE40'融合蛋白粗制品的制备:转化菌经超声破碎后, 离心收集包涵体沉淀,用4 mol/L 尿素洗涤2遍,再用 7 mol/L 盐酸胍[7]( 含 0.1 mol/L NH4AC, 0.1 g/L Tween 80 )于4 °C溶解包涵体,14 000 r/min 离心30 min,取上清,弃沉淀。在上清中加入复性液(5 mmol/L KH2PO4,1 mmol/L EDTA, 50 mmol/L NaCl, 2 mmol/L GSH 及 1 mmol/L GSSG), 于0.01 mol/L、pH 7.2的PBS中透析48 h,此期间共换液6次。取透析前、透 析中、透析后以及透析后不同稀释度的样品,分别加入到每孔含1×106/ml的HL60 细胞的培养孔(96孔板)中,同时设加PBS、盐酸胍、RPMI-1640的对照孔。于12、24、48 h测定细胞活度，观察盐酸胍、PBS等外界因素对HL60细胞的毒性作用,以确定最大无毒浓度。
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1.2.4 IL-2-PE40'粗制品对活化淋巴细胞杀伤效应的测定：参照文献[8]取健康人抗凝外周血，用淋巴细胞分层液分离出单个核细胞,用PHA(100 μg/ml)刺激并悬浮于RPMI-1640 完全培养基(含100 ml/L灭活的健康人AB型血清)中,37 ℃培养72 h,再重新分层和悬浮培养,同时加入适当浓度的IL-2以维持活化淋巴细胞的生长,继续培养。然后按2×106/ml的密度、100 μl/孔的量重新铺于96孔培养板中,分别加入不同稀释度的IL-2-PE40'粗制品,于6、24、48 h各取上清用MTT法测定IL-2-PE40'对淋巴细胞的毒性作用。为维持活化淋巴细胞的正常生长,曾经使用过0、1.0、5.0、10.0 U/ml 4种不同浓度的 rIL-2,以确定对IL-2-PE40'杀伤活性测定干扰最小的必需浓度。
1.2.5 IL-2-PE40'抑制混合淋巴细胞反应的生物活性检测:取AB型、B 型健康人外周血各20 ml,分离出淋巴细胞，进行下属两种方式的培养。①双相混合淋巴细胞培养，将两种淋巴细胞等量混合，按2×106/ml的密度加入96孔板的培养孔中,100 μl/每孔,5% CO2,37 ℃条件下培养5 d,待淋巴细胞转化后,将IL-2-PE40'粗制品原液(98 μg/ml)、1∶2稀释液(RPMI-1640稀释,49 μg/ml)、同样处理的未转化菌[简称空白菌,BL21(DE3)]的提取原液(87 μg/ml)及其1∶2稀释液各100 μl加入96 孔培养板小孔中,一式三份,同时设PBS 与 RPMI-1640对照。培养24 h后用MTT法测定细胞的增殖率。②单向混合淋巴细胞培养。将从AB型抗凝血中分离的淋巴细胞(1×106/ml)为刺激细胞,与丝裂霉素C(50 μg/ml)在37 ℃ 共孵育45 min后,再与B型血中分离的淋巴细胞(1×106/ml)等量混合培养,同时设有PHA刺激的对照组,其余步骤同①。
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2 结果
2.1 IL-2-PE40'融合蛋白表达产物的免疫学鉴定
诱导表达后转化菌超声匀浆的SDS-PAGE电泳显示在约54.6 ku处有一明显的新的蛋白质条带(图1),空载菌中则无此条带。用IL-2的单克隆抗体及PA103全菌匀浆免疫血清鉴定表达产物中IL-2和PE40'部分抗原性存在与否，结果表明，转化菌超声破菌后的上清及包涵体沉淀中均有相应的抗原-抗体反应成分存在,但包涵体中反应性强于上清(表1)。
表1 融合蛋白中各组份抗原性的鉴定(A570值) 类 别
IL-2抗原性鉴定*
PE40部分抗
原性鉴定*
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1∶50
1∶100
1∶200
1∶50
1∶100
表达菌包涵体
0.13
0.10
0.09
0.28
0.25
空白菌沉淀
0.04
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0.02
0.01
0.15
0.13
表达菌上清
0.08
0.07
0.04
0.21
0.17
空白菌上清
0.03
0.01
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0.01
0.15
0.12
*检测IL-2和PE40组分抗原性时,包被抗原的浓度 分别为4.2、2.8 g/L
图1 IL-2-PE40'嵌合基因表达产物的 SDS-PAGE 图谱
1 表示空载菌体对照; 2、3、4 分别表示表达菌在42 ℃诱导3、6、12 h; 5 为 MW Marker; 6、7、8 表示用IPTG诱导3、6、12 h; → 箭头方向示融合蛋白条带
2.2 IL-2-PE40'粗制品最大无毒量的确定
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IL-2-PE40'表达产物经变性、复性后取样, 观察其中所含杂质对细胞有无直接毒性作用。结果表明:①透析后的粗制品对细胞生长影响最小。与细胞共孵育6、12、24、48 h后,细胞活度分别为90%、85%、80%、60%，与同时设立的RPMI-1640对照组的细胞活度基本相同。未透析或透析不彻底的粗制品中由于盐酸胍存在,孵育后48 h可致细胞全部死亡。 ②对照盐酸胍经1∶64倍稀释后,与细胞保温6 h的细胞活度为80%,24 h后,细胞全部死亡。由此可认为透析 48 h后样品中盐酸胍已基本去除,即透析后的粗制品浓度(Lowry法定量, 蛋白浓度为98 μg/ml)指定为它的最大无毒浓度。
2.3 IL-2-PE40'粗制品对活化淋巴细胞杀伤效应的测定
经PHA刺激后,活化的淋巴细胞表面可表达大量的IL-2受体。此后,淋巴母细胞的增殖和生长均依赖IL-2的存在,我们测定了IL-2-PE40'对不同IL-2浓度下(0、1.0、5.0、10.0 U/ml)生长的淋巴母细胞的最大杀伤效应和作用持续时间。当IL-2浓度为0和1.0 U/ml时,对照组细胞本身就生长不良或生长停滞;当IL-2浓度大于5.0 U/ml时,对照细胞生长和增殖良好,因此,至少5.0 U/ml的IL-2浓度为较佳的选择。从表2可见,随着IL-2-PE40'融合蛋白的倍比稀释,杀伤效应逐步降低,呈现剂量依赖关系;而且融合蛋白对细胞的杀伤效应可持续48 h以上,其间对照组的细胞却依然增殖良好(图2)。
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图2 IL-2-PE40粗制品与活化淋巴细胞保温不同时间后细胞的存活状况(×40)
2.4 IL-2-PE40'对混合淋巴细胞培养的抑制作用
表达的融合蛋白对单向和双向混合淋巴细胞培养均有不同程度的抑制作用,结果见表3。
A：加RPMI-1640的对照组(48 h)；B：加RPMI-1640的对照组(48 h，加MTT后示大量甲月 替结晶)；C：加IL-2-PE40实验组(6 h,细胞开始坏死)；D：加IL-2-PE40实验组(24 h，细胞部分坏死，仍有较多存活细胞)；E：加IL-2-PE40实验组(48 h，细胞大部分坏死)
3 讨论
我们利用PCR-cloning技术,成功地构建了两类分别由IPTG和温度诱导的原核表达载体pBIP40'和pBVIP400/pBVIP401,并对其表达产物进行了酶切、电泳、抗原活性、 生物学活性等方面的检测和鉴定。在对表达产物的粗制品进行细胞免疫学实验时,为排除各种杂质的干扰影响实验结果,我们设计了多种不同的实验对照, 如透析至不同程度的融合蛋白的细胞毒效应的检测、维持活化淋巴细胞增殖生长的最低IL-2浓度的选择、空载菌胞浆中细菌蛋白的影响、变性剂盐酸胍的细胞毒性作用等。
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表2 IL-2-PE40'对活化淋巴细胞的杀伤效应(
±s,A570,n=6) IL-2浓度
(U/ml)
保温时间
(h)
样品稀释度(98 μg/ml)
对 照
1∶0
1∶2
1∶4
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0.75±0.00
0.62±0.02*
0.67±0.01*
0.74±0.01
0.0
24
0.67±0.02
0.47±0.01*
0.59±0.03*
0.66±0.02
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48
0.65±0.01
0.40±0.01*
0.51±0.01*
0.62±0.01*
6
0.80±0.02
0.62±0.02*
0.78±0.01
0.80±0.01
1.0
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24
0.83±0.01
0.46±0.02*
0.61±0.01*
0.72±0.01*
48
0.88±0.00
0.41±0.01*
0.52±0.01*
0.70±0.01*
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6
0.80±0.01
0.68±0.01*
0.79±0.01
0.82±0.01
5.0
24
0.81±0.01
0.42±0.02*
0.65±0.01*
0.70±0.02
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48
1.00±0.30
0.38±0.02*
0.55±0.02*
0.60±0.03*
6
0.80±0.01
0.62±0.02*
0.70±0.02*
0.77±0.03
10.0
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24
0.82±0.02
0.36±0.02*
0.65±0.03*
0.72±0.02*
48
1.00±0.01
0.23±0.01*
0.50±0.02*
0.66±0.02*
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与对照组比较 P<0.01
表3 IL-2-PE40'对混合淋巴细胞反应的抑制作用(
±s,A570,n=6) 稀释度单向MLC
双向MLC
对 照
对照组
毒素组
对照组
毒素组
对照组
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毒素组
原 液
0.39±0.01
0.28±0.01*
0.51±0.01
0.47±0.01*
0.78±0.01
0.51±0.01*
1∶2稀释
0.51±0.01
0.45±0.01*
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0.67±0.01
0.53±0.01*
0.78±0.01
0.58±0.01*
与对照组空白菌比较 *P<0.01
其中,盐酸胍对细胞的毒性最大, 在至少48 h的透析后,盐酸胍可完全去除。因此,在进行重组毒素的细胞杀伤效应研究时, 样品必需充分透析,以排除残留盐酸胍的毒性作用。
活化后的淋巴母细胞表面表达IL-2受体,细胞的增殖和生长均需依赖IL-2,表2 的结果也说明当细胞对照中不加IL-2时,6～48 h期间,细胞生长不良,MTT法测定的吸光度有所下降,加入1.0 U/ml的IL-2后,细胞才能维持生长, IL-2浓度大于 5.0 U/ml时,细胞还有所增殖,不管是何种情况,IL-2-PE-40'的杀伤效应总是肯定的。考虑到IL-2和IL-2-PE40' 都能竞争性结合IL-2R,故必需控制所加入的IL-2浓度。由于实验中使用的IL-2-PE40'的浓度较大, 在竞争中完全可占优势。从表2结果看,在IL-2浓度大于5.0 U/ml时,杀伤效果最能说明问题。
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活化淋巴细胞反应是器官移植前的组织配型检测指标之一,以测定受体和供体之间HLA抗原相容程度和移植后排除反应的强烈程度。IL-2-PE40' 对单相和双相混合淋巴细胞反应均有抑制作用。从表2、表3看,可初步肯定IL-2-PE40'的体外免疫抑制效果, 但整体实验结果如何,还有待进一步研究。
* 国家自然科学基金资助项目(No.39370701)
作者简介:杨渝珍，女，1941年生，教授
参考文献
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2 Haya L G, David F, Vijay C et al. Cytotoxic activity of an interleukin 2-pseudomonas exotoxin chimeric protein produced in escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85:1922
3 John P C, Haya L G, Robert L et al. Chimeric cytotoxin IL2-PE40 delays and mitigates adjuvant-induced arthritis in rats. Proc Natl Acad Sci USA,1989, 86:287
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5 杨渝珍,舒平,祁学忠等. 重组毒素IL-2-PE40'的克隆和初步表达.武汉大学学报(自然科学版),1996，41(生物工程专刊)：121
6 毕美霞,杨渝珍,韩玲等. 一种快速筛选和鉴定重组体的方法——改良菌落PCR.同济医科大学学报,1998,27(1):78
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(1998-11-24 收稿), 百拇医药