PCR和原位杂交检测食管癌组织中人乳头状瘤病毒
作者：吕丽春△ 沈忠英 游绍进 沈健 蔡唯佳
单位：汕头大学医学院病理教研室(广东汕头，515031)
关键词：食管肿瘤；人乳头状瘤病毒；聚合酶链式反应技术；原位杂交
癌症/990215
【摘要】目的：探索汕头高发区食管癌的发病是否与HPV感染有关。方法：用L1区共用引物PCR和HPV18DNA探针原位杂交技术对55例新鲜食管癌标本进行检测。结果：PCR和原位杂交的HPV阳性检出率分别为92.72%和81.80%，癌旁粘膜HPV检出率高于癌组织(P<0.05)。而且原位杂交提示不同病变杂交信号分布特征不同：癌旁“正常”和单纯增生上皮呈层状分布，原位癌层状分布特征消失，阳性细胞弥散全层，浸润癌呈区域性阳性。结论：HPV感染可能是食管癌的病因之一。
中图号：R730.2 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)02-0162-03
, http://www.100md.com
Detection of human papillomavirus(HPV) on esophageal
carcinoma by PCR and in-situ hybridization
LU Li-chun,SHEN Zhong-yin,YOU Shao-jin,et al
Department of Pathology,Shantou University Medical College,Shantou 515031,China
【Abstract】 Purpose： To search wether HPV infection is associated with esophageal carcinoma.Method：： L1 concensus primers in the Polymerase Chain Reaction(PCR) and HPV 18 probe in In- situ Hybridization(ISH) were used for the detection of HPV infection from each of 55 fresh esophageal carcinoma secimens.Results：： The positive rate of esophageal cancer tissue was 92.72% and 81.80% respectively by PCR and ISH.Paracarcinoma mucosa had higher positive rate than that of cancer(P<0.05).Moreover,HPV hybridization signals were related to the epithelial lesions.HPV 18 hybridization signals were distributed in layers in normal and simple hyperplasia epithelium.The spots were diffusively distributed in the whole epithelium and layer characteristics disappeared in carcinoma in-situ.Hybridization signals were focally positive in invasive cancer.Conclusion：： It suggested that HPV infection might be one of the causes of esophageal carcinoma.
, http://www.100md.com
Key words： Esophageal neoplasms;Human papillomavirus;Polymerase chain reaction;In-situ hybridization
人乳头状瘤病毒(HPV)是一种与人体肿瘤相关的病毒，它在人体的感染很普遍，食管粘膜鳞状上皮是其易感部位之一。既往研究不同国家和地区食管癌组织有不同HPV感染率的报道[1～4]，但也有完全阴性的结果[5]。本室用聚合酶链式反应技术(PCR)和原位DNA-DNA分子杂交(ISH)对汕头高发区食管癌和癌旁粘膜进行HPV检测，以探讨食管组织中HPV感染与食管癌的关系。
1 材料和方法
1.1 标本
取自1994年10月至1995年4月汕头大学医学院附属肿瘤医院外科手术切除并经病理确诊的新鲜食管癌标本55例，每例分别取癌灶，癌旁粘膜(癌灶边缘1cm内)和远端切缘粘膜各一式二分，分别用于组织DNA提取和冰冻切片。
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HPV感染阴性食管癌细胞株Ec/CUHK2为方法学阴性对照，由香港中文大学邱殷庆教授惠赠。
1.2 组织DNA提取
新鲜组织剪碎匀浆，加入含蛋白酶K的消化缓冲液，酚、氯仿、异戊醇反复抽提去除蛋白，冷无水乙醇沉淀DNA。
1.3 PCR
L1区共用引物参照文献合成[6]，序列为：
L1C1 5’-CGTAAACGTTTTCCCTATTTTTTT-3’
L1C2 3’-GTTATGTCTCATAAATCCCAT-5’
该区在HPV6，11，16，18，31，33同源序列占90%左右。
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PCR条件按文献设计，根据文献[6]判定结果，HPV6、11扩增片段244bp；HPV16、18扩增片段253bp;HPV31、33扩增片段256bp。整个PCR操作过程严格防污染。
1.4 探针的制备
HPV18重组质粒DNA转化的大肠杆菌，在含氨苄青霉素的LB培养基上挑出活化的大肠杆菌克隆，置37℃LB液中振荡培养，碱变性法抽提质粒DNA，用EcoRⅠ酶切，透析袋电洗脱法回收，地高辛——随机引物标记法标记探针，用点膜的方法对标记探针进行效能鉴定。
1.5 冰冻切片和原位杂交
取材后每例3份样本经O.C.T包埋在一起，常规冰冻切片，一片经HE染色作病理形态学诊断，其余作ISH用。冰冻切片经蛋白酶K消化后，杂交缓冲液直接滴片，〔杂交缓冲液组成：10%(W/V)硫酸葡聚糖，50%(V/V)去离子甲酰胺、2×SSC、100ng/mlssDNA、0.01(W/V)PVP〕，92℃变性3分钟，冰浴3分钟，42℃复性过夜，全部洗片过程均在37℃进行，按地高辛标记试剂盒推荐方法显色，8～10小时终止反应，切片以甲基绿复染细胞核。
, 百拇医药
ISH设以下对照：①无探针对照；②杂交后不加酶连抗地高辛抗体对照；③DNaseⅠ消化对照；④组织或HPV18DNA探针未经热变性即进行杂交变性对照。
2 结果
2.1 HPVPCR检测
55例标本中，HPVDNA阳性51例(每例3份样本中有1份检出HPVDNA，即判定为该例阳性)，阳性率92.72%。同例标本不同部位检出率见表1，其中，癌旁粘膜HPV阳性率高于癌灶HPVDNA的检出率(P<0.05)。
表1 食管癌组织共用引物PCR检测HPV阳性率 组别
标本例数
阳性例数
阳性率(%)
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切缘粘膜
55
48
87.27
癌旁粘膜
55
50
90.91
癌组织
55
41
74.55
实验对照：无模版DNA扩增对照、Ec/CUHK1或Ec/CUHK2细胞DNA扩增对照未见任何产物。
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2.2 HPVISH法检测
55例中有1个部位以上ISH法阳性者共45例，占81.80%，4例PCR法全阴性者ISH法也阴性。食管不同部位HPV检出率见表2，切缘粘膜和癌旁粘膜阳性率明显高于癌组织(P<0.05)。表2 食管癌组织ISH检测HPV阳性率 组别
标本例数
阳性例数
阳性率(%)
切缘粘膜
55
43
78.18
癌旁粘膜
, 百拇医药
55
42
76.36
癌组织
55
15
27.27
HPV18DNA阳性杂交点位于细胞核内。正常粘膜上皮(图1)，阳性杂交点居粘膜上皮上三分之一，越近表层，阳性细胞数越多，杂交点粗而多，甚至呈块状。单纯增生粘膜上皮，杂交阳性细胞层次随上皮的增生而加厚，但也有与正常上皮相似的层状分布，多占上皮三分之一厚。不典型增生粘膜上皮(图2)，阳性细胞层次不明显，多数病例占上皮全层三分之二厚以上，表层阳性信号粗块状，近基底细胞信号颗粒状。原位癌(图3)，层状分布特征消失，杂交信号较弥散地分布于上皮全层，均呈颗粒状。浸润癌(图4)，杂交阳性细胞分布不均匀，多数为区域性阳性，数量少且信号弱，少数病例有较强的信号弥漫分布。
, 百拇医药
图1 正常粘膜上皮：杂交信号位于上皮浅表层，层状分布明显。
(冰冻切片，ISH，甲基绿复染200×)
图2 Ⅱ°不典型增生粘膜上皮：层状分布特征不明显，杂交阳性
细胞巢状，表层(上方)细胞杂交信号粗块状，近基底细胞杂交信
号颗粒状。(冰冻切片，ISH，甲基绿复染200×)
图3 原位癌：杂交信号弥漫分布于上皮全层，均呈颗粒状。
(冰冻切片，ISH，甲基绿复染400×)
图4 鳞癌Ⅲ级：杂交阳性细胞弥散分布于癌巢内，不同细胞内
杂交信号颗粒多少不等。(冰冻切片，ISH，甲基绿复染，400×)
, 百拇医药
3 讨论
食管癌和HPV的关系是近十余年来病理学者感兴趣的研究课题，我们用灵敏度高的PCR方法和特异性强的ISH方法证实汕头沿海食管癌高发区食管组织HPV阳性率很高(分别为92.72%和81.80%)。Ec/CUHK1或Ec/CUHK2细胞抽提DNA作为每次PCR实验的对照，结果均为阴性，表明PCR检测阳性结果非污染所致。经ISH证实HPVDNA杂交点皆存在于细胞核内，排除非特异性杂交信号(背景)，说明食管癌组织中确实存在HPV感染，且HPVDNA有可能已和宿主细胞DNA整合。
用HPVL1区共用引物PCR结果表明癌旁粘膜HPV检出率高于浸润癌，ISH检测也得出同样的结果，提示用食管组织作HPV感染的分子流行病学调查，选择取材部位极其重要。我们的结果与Chang用ISH方法检测相一致，即杂交信号多数位于癌旁粘膜增生或/和不典型增生部位。分析其原因可能：(1)HPV病毒的成熟与上皮的角化程度有关，癌细胞分化差，不利于HPVDNA的复制；(2)HPVDNA作为病因在食管上皮癌变过程中发挥作用，而在已癌变上皮并非维持恶性所必须；(3)食管癌组织中HPV DNA是以整合状态存在[3]，且在整合过程中可能发生了某些基因片段的缺失[7]。本研究用Dig-HPV18为探针，在原位观察HPV感染不同病毒的信号分布特征，结果显示高拷贝的HPV感染见于癌旁“正常”、单纯增生上皮阳性细胞，杂交信号呈粗块状；原位癌杂交阳性信号呈颗粒状，而浸润癌阳性细胞数量少且信号弱，提示为低拷贝的HPV感染，这一实验结果也支持上述3种可能原因的成立。
, http://www.100md.com
食管癌的发生是多因素、多阶段的，其发生除与饮食、环境、遗传因素有关外，食管癌组织HPV感染率高这一因素不容忽视。本研究用PCR和ISH对同1例两份标本分别检测，感染率分别高达92.72%和81.80%，与Chang对我国另一食管癌高发区河南林县病例进行研究的结果相类似[2]，同时作者还曾对高低发区食管癌组织HPV检出情况进行比较[8]，汕头高发区食管癌组织HPV感染率明显高于广州低发区，提示HPV感染与食管癌有关，为食管癌的病因之一，但其作用机理仍有待于进一步研究。
△现在空军广州医院全军传染病中心工作
参考文献
1 周键，陈全录，沈琼，等.食管癌标本中人乳头状瘤病毒(HPV)DNA序列的检测〔J〕.河南医科大学学报，1987，22(1)：1.
, http://www.100md.com 2 Chang F,Syrjanen S,Shen Q,et al.Human papilomavirus involvement in esophageal precancerous lesions and squamous cell carcinomas as evidenced by microscopy and different DNA techniques〔J〕.Scand J Gastroenterol,1992,27:553.
3 李茵，黄光琦，肖恒怡，等.食管癌及癌旁组织中人乳头状瘤病毒DNA的存在状态〔J〕.华西医科大学学报，1991，22(2)：157.
4 Willamson AL,Jaskoesocz K,Guning A,et al.The detection of human papillomavirus in oesophageal lesions〔J〕.Anticancer Res,1991,11(1):321.
, 百拇医药
5 陆士新，罗岐，李华川，等.食管癌和癌旁上皮中乳头状病毒的检测〔J〕.中华肿瘤杂志，1995，17(5)：263.
6 Yoshikawa H,Kawana T,Kitagowa K,et al.Detection and typing of multiple genital human papillomaviruses by DNA amplification with consensus primers〔J〕.Jpn J Cancer Res,1991,82:524.
7 Toh Y,Kuwano H,Tanaka S,et al.Detection of human papillomavirus DNA in esophageal carcinoma in Japan by polymerase chain reaction〔J〕.Cancer,1992,70(9):2234.
8 吕丽春，沈忠英，邱向南，等.高低发区食管癌组织人乳头状瘤病毒的PCR检测〔J〕.癌症，1997，16(5)：341.
收稿日期：1998-09-03, 百拇医药
单位：汕头大学医学院病理教研室(广东汕头，515031)
关键词：食管肿瘤；人乳头状瘤病毒；聚合酶链式反应技术；原位杂交
癌症/990215
【摘要】目的：探索汕头高发区食管癌的发病是否与HPV感染有关。方法：用L1区共用引物PCR和HPV18DNA探针原位杂交技术对55例新鲜食管癌标本进行检测。结果：PCR和原位杂交的HPV阳性检出率分别为92.72%和81.80%，癌旁粘膜HPV检出率高于癌组织(P<0.05)。而且原位杂交提示不同病变杂交信号分布特征不同：癌旁“正常”和单纯增生上皮呈层状分布，原位癌层状分布特征消失，阳性细胞弥散全层，浸润癌呈区域性阳性。结论：HPV感染可能是食管癌的病因之一。
中图号：R730.2 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)02-0162-03
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Detection of human papillomavirus(HPV) on esophageal
carcinoma by PCR and in-situ hybridization
LU Li-chun,SHEN Zhong-yin,YOU Shao-jin,et al
Department of Pathology,Shantou University Medical College,Shantou 515031,China
【Abstract】 Purpose： To search wether HPV infection is associated with esophageal carcinoma.Method：： L1 concensus primers in the Polymerase Chain Reaction(PCR) and HPV 18 probe in In- situ Hybridization(ISH) were used for the detection of HPV infection from each of 55 fresh esophageal carcinoma secimens.Results：： The positive rate of esophageal cancer tissue was 92.72% and 81.80% respectively by PCR and ISH.Paracarcinoma mucosa had higher positive rate than that of cancer(P<0.05).Moreover,HPV hybridization signals were related to the epithelial lesions.HPV 18 hybridization signals were distributed in layers in normal and simple hyperplasia epithelium.The spots were diffusively distributed in the whole epithelium and layer characteristics disappeared in carcinoma in-situ.Hybridization signals were focally positive in invasive cancer.Conclusion：： It suggested that HPV infection might be one of the causes of esophageal carcinoma.
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Key words： Esophageal neoplasms;Human papillomavirus;Polymerase chain reaction;In-situ hybridization
人乳头状瘤病毒(HPV)是一种与人体肿瘤相关的病毒，它在人体的感染很普遍，食管粘膜鳞状上皮是其易感部位之一。既往研究不同国家和地区食管癌组织有不同HPV感染率的报道[1～4]，但也有完全阴性的结果[5]。本室用聚合酶链式反应技术(PCR)和原位DNA-DNA分子杂交(ISH)对汕头高发区食管癌和癌旁粘膜进行HPV检测，以探讨食管组织中HPV感染与食管癌的关系。
1 材料和方法
1.1 标本
取自1994年10月至1995年4月汕头大学医学院附属肿瘤医院外科手术切除并经病理确诊的新鲜食管癌标本55例，每例分别取癌灶，癌旁粘膜(癌灶边缘1cm内)和远端切缘粘膜各一式二分，分别用于组织DNA提取和冰冻切片。
, http://www.100md.com
HPV感染阴性食管癌细胞株Ec/CUHK2为方法学阴性对照，由香港中文大学邱殷庆教授惠赠。
1.2 组织DNA提取
新鲜组织剪碎匀浆，加入含蛋白酶K的消化缓冲液，酚、氯仿、异戊醇反复抽提去除蛋白，冷无水乙醇沉淀DNA。
1.3 PCR
L1区共用引物参照文献合成[6]，序列为：
L1C1 5’-CGTAAACGTTTTCCCTATTTTTTT-3’
L1C2 3’-GTTATGTCTCATAAATCCCAT-5’
该区在HPV6，11，16，18，31，33同源序列占90%左右。
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PCR条件按文献设计，根据文献[6]判定结果，HPV6、11扩增片段244bp；HPV16、18扩增片段253bp;HPV31、33扩增片段256bp。整个PCR操作过程严格防污染。
1.4 探针的制备
HPV18重组质粒DNA转化的大肠杆菌，在含氨苄青霉素的LB培养基上挑出活化的大肠杆菌克隆，置37℃LB液中振荡培养，碱变性法抽提质粒DNA，用EcoRⅠ酶切，透析袋电洗脱法回收，地高辛——随机引物标记法标记探针，用点膜的方法对标记探针进行效能鉴定。
1.5 冰冻切片和原位杂交
取材后每例3份样本经O.C.T包埋在一起，常规冰冻切片，一片经HE染色作病理形态学诊断，其余作ISH用。冰冻切片经蛋白酶K消化后，杂交缓冲液直接滴片，〔杂交缓冲液组成：10%(W/V)硫酸葡聚糖，50%(V/V)去离子甲酰胺、2×SSC、100ng/mlssDNA、0.01(W/V)PVP〕，92℃变性3分钟，冰浴3分钟，42℃复性过夜，全部洗片过程均在37℃进行，按地高辛标记试剂盒推荐方法显色，8～10小时终止反应，切片以甲基绿复染细胞核。
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ISH设以下对照：①无探针对照；②杂交后不加酶连抗地高辛抗体对照；③DNaseⅠ消化对照；④组织或HPV18DNA探针未经热变性即进行杂交变性对照。
2 结果
2.1 HPVPCR检测
55例标本中，HPVDNA阳性51例(每例3份样本中有1份检出HPVDNA，即判定为该例阳性)，阳性率92.72%。同例标本不同部位检出率见表1，其中，癌旁粘膜HPV阳性率高于癌灶HPVDNA的检出率(P<0.05)。
表1 食管癌组织共用引物PCR检测HPV阳性率 组别
标本例数
阳性例数
阳性率(%)
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切缘粘膜
55
48
87.27
癌旁粘膜
55
50
90.91
癌组织
55
41
74.55
实验对照：无模版DNA扩增对照、Ec/CUHK1或Ec/CUHK2细胞DNA扩增对照未见任何产物。
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2.2 HPVISH法检测
55例中有1个部位以上ISH法阳性者共45例，占81.80%，4例PCR法全阴性者ISH法也阴性。食管不同部位HPV检出率见表2，切缘粘膜和癌旁粘膜阳性率明显高于癌组织(P<0.05)。表2 食管癌组织ISH检测HPV阳性率 组别
标本例数
阳性例数
阳性率(%)
切缘粘膜
55
43
78.18
癌旁粘膜
, 百拇医药
55
42
76.36
癌组织
55
15
27.27
HPV18DNA阳性杂交点位于细胞核内。正常粘膜上皮(图1)，阳性杂交点居粘膜上皮上三分之一，越近表层，阳性细胞数越多，杂交点粗而多，甚至呈块状。单纯增生粘膜上皮，杂交阳性细胞层次随上皮的增生而加厚，但也有与正常上皮相似的层状分布，多占上皮三分之一厚。不典型增生粘膜上皮(图2)，阳性细胞层次不明显，多数病例占上皮全层三分之二厚以上，表层阳性信号粗块状，近基底细胞信号颗粒状。原位癌(图3)，层状分布特征消失，杂交信号较弥散地分布于上皮全层，均呈颗粒状。浸润癌(图4)，杂交阳性细胞分布不均匀，多数为区域性阳性，数量少且信号弱，少数病例有较强的信号弥漫分布。
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图1 正常粘膜上皮：杂交信号位于上皮浅表层，层状分布明显。
(冰冻切片，ISH，甲基绿复染200×)
图2 Ⅱ°不典型增生粘膜上皮：层状分布特征不明显，杂交阳性
细胞巢状，表层(上方)细胞杂交信号粗块状，近基底细胞杂交信
号颗粒状。(冰冻切片，ISH，甲基绿复染200×)
图3 原位癌：杂交信号弥漫分布于上皮全层，均呈颗粒状。
(冰冻切片，ISH，甲基绿复染400×)
图4 鳞癌Ⅲ级：杂交阳性细胞弥散分布于癌巢内，不同细胞内
杂交信号颗粒多少不等。(冰冻切片，ISH，甲基绿复染，400×)
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3 讨论
食管癌和HPV的关系是近十余年来病理学者感兴趣的研究课题，我们用灵敏度高的PCR方法和特异性强的ISH方法证实汕头沿海食管癌高发区食管组织HPV阳性率很高(分别为92.72%和81.80%)。Ec/CUHK1或Ec/CUHK2细胞抽提DNA作为每次PCR实验的对照，结果均为阴性，表明PCR检测阳性结果非污染所致。经ISH证实HPVDNA杂交点皆存在于细胞核内，排除非特异性杂交信号(背景)，说明食管癌组织中确实存在HPV感染，且HPVDNA有可能已和宿主细胞DNA整合。
用HPVL1区共用引物PCR结果表明癌旁粘膜HPV检出率高于浸润癌，ISH检测也得出同样的结果，提示用食管组织作HPV感染的分子流行病学调查，选择取材部位极其重要。我们的结果与Chang用ISH方法检测相一致，即杂交信号多数位于癌旁粘膜增生或/和不典型增生部位。分析其原因可能：(1)HPV病毒的成熟与上皮的角化程度有关，癌细胞分化差，不利于HPVDNA的复制；(2)HPVDNA作为病因在食管上皮癌变过程中发挥作用，而在已癌变上皮并非维持恶性所必须；(3)食管癌组织中HPV DNA是以整合状态存在[3]，且在整合过程中可能发生了某些基因片段的缺失[7]。本研究用Dig-HPV18为探针，在原位观察HPV感染不同病毒的信号分布特征，结果显示高拷贝的HPV感染见于癌旁“正常”、单纯增生上皮阳性细胞，杂交信号呈粗块状；原位癌杂交阳性信号呈颗粒状，而浸润癌阳性细胞数量少且信号弱，提示为低拷贝的HPV感染，这一实验结果也支持上述3种可能原因的成立。
, http://www.100md.com
食管癌的发生是多因素、多阶段的，其发生除与饮食、环境、遗传因素有关外，食管癌组织HPV感染率高这一因素不容忽视。本研究用PCR和ISH对同1例两份标本分别检测，感染率分别高达92.72%和81.80%，与Chang对我国另一食管癌高发区河南林县病例进行研究的结果相类似[2]，同时作者还曾对高低发区食管癌组织HPV检出情况进行比较[8]，汕头高发区食管癌组织HPV感染率明显高于广州低发区，提示HPV感染与食管癌有关，为食管癌的病因之一，但其作用机理仍有待于进一步研究。
△现在空军广州医院全军传染病中心工作
参考文献
1 周键，陈全录，沈琼，等.食管癌标本中人乳头状瘤病毒(HPV)DNA序列的检测〔J〕.河南医科大学学报，1987，22(1)：1.
, http://www.100md.com 2 Chang F,Syrjanen S,Shen Q,et al.Human papilomavirus involvement in esophageal precancerous lesions and squamous cell carcinomas as evidenced by microscopy and different DNA techniques〔J〕.Scand J Gastroenterol,1992,27:553.
3 李茵，黄光琦，肖恒怡，等.食管癌及癌旁组织中人乳头状瘤病毒DNA的存在状态〔J〕.华西医科大学学报，1991，22(2)：157.
4 Willamson AL,Jaskoesocz K,Guning A,et al.The detection of human papillomavirus in oesophageal lesions〔J〕.Anticancer Res,1991,11(1):321.
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5 陆士新，罗岐，李华川，等.食管癌和癌旁上皮中乳头状病毒的检测〔J〕.中华肿瘤杂志，1995，17(5)：263.
6 Yoshikawa H,Kawana T,Kitagowa K,et al.Detection and typing of multiple genital human papillomaviruses by DNA amplification with consensus primers〔J〕.Jpn J Cancer Res,1991,82:524.
7 Toh Y,Kuwano H,Tanaka S,et al.Detection of human papillomavirus DNA in esophageal carcinoma in Japan by polymerase chain reaction〔J〕.Cancer,1992,70(9):2234.
8 吕丽春，沈忠英，邱向南，等.高低发区食管癌组织人乳头状瘤病毒的PCR检测〔J〕.癌症，1997，16(5)：341.
收稿日期：1998-09-03, 百拇医药