犬利什曼病的流行、诊断和防制
作者：王雅静 刘佩娜
单位：王雅静(华西医科大学寄生虫学教研室， 四川 成都 610041)；刘佩娜(华西医科大学寄生虫学教研室， 四川 成都 610041)
关键词：
实用寄生虫病杂志000218 中图分类号：R531.6 文献标识码：A
文章编号：1005-2534(2000)02-0072-03
动物源性内脏利什曼病(ZVL)是重要的寄生虫病之一。该病在中美、南欧、北非、东西非的下撒哈拉地区，西南亚和中国流行。特别是罹及小儿和免疫缺陷的成人。其家畜保虫宿主主要是犬，森林中的保虫宿主为犬科动物。在此病存在的地区，感染的野生动物进入农家掠食家禽时，寄生虫进入居家流行环。此时，庭院附近的白蛉因吸食野生动物血而感染，尔后白蛉将病原传染家犬，形成人附近的犬—昆虫—犬传播环。如感染的白蛉叮咬人，人即获感染[1]。现将犬利什曼病的流行、诊断和防制综述如下。
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1 犬利什曼病的流行
在意大利北部维亚艾米利亚地区曾有黑热病爆发，1971～1972年共发现60例利什曼病患者，其中58例发生在丘陵地带。Pampiglione等(1974)[2]对无症状的8 454只犬作补体结合试验，阳性率为1.6%。当地有Phlebotomus perfiliewi存在。在法国南部的马赛和尼斯等地有较多的黑热病病人。AL-Zahrani等(1988)[3]检测了分布在沙特阿拉伯两个利什曼病人高发区的野狗群。将捕获的89只野狗杀死，取肝脾组织做成印片，镜检发现6只(6.7%)犬有利什曼原虫。Evans等(1990)[4]在巴西东北部受检的405条犬中IFA血清法检出阳性69例(17%)，而在当时，家犬是杜氏利什曼原虫恰氏亚种的主要保虫宿主。在以色列中部地区毗邻大都市的村庄中有内脏利什曼病的流行。Benath等(1998)[5]以粗制利什曼原虫抗原为诊断抗原的ELISA结果显示：已有病例报告的两个村庄受检的122只家犬，14只阳性(11.5%)，邻近5个村庄受检的99只家犬，1只阳性(1.0%)。其中12只犬经活检后培养出利什曼原虫前鞭毛体，经CP-PCR(ciamped polymorphic-PCR)，单克隆抗体证实为婴儿利什曼原虫。
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犬感染利什曼原虫后主要症状有淋巴结肿大，眼、鼻周围糠状皮炎，皮毛无光泽和脱落，鼻出血，角膜结膜炎，趾甲弯曲，体重明显下降，肝脾肿大，在许多组织内包括皮肤均可发现原虫。在欧洲的犬利什曼病疫点，50%以上阳性犬无症状，但这类犬和有症状的一样能感染白蛉[6]。Dye(1988)[7]根据法国南部犬内脏利什曼病传播的生物学资料，建立了一个分室模型，该模型有两个特点：①能预测白蛉密度的阈值，低于此阈值，传播将被阻断；②当白蛉高密度时，犬内脏利什曼病患病率最大值应作为未知量来考虑。
在我国陇南、川北的黑热病高发区内，犬内脏利什曼病的患病率历来甚高，属于犬源性内脏利什曼病流行区。1985年，甘肃省地方病防治所在文县抽查4个发病乡6个自然村的家犬90只，经骨髓穿刺查出病犬15只(16.7%)，其中有1个自然村共养7只犬，在抽查的5只犬中有4只是病犬。1986年，在文县另一流行村灭犬过程中，随意查犬4只，全部阳性。1987年，又在礼县的两个流行村内查犬26只，检出带有利什曼原虫的病犬6只(23.1%)[8]。王秀珍等(1991)[9]用快速ELISA法检测了采自四川省汶川县黑热病重流行区的124份犬血清，查出阳性犬39只，占31.45%。王子龙等(1991)[10]用利什曼原虫kDNA印迹杂交法对采自甘肃省文县黑热病流行区的30只家犬耳缘皮肤组织印迹样品进行杂交试验。结果有8份呈阳性反应(26.7%)。由此可以认为这些流行区的犬利什曼病相当普遍。
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2 犬利什曼病的诊断
2.1 骨髓穿刺涂片法
此法最大的优点是以查出病原体为诊断依据，故准确性高，但取骨髓及检查过程均较为繁杂，且耗费大量人力、物力[8]。近年常将此方法作为其他实验检测手段的对照[9，10]。
2.2 检测血清抗体
2.2.1 较早用于检测病犬血清抗体的方法有补体结合试验(CFT)[2，11]，间接血凝试验(IHAT)[12]和对流免疫电泳(CIEP)[12]。这些方法敏感性和特异性均不够高，现已很少采用。
2.2.2 间接免疫荧光抗体试验(IFAT) Francesca等(1988)[12]用88只犬的血清作IFAT。结果，A、B、C三组的敏感性均为100%。D、E两组的特异性也均为100%。Evans等(1990)[4]在巴西东北部调查了405只犬，取其血样本作IFAT。结果，滤纸干血清法为8%的阳性率，用血清则为17%的阳性率。IFAT虽然敏感性和特异性均较高，但仪器昂贵，不适合基层推广应用。
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2.2.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) Srivastava等(1984)[13]在印度西北部用滤纸采血采集了325份犬血样本，并且同时收集血清，将血清和滤纸血作ELISA。结果，6只犬呈阳性反应，而病原学检查皆呈阴性反应。Evans等(1990)[4]在巴西东北部取405只犬血样本作ELISA，阳性率为38%。而且，所有病原学检查阳性的标本，ELISA检测均阳性。王秀珍等(1991)[9]用快速ELISA法检测了汶川县黑热病重流行区的124份犬血清，阳性率为31.45%，而骨髓涂片法的阳性率为19.35%。对47份采自非流行区的正常犬血清，只有1例呈假阳性反应，占2.13%。用快速ELISA法检测实验感染了旋毛虫、肺吸虫、钩虫、弓形虫等犬血清共26份，均未见交叉反应。说明ELISA的敏感性和特异性均较高。
2.3 检测血清循环抗原
胡孝素等(1991)[14]用单克隆抗体-抗原斑点试验(McAb-AST)及骨髓穿刺涂片法对四川省汶川县125只犬进行感染利什曼原虫调查，骨髓涂片法查出原虫的阳性犬46只，感染率为36.8%。而McAb-AST的结果与骨髓涂片阳性符合率为97.8%，总符合率95.2%。王雅静等(1991)[15]用McAb-AST检测采自甘肃省文县的30份犬血清循环抗原，阳性率为30%，与骨髓穿刺涂片法的总符合率为86.7%。同时检测50只非流行区犬血清，只有1只出现阳性反应(2%)。来自7只自然感染犬弓蛔虫幼犬血清及12只实验感染斯氏狸殖吸虫的犬血清中，McAb-AST试验皆呈阴性反应。王雅静等(1993)[16]将McAb-AST用于检测10只实验感染杜氏利什曼原虫的小犬血清循环抗原，感染后5天即出现阳性反应，并随着时间的加长，阳性反应程度也有加强。初步建立了犬利什曼病的早期诊断方法。McAb-AST具有较高敏感性和特异性，所需样品量微(2μl)，并且可用于早期诊断。
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2.4 聚合酶链反应技术(PCR)
杨文天等(1993)[17]将其自己设计的一对寡核苷酸引物Ⅰ和Ⅱ以及文献报导的一对引物A、B，用PCR法检测12只人工感染杜氏利什曼原虫的犬骨髓组织样品，7例呈阳性反应，骨髓涂片法8例查见原虫。Ashford等(1995)[18]用PCR方法对25只用骨髓穿刺物培养或仓鼠腹膜接种证明已感染利什曼原虫的犬均呈阳性(敏感性100%)，对35只阴性对照犬均呈阴性(特异性100%)。又对54只经穿刺物培养或仓鼠接种呈阴性的流行区犬进行PCR检测，22只呈阳性。同时采用FAST-ELISA进行血清学检测，46只呈阳性的犬中11只(24%)PCR法呈阴性；44只呈阴性的犬中21只(48%)PCR法呈阳性。比较两种方法，作者认为PCR法更为敏感、有效，可推广使用。
2.5 Dipstick法
为近年来新发展的诊断方法之一，操作简便，敏感性高。瞿靖琦等[19]采用利什曼原虫类Kinesin基因中编码39个氨基酸的重组基因片段产物rk39为抗原制备成Dipstick。对新疆喀什市郊3个生产队进行黑热病普查。选择7例肝、脾肿大的可疑患者进行Dipstick试验，6例出现蓝色条带者为阳性反应，与骨髓穿刺涂片及培养阳性符合率为100%。10名正常对照者无此反应。现场应用Dipstick无需任何仪器、设备，完全达到快速、简易和敏感特异的要求，为其他诊断方法所不及。可进一步应用于犬利什曼病的诊断。
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3 犬利什曼病的防制
防制犬利什曼病对控制黑热病是十分有效的措施。吴远祥等(1992)[20]在四川省黑热病重流行区以乡为单位，犬感染在15%以上和发病在10/万以上地区采取禁养家犬，原有家犬可转移、出售到无白蛉地区，余下者全部杀灭。3～5年内不准新养犬。在此线以下的乡建立犬卡，限制数量，犬主自交检查费，查出病犬一律杀灭。主动侦察病例，加强个人防护，对疫点周围进行灭蛉或浸泡蚊帐。通过汶川1990年试点。试点时每年病人60例，至1993年已下降到6例，下降90%。推广到理县和茂县，也收到满意的效果[21]。熊光华等(1995)[22]在犬内脏利什曼病的高发区四川南坪县，择三乡一镇，连续两年(1992～1993)开展家犬溴氰菊酯药浴实验，浴犬率达99.0%以上。实验前的1991年度实验区内脏利什曼病新感染犬13例，经1年2次连续2年的浴犬工作，1993年度实验区内未见新发病例出现。显示该浴犬法对于阻断内脏利什曼病的传播具有较好的效果，并具有一定的推广意义。
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内脏利什曼病是一世界范围分布的人畜共患寄生虫病，犬是主要的保虫宿主。对犬利什曼病快速准确诊断及防制是控制内脏利什曼病的重要环节。诊断方面已从操作流程较复杂、敏感性和特异性较低的CFT发展到快速ELISA法及循环抗原的检测。PCR技术的引入表明诊断已发展到DNA水平。防制方面已向疫苗方向发展，疫苗通过保护犬不受感染达到最终控制人内脏利什曼病的目的[23]。
参考文献：
[1] Tesh RB.Control of zoonotic visceral leishmaniasis:Is it time to change strategies[J]?Am J Trop Med Hyg,1995，52(3):287.
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单位：王雅静(华西医科大学寄生虫学教研室， 四川 成都 610041)；刘佩娜(华西医科大学寄生虫学教研室， 四川 成都 610041)
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实用寄生虫病杂志000218 中图分类号：R531.6 文献标识码：A
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1 犬利什曼病的流行
在意大利北部维亚艾米利亚地区曾有黑热病爆发，1971～1972年共发现60例利什曼病患者，其中58例发生在丘陵地带。Pampiglione等(1974)[2]对无症状的8 454只犬作补体结合试验，阳性率为1.6%。当地有Phlebotomus perfiliewi存在。在法国南部的马赛和尼斯等地有较多的黑热病病人。AL-Zahrani等(1988)[3]检测了分布在沙特阿拉伯两个利什曼病人高发区的野狗群。将捕获的89只野狗杀死，取肝脾组织做成印片，镜检发现6只(6.7%)犬有利什曼原虫。Evans等(1990)[4]在巴西东北部受检的405条犬中IFA血清法检出阳性69例(17%)，而在当时，家犬是杜氏利什曼原虫恰氏亚种的主要保虫宿主。在以色列中部地区毗邻大都市的村庄中有内脏利什曼病的流行。Benath等(1998)[5]以粗制利什曼原虫抗原为诊断抗原的ELISA结果显示：已有病例报告的两个村庄受检的122只家犬，14只阳性(11.5%)，邻近5个村庄受检的99只家犬，1只阳性(1.0%)。其中12只犬经活检后培养出利什曼原虫前鞭毛体，经CP-PCR(ciamped polymorphic-PCR)，单克隆抗体证实为婴儿利什曼原虫。
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犬感染利什曼原虫后主要症状有淋巴结肿大，眼、鼻周围糠状皮炎，皮毛无光泽和脱落，鼻出血，角膜结膜炎，趾甲弯曲，体重明显下降，肝脾肿大，在许多组织内包括皮肤均可发现原虫。在欧洲的犬利什曼病疫点，50%以上阳性犬无症状，但这类犬和有症状的一样能感染白蛉[6]。Dye(1988)[7]根据法国南部犬内脏利什曼病传播的生物学资料，建立了一个分室模型，该模型有两个特点：①能预测白蛉密度的阈值，低于此阈值，传播将被阻断；②当白蛉高密度时，犬内脏利什曼病患病率最大值应作为未知量来考虑。
在我国陇南、川北的黑热病高发区内，犬内脏利什曼病的患病率历来甚高，属于犬源性内脏利什曼病流行区。1985年，甘肃省地方病防治所在文县抽查4个发病乡6个自然村的家犬90只，经骨髓穿刺查出病犬15只(16.7%)，其中有1个自然村共养7只犬，在抽查的5只犬中有4只是病犬。1986年，在文县另一流行村灭犬过程中，随意查犬4只，全部阳性。1987年，又在礼县的两个流行村内查犬26只，检出带有利什曼原虫的病犬6只(23.1%)[8]。王秀珍等(1991)[9]用快速ELISA法检测了采自四川省汶川县黑热病重流行区的124份犬血清，查出阳性犬39只，占31.45%。王子龙等(1991)[10]用利什曼原虫kDNA印迹杂交法对采自甘肃省文县黑热病流行区的30只家犬耳缘皮肤组织印迹样品进行杂交试验。结果有8份呈阳性反应(26.7%)。由此可以认为这些流行区的犬利什曼病相当普遍。
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2 犬利什曼病的诊断
2.1 骨髓穿刺涂片法
此法最大的优点是以查出病原体为诊断依据，故准确性高，但取骨髓及检查过程均较为繁杂，且耗费大量人力、物力[8]。近年常将此方法作为其他实验检测手段的对照[9，10]。
2.2 检测血清抗体
2.2.1 较早用于检测病犬血清抗体的方法有补体结合试验(CFT)[2，11]，间接血凝试验(IHAT)[12]和对流免疫电泳(CIEP)[12]。这些方法敏感性和特异性均不够高，现已很少采用。
2.2.2 间接免疫荧光抗体试验(IFAT) Francesca等(1988)[12]用88只犬的血清作IFAT。结果，A、B、C三组的敏感性均为100%。D、E两组的特异性也均为100%。Evans等(1990)[4]在巴西东北部调查了405只犬，取其血样本作IFAT。结果，滤纸干血清法为8%的阳性率，用血清则为17%的阳性率。IFAT虽然敏感性和特异性均较高，但仪器昂贵，不适合基层推广应用。
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2.2.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) Srivastava等(1984)[13]在印度西北部用滤纸采血采集了325份犬血样本，并且同时收集血清，将血清和滤纸血作ELISA。结果，6只犬呈阳性反应，而病原学检查皆呈阴性反应。Evans等(1990)[4]在巴西东北部取405只犬血样本作ELISA，阳性率为38%。而且，所有病原学检查阳性的标本，ELISA检测均阳性。王秀珍等(1991)[9]用快速ELISA法检测了汶川县黑热病重流行区的124份犬血清，阳性率为31.45%，而骨髓涂片法的阳性率为19.35%。对47份采自非流行区的正常犬血清，只有1例呈假阳性反应，占2.13%。用快速ELISA法检测实验感染了旋毛虫、肺吸虫、钩虫、弓形虫等犬血清共26份，均未见交叉反应。说明ELISA的敏感性和特异性均较高。
2.3 检测血清循环抗原
胡孝素等(1991)[14]用单克隆抗体-抗原斑点试验(McAb-AST)及骨髓穿刺涂片法对四川省汶川县125只犬进行感染利什曼原虫调查，骨髓涂片法查出原虫的阳性犬46只，感染率为36.8%。而McAb-AST的结果与骨髓涂片阳性符合率为97.8%，总符合率95.2%。王雅静等(1991)[15]用McAb-AST检测采自甘肃省文县的30份犬血清循环抗原，阳性率为30%，与骨髓穿刺涂片法的总符合率为86.7%。同时检测50只非流行区犬血清，只有1只出现阳性反应(2%)。来自7只自然感染犬弓蛔虫幼犬血清及12只实验感染斯氏狸殖吸虫的犬血清中，McAb-AST试验皆呈阴性反应。王雅静等(1993)[16]将McAb-AST用于检测10只实验感染杜氏利什曼原虫的小犬血清循环抗原，感染后5天即出现阳性反应，并随着时间的加长，阳性反应程度也有加强。初步建立了犬利什曼病的早期诊断方法。McAb-AST具有较高敏感性和特异性，所需样品量微(2μl)，并且可用于早期诊断。
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2.4 聚合酶链反应技术(PCR)
杨文天等(1993)[17]将其自己设计的一对寡核苷酸引物Ⅰ和Ⅱ以及文献报导的一对引物A、B，用PCR法检测12只人工感染杜氏利什曼原虫的犬骨髓组织样品，7例呈阳性反应，骨髓涂片法8例查见原虫。Ashford等(1995)[18]用PCR方法对25只用骨髓穿刺物培养或仓鼠腹膜接种证明已感染利什曼原虫的犬均呈阳性(敏感性100%)，对35只阴性对照犬均呈阴性(特异性100%)。又对54只经穿刺物培养或仓鼠接种呈阴性的流行区犬进行PCR检测，22只呈阳性。同时采用FAST-ELISA进行血清学检测，46只呈阳性的犬中11只(24%)PCR法呈阴性；44只呈阴性的犬中21只(48%)PCR法呈阳性。比较两种方法，作者认为PCR法更为敏感、有效，可推广使用。
2.5 Dipstick法
为近年来新发展的诊断方法之一，操作简便，敏感性高。瞿靖琦等[19]采用利什曼原虫类Kinesin基因中编码39个氨基酸的重组基因片段产物rk39为抗原制备成Dipstick。对新疆喀什市郊3个生产队进行黑热病普查。选择7例肝、脾肿大的可疑患者进行Dipstick试验，6例出现蓝色条带者为阳性反应，与骨髓穿刺涂片及培养阳性符合率为100%。10名正常对照者无此反应。现场应用Dipstick无需任何仪器、设备，完全达到快速、简易和敏感特异的要求，为其他诊断方法所不及。可进一步应用于犬利什曼病的诊断。
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3 犬利什曼病的防制
防制犬利什曼病对控制黑热病是十分有效的措施。吴远祥等(1992)[20]在四川省黑热病重流行区以乡为单位，犬感染在15%以上和发病在10/万以上地区采取禁养家犬，原有家犬可转移、出售到无白蛉地区，余下者全部杀灭。3～5年内不准新养犬。在此线以下的乡建立犬卡，限制数量，犬主自交检查费，查出病犬一律杀灭。主动侦察病例，加强个人防护，对疫点周围进行灭蛉或浸泡蚊帐。通过汶川1990年试点。试点时每年病人60例，至1993年已下降到6例，下降90%。推广到理县和茂县，也收到满意的效果[21]。熊光华等(1995)[22]在犬内脏利什曼病的高发区四川南坪县，择三乡一镇，连续两年(1992～1993)开展家犬溴氰菊酯药浴实验，浴犬率达99.0%以上。实验前的1991年度实验区内脏利什曼病新感染犬13例，经1年2次连续2年的浴犬工作，1993年度实验区内未见新发病例出现。显示该浴犬法对于阻断内脏利什曼病的传播具有较好的效果，并具有一定的推广意义。
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内脏利什曼病是一世界范围分布的人畜共患寄生虫病，犬是主要的保虫宿主。对犬利什曼病快速准确诊断及防制是控制内脏利什曼病的重要环节。诊断方面已从操作流程较复杂、敏感性和特异性较低的CFT发展到快速ELISA法及循环抗原的检测。PCR技术的引入表明诊断已发展到DNA水平。防制方面已向疫苗方向发展，疫苗通过保护犬不受感染达到最终控制人内脏利什曼病的目的[23]。
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