表皮生长因子对肿瘤敏感性和肾毒性的影响
作者：洪新 仲来福
单位：大连医科大学毒理研究室 (116027)
关键词：表皮生长因子；顺铂；肾毒性；药物敏感性
卫生毒理学杂志990201 内容摘要 为探讨外源性表皮生长因子在肿瘤治疗中的可能应用，小鼠接种肉瘤(S180),于接种后第2，6天腹腔注射顺铂(CDDP)2mg/kg，在CDDP处理的同时0小时，前12，前24小时皮下注射EGF 5μg/只及前24小时腹腔注射EGF 5μg/只；大鼠一次腹腔注射CDDP 5mg/kg，于CDDP处理前24小时皮下注射EGF 20μg/只。结果显示EGF腹腔及皮下处理均能促进S180生长；EGF只有于CDDP前皮下处理才能增高S180对CDDP敏感性；EGF增高敏感性的同时，小鼠去瘤体重及大鼠血清BUN、Cr水平均与对照组无差别。
, 百拇医药
Effects of epidermal growth factor on tumor sensitivity and nephrotoxicity of cisplatin
Hong Xin，Zhong Lai-fu
(Department of Toxicology,Dalian Medical University,Dalian 116027)
In order to explore the possibility use of epidermal growth factor (EGF) in tumor therapy，Kun Ming mice were seeded with sarcoma (S180)，2th，6th day after seeding，ip cisplatin (CDDP) 2mg/kg.0,12,24 h befor each CDDP treatment,sc EGF 5μg/rat and 24h befor each CDDP treatment,were treatedip EGF 5μg/rat.SD rats were treated ip CDDP 5mg/kg,24h before CDDP treatment，sc EGF 20μg/mouse.The results showed that sc or ip EGF treatment alone promoted growth of S180；sc EGF before CDDP treatment enhanced sensitivity of S180 to CDDP；EGF did not affect the toxicity of CDDP in nontumor body weight in mice and serum BUN，Cr level in rats.
, 百拇医药
Key words:Epidermal growth factor；Cisplatin；Nephrotoxicity；Drug sensitivity
表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)的生物学作用十分广泛。近年来研究表明，EGF还能够增高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[1,2]，这给肿瘤化疗提供了一个新线索同时对于揭示生长因子作用的机制也具有十分重要的意义。但是，目前关于EGF的给药方式、给药时机以及化疗效果增高的同时，对正常组织、器官的毒性变化研究甚少。顺式二氯二氨铂(顺铂，CDDP)是一常用且有效的抗肿瘤药，应用时可对正常组织细胞产生严重的毒性，其中肾毒性是CDDP限制剂量的主要毒副作用[3]。本研究旨在探讨外源性EGF作用下肿瘤细胞对CDDP敏感性的变化及其对CDDP肾毒性的影响，为EGF的应用提供依据。
材料与方法
, http://www.100md.com
一、药品
EGF系中国科学院遗传研究所提供，由小鼠颌下腺提取，批号：950323，临用前以生理盐水溶解。CDDP购自云南贵重金属研究所，其含量不低于96%，临用前以生理盐水溶解。
二、抑瘤试验
昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～22g，由本校实验动物中心提供。小鼠于右前肢腋下接种肉瘤(S180)瘤液0.2ml(瘤液细胞浓度1×107/ml)，24小时后随机分组，每组10只。具体分组及处理如下：1.生理盐水组；2.EGF皮下注射组：接种瘤液后第1，5天背部皮下注射；3.EGF腹腔注射组：接种瘤液后第1，5天腹腔注射；4.CDDP组；接种瘤液后第2，6天腹腔注射；5.皮下注射EGF与CDDP同时处理组；6.EGF提前12小时皮下注射组：每次CDDP处理前12小时背部皮下注射EGF；7.EGF提前24小时皮下注射组：每次CDDP处理前24小时背部皮下注射EGF；8.EGF提前24小时腹腔注射组：每次CDDP处理前24小时腹腔注射EGF。EGF给药剂量为每鼠5μg；CDDP给药剂量为2mg/kg。接种瘤液后第8天脱臼处死，剖取瘤组织。称取去瘤体重(剖出瘤组织后小鼠尸体重量)、瘤重并计算瘤重抑制率。
, 百拇医药
三、大鼠CDDP致肾毒性试验
SD大鼠24只，雄性，体重180～220g，由本校实验动物中心提供，随机分组，每组6只；设生理盐水对照组、EGF组、CDDP组、EGF预处理+CDDP组。EGF提前CDDP处理24小时于大鼠背部皮下给药(20μg/只)；于腹腔注射CDDP(5mg/kg)后第1，3，5天从眶下静脉丛采血测血尿素氮(BUN)(二乙酰一肟比色法)、肌酐(Cr)(碱性苦味酸比色法)。
四、统计处理
实验数据以
±s表示，用Student’s t检验进行显著性检验。
结 果
一、小鼠去瘤体重、瘤重、瘤重抑制率的变化
, 百拇医药
仅皮下注射或腹腔注射EGF，S180瘤重明显高于生理盐水对照组(P<0.05或0.01)。于腹腔注射CDDP前24小时经皮下注射给予EGF明显增高S180对CDDP的敏感性，即CDDP组和提前24小时皮下注射EGF组的瘤重分别为(0.99±0.46)g及(0.61±0.35)g，两者差别有显著性(P<0.05)，瘤重抑制率增高24%。腹腔注射CDDP前12小时经皮下注射给予EGF，瘤重虽然低于CDDP单独处理组，但两组瘤重未检测到差别有显著性(P>0.05)，而腹腔注射CDDP前腹腔注射EGF未增高S180对CDDP的敏感性。在EGF与CDDP多种联合处理方式中，荷瘤小鼠的去瘤体重与CDDP组差异无显著性(P>0.05)(表1)。
表1 EGF作用下S180对CDDP敏感性及去瘤体重的变化(±s) 组别
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瘤重(g)
瘤重抑
制率(%)
去瘤体
重(g)
生理盐水组
1.57±0.51
25.49±3.50
sc EGF组
1.93±0.68
24.31±1.97
ip EGF组
, 百拇医药
2.17±1.20**
23.60±3.20
CDDP组
0.99±0.46**
37
23.69±3.20
CDDP与sc EGF
同时处理组
0.97±0.46**
38
22.40±3.27
, 百拇医药
CDDP与提前12
小时sc EGF组
0.80±0.58**
49
24.97±3.86
CDDP与提前24
小时sc EGF组
0.61±0.35**▲
61
22.34±2.48
CDDP与提前24
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小时ip EGF组
1.11±0.51**
29
23.42±4.31
sc:皮下注射 ip:腹腔注射
与生理盐水组比较 *P<0.50，**P<0.01
与CDDP组比较 ▲P<0.05,二、EGF对CDDP所致大鼠肾毒性的影响
CDDP处理后第1天大鼠BUN、血Cr未见升高；第3，5天明显高于对照组(P<0.01)，第5天比第3天增高更明显(P<0.01)。CDDP组与EGF+CDDP组间的BUN、血Cr含量在3个时间点差异均无显著性(P>0.05)(表2)。
, 百拇医药
表2 EGF对CDDP所致大鼠BUN(mg/100 ml)和Cr(mg/100 ml)升高的影响(±s) 组别
第1天
第3天
第5天
BUN
Cr
BUN
Cr
BUN
Cr
生理盐水
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20.6±2.1
1.4±0.6
22.1±14.3
1.9±0.3
18.6±2.4
2.0±0.4
EGF
21.4±1.9
1.8±0.5
19.1±3.6
1.7±0.5
21.7±5.1
, 百拇医药
1.9±0.2
CDDP
22.0±1.4
1.3±0.5
48.3±42.6*
5.6±2.9**
165.6±117.9*
11.3±9.9**
EGF+CDDP
20.4±5.7
1.2±0.5
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47.5±21.7*
6.0±3.6**
208.8±71.9**
9.1±6.7**
与生理盐水组比较 *P<0.05 **P<0.01
讨 论
体外研究发现EGF能提高多种组织来源的肿瘤细胞(头颈部、宫颈、大肠、胰腺、前列腺、卵巢、非小细胞肺癌等)对多种化疗药物(丝裂霉素、顺铂、5-氟脲嘧啶、阿霉素、环磷酰胺等)的敏感性[1]，而且在对原代肿瘤细胞及实验性实体瘤的研究中也得到了同样的结论[4,5]，由此人们对EGF的作用有了新的认识。EGF发挥其生物学作用首先要与EGF受体(EGFR)结合，激活酪氨酸激酶(TK)，通过一系列生化反应使信号向核内转导，最后引起基因的活化。EGF增高肿瘤细胞对化疗药物敏感性的作用，说明EGF改变了肿瘤细胞对药物的反应，Christen等[4]认为EGF激活的信号转导通路决定了细胞对药物的敏感性。
, 百拇医药
在生理情况下，除造血系统的细胞外，几乎所有组织中都有EGFR的表达[7]，但是肿瘤细胞与正常组织细胞在EGFR数量上并不一样，研究表明，许多实体瘤细胞(肉瘤、大肠癌、卵巢癌等)比同器官的非恶性细胞表达EGFR数量多，这种EGFR数量的不同表达给EGF与CDDP联合治疗肿瘤提供了有力的依据[8]。
本研究的抑瘤实验表明，EGF皮下及腹腔处理，都显示了对肿瘤的促增殖作用，提示S180细胞具有EGF受体，这也是EGF发挥增高敏感性作用的前提。但只有对荷瘤小鼠进行EGF皮下预处理，肿瘤对CDDP的敏感性才显著增高，表明肿瘤细胞可能需要EGF持续预刺激并达到一定程度才能引起敏感性的增高，而EGF腹腔处理可能具有较短的持续时间；也可能是CDDP影响了EGF与其受体的结合，导致同时处理时EGF不能发挥其作用。因为顺铂在所用剂量下不能引起小鼠肾毒性，故本研究同时考察了CDDP对大鼠所致的肾毒性。结果表明：EGF未增高顺铂所致肾毒性，可能因为受体数目上的差异，导致肿瘤和正常肾组织对CDDP敏感性有所不同。
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致谢：中国科学院遗传研究所宋海燕老师提供EGF，本室宋淑云、张敏、叶建新、卢永科在实验中给予帮助。
参考文献
1.Kroning R,Jones JA,Hom DK,et al.Enhancement of drug sensitivity of malignancies by epidermal growth factor.Br J Cancer.1995，72(3):615～619.
2.Basu A,Evans RW.Comparison of effects of growth factors and protein Kinase C activators on cellular sensitivity to cisdiamminedichloroplatinum(Ⅱ).Int J Cancer，1994，58(4):587～591.
, 百拇医药
3.Von Hoff DD,Schilsky R,Reichert CM,et al.Toxic effect of cisdichlorodiamine-platium(Ⅱ) in man.Cancer Treat Rep，1979，63:1527～1531.
4.Singletary SE,Baker FL,Spitzer G,et al.Biological effect of epidermal growth factor on the in vitro growth of human tumors.Cancer research，1987，47:403～406.
5.Amagase H,Tamura K,Hashimoto K,et al.Response of A431 experimental human solid xenograft to mitomycin C in combination with human epidermal growth factor in mice.J Pharmacobiodyn，1990，13(4):263～268.
, http://www.100md.com
6.Christen RD,Hom DK,Porter DC,et al.Epidermal growth factor regulates the in vitro sensitivity of human ovarian carcinoma cells to cisplatin.J Clin Invest，1990，86(5):632～640.
7.薛沿宁，王会信.表皮生长因子.见：周廷冲，主编.多肽生长因子基础与临床，第1版.北京：中国科学技术出版社，1992，147.
8.Haley JD.Regulation of epidermal growth factor receptor expression and activation:a brief review.Proc Soc Exp Biol，1990，44:21～37.
(修回日期 1998年11月)
, 百拇医药
单位：大连医科大学毒理研究室 (116027)
关键词：表皮生长因子；顺铂；肾毒性；药物敏感性
卫生毒理学杂志990201 内容摘要 为探讨外源性表皮生长因子在肿瘤治疗中的可能应用，小鼠接种肉瘤(S180),于接种后第2，6天腹腔注射顺铂(CDDP)2mg/kg，在CDDP处理的同时0小时，前12，前24小时皮下注射EGF 5μg/只及前24小时腹腔注射EGF 5μg/只；大鼠一次腹腔注射CDDP 5mg/kg，于CDDP处理前24小时皮下注射EGF 20μg/只。结果显示EGF腹腔及皮下处理均能促进S180生长；EGF只有于CDDP前皮下处理才能增高S180对CDDP敏感性；EGF增高敏感性的同时，小鼠去瘤体重及大鼠血清BUN、Cr水平均与对照组无差别。
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Effects of epidermal growth factor on tumor sensitivity and nephrotoxicity of cisplatin
Hong Xin，Zhong Lai-fu
(Department of Toxicology,Dalian Medical University,Dalian 116027)
In order to explore the possibility use of epidermal growth factor (EGF) in tumor therapy，Kun Ming mice were seeded with sarcoma (S180)，2th，6th day after seeding，ip cisplatin (CDDP) 2mg/kg.0,12,24 h befor each CDDP treatment,sc EGF 5μg/rat and 24h befor each CDDP treatment,were treatedip EGF 5μg/rat.SD rats were treated ip CDDP 5mg/kg,24h before CDDP treatment，sc EGF 20μg/mouse.The results showed that sc or ip EGF treatment alone promoted growth of S180；sc EGF before CDDP treatment enhanced sensitivity of S180 to CDDP；EGF did not affect the toxicity of CDDP in nontumor body weight in mice and serum BUN，Cr level in rats.
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Key words:Epidermal growth factor；Cisplatin；Nephrotoxicity；Drug sensitivity
表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)的生物学作用十分广泛。近年来研究表明，EGF还能够增高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[1,2]，这给肿瘤化疗提供了一个新线索同时对于揭示生长因子作用的机制也具有十分重要的意义。但是，目前关于EGF的给药方式、给药时机以及化疗效果增高的同时，对正常组织、器官的毒性变化研究甚少。顺式二氯二氨铂(顺铂，CDDP)是一常用且有效的抗肿瘤药，应用时可对正常组织细胞产生严重的毒性，其中肾毒性是CDDP限制剂量的主要毒副作用[3]。本研究旨在探讨外源性EGF作用下肿瘤细胞对CDDP敏感性的变化及其对CDDP肾毒性的影响，为EGF的应用提供依据。
材料与方法
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一、药品
EGF系中国科学院遗传研究所提供，由小鼠颌下腺提取，批号：950323，临用前以生理盐水溶解。CDDP购自云南贵重金属研究所，其含量不低于96%，临用前以生理盐水溶解。
二、抑瘤试验
昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～22g，由本校实验动物中心提供。小鼠于右前肢腋下接种肉瘤(S180)瘤液0.2ml(瘤液细胞浓度1×107/ml)，24小时后随机分组，每组10只。具体分组及处理如下：1.生理盐水组；2.EGF皮下注射组：接种瘤液后第1，5天背部皮下注射；3.EGF腹腔注射组：接种瘤液后第1，5天腹腔注射；4.CDDP组；接种瘤液后第2，6天腹腔注射；5.皮下注射EGF与CDDP同时处理组；6.EGF提前12小时皮下注射组：每次CDDP处理前12小时背部皮下注射EGF；7.EGF提前24小时皮下注射组：每次CDDP处理前24小时背部皮下注射EGF；8.EGF提前24小时腹腔注射组：每次CDDP处理前24小时腹腔注射EGF。EGF给药剂量为每鼠5μg；CDDP给药剂量为2mg/kg。接种瘤液后第8天脱臼处死，剖取瘤组织。称取去瘤体重(剖出瘤组织后小鼠尸体重量)、瘤重并计算瘤重抑制率。
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三、大鼠CDDP致肾毒性试验
SD大鼠24只，雄性，体重180～220g，由本校实验动物中心提供，随机分组，每组6只；设生理盐水对照组、EGF组、CDDP组、EGF预处理+CDDP组。EGF提前CDDP处理24小时于大鼠背部皮下给药(20μg/只)；于腹腔注射CDDP(5mg/kg)后第1，3，5天从眶下静脉丛采血测血尿素氮(BUN)(二乙酰一肟比色法)、肌酐(Cr)(碱性苦味酸比色法)。
四、统计处理
实验数据以
±s表示，用Student’s t检验进行显著性检验。结 果
一、小鼠去瘤体重、瘤重、瘤重抑制率的变化
, 百拇医药
仅皮下注射或腹腔注射EGF，S180瘤重明显高于生理盐水对照组(P<0.05或0.01)。于腹腔注射CDDP前24小时经皮下注射给予EGF明显增高S180对CDDP的敏感性，即CDDP组和提前24小时皮下注射EGF组的瘤重分别为(0.99±0.46)g及(0.61±0.35)g，两者差别有显著性(P<0.05)，瘤重抑制率增高24%。腹腔注射CDDP前12小时经皮下注射给予EGF，瘤重虽然低于CDDP单独处理组，但两组瘤重未检测到差别有显著性(P>0.05)，而腹腔注射CDDP前腹腔注射EGF未增高S180对CDDP的敏感性。在EGF与CDDP多种联合处理方式中，荷瘤小鼠的去瘤体重与CDDP组差异无显著性(P>0.05)(表1)。
表1 EGF作用下S180对CDDP敏感性及去瘤体重的变化(
±s) 组别, http://www.100md.com
瘤重(g)
瘤重抑
制率(%)
去瘤体
重(g)
生理盐水组
1.57±0.51
25.49±3.50
sc EGF组
1.93±0.68
24.31±1.97
ip EGF组
, 百拇医药
2.17±1.20**
23.60±3.20
CDDP组
0.99±0.46**
37
23.69±3.20
CDDP与sc EGF
同时处理组
0.97±0.46**
38
22.40±3.27
, 百拇医药
CDDP与提前12
小时sc EGF组
0.80±0.58**
49
24.97±3.86
CDDP与提前24
小时sc EGF组
0.61±0.35**▲
61
22.34±2.48
CDDP与提前24
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小时ip EGF组
1.11±0.51**
29
23.42±4.31
sc:皮下注射 ip:腹腔注射
与生理盐水组比较 *P<0.50，**P<0.01
与CDDP组比较 ▲P<0.05,二、EGF对CDDP所致大鼠肾毒性的影响
CDDP处理后第1天大鼠BUN、血Cr未见升高；第3，5天明显高于对照组(P<0.01)，第5天比第3天增高更明显(P<0.01)。CDDP组与EGF+CDDP组间的BUN、血Cr含量在3个时间点差异均无显著性(P>0.05)(表2)。
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表2 EGF对CDDP所致大鼠BUN(mg/100 ml)和Cr(mg/100 ml)升高的影响(
±s) 组别第1天
第3天
第5天
BUN
Cr
BUN
Cr
BUN
Cr
生理盐水
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20.6±2.1
1.4±0.6
22.1±14.3
1.9±0.3
18.6±2.4
2.0±0.4
EGF
21.4±1.9
1.8±0.5
19.1±3.6
1.7±0.5
21.7±5.1
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1.9±0.2
CDDP
22.0±1.4
1.3±0.5
48.3±42.6*
5.6±2.9**
165.6±117.9*
11.3±9.9**
EGF+CDDP
20.4±5.7
1.2±0.5
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47.5±21.7*
6.0±3.6**
208.8±71.9**
9.1±6.7**
与生理盐水组比较 *P<0.05 **P<0.01
讨 论
体外研究发现EGF能提高多种组织来源的肿瘤细胞(头颈部、宫颈、大肠、胰腺、前列腺、卵巢、非小细胞肺癌等)对多种化疗药物(丝裂霉素、顺铂、5-氟脲嘧啶、阿霉素、环磷酰胺等)的敏感性[1]，而且在对原代肿瘤细胞及实验性实体瘤的研究中也得到了同样的结论[4,5]，由此人们对EGF的作用有了新的认识。EGF发挥其生物学作用首先要与EGF受体(EGFR)结合，激活酪氨酸激酶(TK)，通过一系列生化反应使信号向核内转导，最后引起基因的活化。EGF增高肿瘤细胞对化疗药物敏感性的作用，说明EGF改变了肿瘤细胞对药物的反应，Christen等[4]认为EGF激活的信号转导通路决定了细胞对药物的敏感性。
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在生理情况下，除造血系统的细胞外，几乎所有组织中都有EGFR的表达[7]，但是肿瘤细胞与正常组织细胞在EGFR数量上并不一样，研究表明，许多实体瘤细胞(肉瘤、大肠癌、卵巢癌等)比同器官的非恶性细胞表达EGFR数量多，这种EGFR数量的不同表达给EGF与CDDP联合治疗肿瘤提供了有力的依据[8]。
本研究的抑瘤实验表明，EGF皮下及腹腔处理，都显示了对肿瘤的促增殖作用，提示S180细胞具有EGF受体，这也是EGF发挥增高敏感性作用的前提。但只有对荷瘤小鼠进行EGF皮下预处理，肿瘤对CDDP的敏感性才显著增高，表明肿瘤细胞可能需要EGF持续预刺激并达到一定程度才能引起敏感性的增高，而EGF腹腔处理可能具有较短的持续时间；也可能是CDDP影响了EGF与其受体的结合，导致同时处理时EGF不能发挥其作用。因为顺铂在所用剂量下不能引起小鼠肾毒性，故本研究同时考察了CDDP对大鼠所致的肾毒性。结果表明：EGF未增高顺铂所致肾毒性，可能因为受体数目上的差异，导致肿瘤和正常肾组织对CDDP敏感性有所不同。
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致谢：中国科学院遗传研究所宋海燕老师提供EGF，本室宋淑云、张敏、叶建新、卢永科在实验中给予帮助。
参考文献
1.Kroning R,Jones JA,Hom DK,et al.Enhancement of drug sensitivity of malignancies by epidermal growth factor.Br J Cancer.1995，72(3):615～619.
2.Basu A,Evans RW.Comparison of effects of growth factors and protein Kinase C activators on cellular sensitivity to cisdiamminedichloroplatinum(Ⅱ).Int J Cancer，1994，58(4):587～591.
, 百拇医药
3.Von Hoff DD,Schilsky R,Reichert CM,et al.Toxic effect of cisdichlorodiamine-platium(Ⅱ) in man.Cancer Treat Rep，1979，63:1527～1531.
4.Singletary SE,Baker FL,Spitzer G,et al.Biological effect of epidermal growth factor on the in vitro growth of human tumors.Cancer research，1987，47:403～406.
5.Amagase H,Tamura K,Hashimoto K,et al.Response of A431 experimental human solid xenograft to mitomycin C in combination with human epidermal growth factor in mice.J Pharmacobiodyn，1990，13(4):263～268.
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6.Christen RD,Hom DK,Porter DC,et al.Epidermal growth factor regulates the in vitro sensitivity of human ovarian carcinoma cells to cisplatin.J Clin Invest，1990，86(5):632～640.
7.薛沿宁，王会信.表皮生长因子.见：周廷冲，主编.多肽生长因子基础与临床，第1版.北京：中国科学技术出版社，1992，147.
8.Haley JD.Regulation of epidermal growth factor receptor expression and activation:a brief review.Proc Soc Exp Biol，1990，44:21～37.
(修回日期 1998年11月)
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