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编号:10285746
伽玛刀照射大鼠前脑时小胶质细胞的反应
http://www.100md.com 《第四军医大学学报》 2000年第10期
     作者:杨婷 段丽 饶志仁 鞠躬

    单位:第四军医大学全军神经科学研究所, 陕西 西安 710033

    关键词:小胶质细胞;伽玛刀;尾壳核;免疫组织化学

    第四军医大学学报001014 摘 要:目的 本研究以小胶质细胞作为中枢神经系统对损伤反应和免疫防护的一种标志,在伽玛刀治疗仪中用不同剂量的伽玛射线照射正常大鼠前脑一侧尾壳核,探讨小胶质细胞与射线损伤的剂量-效应关系,为伽玛刀的治疗剂量选择提供依据. 方法 以OX42抗体作为检测小胶质细胞的标志,用免疫组织化学方法观察小胶质细胞在照射靶区及其周围组织的形态和数量变化. 结果 ①低剂量(10~30 Gy)射线照射时,小胶质细胞数目在照射侧增加,而对侧各组织阳性细胞数较少;②中剂量(40~60 Gy)照射时,照射靶区(尾壳核)阳性细胞数目减少,且靶区及其周围组织出现活化小胶质细胞即胞体变大,形态多样,突起变短、少;③大剂量(70~100 Gy)照射时,照射靶区出现坏死空洞,该空洞随剂量加大而增大,靶区及其周围组织水肿,且小胶质细胞变为吞噬细胞状并且胞体内可见吞噬颗粒,对侧脑中阳性细胞数目增多但形态上仍多为分枝状小胶质细胞. 结论 以上结果表明小胶质细胞是中枢神经系统损伤的敏感指标;靶区的损伤程度与照射剂量成正相关;靶区周围组织随靶区损伤程度不同而在细胞数量和形态上有不同的表现.
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    中图号:R322.81 文献标识码:A

    文章编号:1000-2790(2000)10-1212-03

    Alterations of microglia in forebrain of gamma knife-irradiated rats

    YANG Ting, Duan Li, Rao Zhi-Ren, Ju Gong

    (Institute of Neurosciences of Chinese PLA, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)

    Abstract:AIM To investigate the dose-effect of gamma rays on microglia and to provide evidence for dosage selection of clinical treatment. METHODS Microglia, part of defense system of the CNS against injury, served as a signal by examining its changes after different dosage of gamma ray irradiation on unilateral caudate putamen nucleus of normal rats. Primary antibody OX42 was used to detect changes of morphology and the number of microglia in the irradiated target and its surrounding tissues. RESULTS At dose of 10~30 Gy, the number of microglia was increased remarkably in the ipsilateral side whereas the contralateral side displayed much fewer reactive cells. When irradiated with 40~60 Gy, microglia in the target tissue was reduced. But some activated microglia with hypertrophic cell body and fewer and shorter processes were seen in the target and its surrounding tissues. At dose of 70~100 Gy, necrotic hole began to appear and became bigger with dosage increasing. The target and nearby regions were swollen. Microglia manifested as phagocytic cells with recognizable particles in the cell bodies. In contrast, microglia in the contralateral side proliferated with the majority as ramified cells. CONCLUSION These results suggest that microglia is a sensitive marker for assessing CNS injury. The injury to target area is positively related to the radiation dosage. The morphology and the number of microglia in the surrounding tissues may vary with graded damage to the target area.
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    Keywords:microglia; gamma knife; caudate putamen nucleus; immunohistochemistry

    0 引言

    近年来通过对多种神经系统损伤和疾病的研究都证实小胶质细胞在脑组织的损伤、修复和疾病形成过程中起重要的作用,而且分子生物学和细胞培养的体内外研究都证实小胶质细胞在中枢神经系统内具有多种重要功能[1,2]. 同时中枢神经系统损伤后小胶质细胞的形态和功能具有可塑性[3],并和星形胶质细胞共同构成反应性胶质化,影响中枢神经系统的损伤和修复过程. 伽玛刀这种非手术治疗颅内疾病的方法日益受到关注,因此对其放射生物学的研究也成为热点之一. 本实验的目的在于观察小胶质细胞在不同程度射线造成的脑损伤中的形态和数量变化,同时对射线造成脑损伤的剂量-反应关系作出评价,为伽玛刀的治疗剂量选择提供依据,充实神经放射生物学的内容.
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    1 材料和方法

    1.1 材料 选用体质量(200±20 g)健康雄性SD大鼠66只,分实验组和对照组(包括假照射组和正常对照组),其中实验组60只,对照组6只. 实验组动物在戊巴比妥钠(40 mg*kg-1体重ip)麻醉下,被固定于γ-刀专用固定架上,用磁共振成像(MRI)进行脑冠状切面的连续扫描,扫描图像经计算机网络传至γ-刀控制计算机,计算确定将照射靶区定于尾状核前部的XYZ的座标. 然后将固定架按确定座标放在γ-刀定位架上,用4 mm准直器,对脑组织实施照射,中心部位剂量分别为10,20,30,40,50,60,70,80,90和100 Gy等10个剂量组,每一剂量组6只动物. γ-刀为Elekta第3代2300B型,焦点吸收剂量率为4 Gy*min-1,照射野半影很小,可忽略不计. 照射后实验动物常规饲养,90 d时灌注.

    1.2 方法 实验组动物受照后90 d,在戊巴比妥钠深麻下,开胸经左心室至升主动脉插管先以100 mL生理盐水冲洗血液,随后用冷的(4℃)含40 g*L-1多聚甲醛的0.1 mol*L-1磷酸盐缓冲液灌流固定,取出脑组织,用冰冻切片机切制大脑的连续冠状切片(片厚30 μm),进行小胶质细胞的免疫组织化学ABC法染色,步骤如下:切片经0.01 mol*L-1 KPBS漂洗3×10 min后入含30 mg*L-1 Triton X-100的KPBS 30 min(室温);经1∶1000小鼠抗OX42血清(Sigma)孵育48 h(4℃);再经生物素化的抗鼠IgG (1∶200,Vector) 抗血清室温2 h;ABC液(1∶200,Vector,ABC Kits)室温2 h;DAB葡萄糖氧化酶法呈色,常规贴片、干燥、脱水透明、封片. 每步骤后均用0.01 mol*L-1 KPBS (pH 7.4)充分洗涤. 免疫组织化学对照为脑片不加一抗而以KPBS代替.
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    2 结果

    正常组前脑内可见小胶质细胞在皮质、尾壳核、胼胝体、隔核、海马、视上核、室旁核、苍白球都有均匀分布,灰质内阳性细胞多于白质. 灰质内小胶质细胞的特点为胞体小,许多突起成放射状伸出,突起细长,有分枝,突起上有许多嵴状物 (Fig 1);白质内小胶质细胞胞体以长梭形为主,突起沿神经纤维走向分布 (Fig 2).

    低剂量照射组(10~30 Gy):小胶质细胞数量增加,细胞密度明显增大,灰质中以新皮质和梨状皮质中阳性细胞数目增多(Fig 3),白质中更为突出,如胼胝体、海马伞、前连合 (Fig 4),以上各区细胞都无明显形态改变.

    中剂量照射组(40~60 Gy):受照一侧出现血管扩张;且在该剂量组内以形态多样的活化小胶质细胞的出现为特点,即在靶区周围的白质如胼胝体、终纹、髓纹等结构及大脑皮层出现许多胞体大、突起短的小胶质细胞 (Fig 5),靶区阳性细胞数量减少,而对侧仍可见正常形态的小胶质细胞.
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    高剂量照射组(70~100 Gy):70 Gy时,靶区有点状坏死出现,且靶区和照射侧新皮质的第I层和第VI层及胼胝体里胞体变大,突起变短、少的小胶质细胞增多,在80~100 Gy的片子上出现许多胞质里有吞噬颗粒的吞噬状小胶质细胞,其突起很短或不可见 (Fig 6),而且这种吞噬细胞多出现于靶区,靶区周围的胼胝体和皮层中也可看到. 80 Gy时可见靶区及其周围组织水肿明显. 剂量为90 Gy时照射侧梨状皮质区阳性细胞几乎全部消失 (Fig 7),而对侧脑中却多而密 (Fig 8). 100 Gy时靶区出现坏死空洞.

    3 讨论

    我们通过对小胶质细胞的形态和数量变化规律的观察发现不同剂量射线对脑组织产生不同程度的影响. 低剂量射线照射能量虽较小,但已足以使敏感的小胶质细胞数目增多,并且不仅在靶区而且在周围的多个脑区都可见. 中剂量照射引起的反应较复杂,照射侧由于毛细血管对射线的敏感而在脑组织出现广泛的血管扩张,这在其他一些作者的研究里都有报道[4,5]. 在照射的靶区小胶质细胞减少而且完整形态遭破坏,推测是由于较高能量的射线使一部分小胶质细胞膜破裂或核内出现DNA碎片,因此细胞数量减少. 在靶区周围的白质结构及大脑皮层里都出现胞体变大,形态多样,突起缩短且减少的阿米巴样小胶质细胞. Kreutzberg等[6]的实验模型表明,在损伤不引起神经元死亡时小胶质细胞主要表现为增殖和肥大,这和我们在低、中剂量组观察到的结果相似. 而当神经毒引起神经元死亡时,小胶质细胞迅速转化为吞噬细胞,这类似于大剂量射线的作用结果. 剂量为70 Gy时,靶区出现坏死细胞,此时在靶区周围有许多胞质内含吞噬物的吞噬细胞,这种反应性小胶质细胞的出现是出于清除变性、坏死的细胞碎片的需要[7,8]. 在100 Gy时靶区的坏死空洞直径约达1 mm,而且坏死周围形成一圈胶质界膜,这也和我们观察到的靶区星形胶质细胞、神经元及HE染色的结果相吻合,是星形胶质细胞以其突起包绕坏死区形成的胶质斑痕使坏死区和周围组织分隔. 在照射侧邻近靶区的胼胝体及有一定距离的皮层上也都可见反应性小胶质细胞. 本实验的结果发现,在进化中较古老的结构对射线更为敏感,如梨状皮质,在低剂量射线时阳性细胞大量增生,中剂量时照射侧细胞数减少,而大剂量射线使照射侧该区阳性细胞几乎全部消失,对侧不受射线直接影响,仅由于脑内信息交流的结果使得对侧该区出现强烈的增殖反应.
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    图 1 正常组灰质里细长分枝状突起上有嵴的小胶质细胞

    Fig 1 Normal amplified microglia in grey matter with ridges on long and thin processes ×240

    图 2 正常组白质里细长分枝状突起沿纤维走向的小胶质细胞

    Fig 2 Normal amplified microglia in white matter with processes directed along fibers ×240

    图 3 30 Gy照侧新皮质中小胶质细胞数目增多

    Fig 3 Microglia were increased in neocortex of irradiated side at dose of 30 Gy ×240
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    图 4 30 Gy照侧胼胝体中小胶质细胞数目增多

    Fig 4 Microglia were increased in corpus callosum of irradiated side at dose of 30 Gy ×240

    图 5 60 Gy照射侧出现胞体增大、突起短少的活性小胶质细胞(→)

    Fig 5 Activated microglia with hypertrophic cytoplasm and shortened processes appeared in irradiated side at dose of 60 Gy ×240

    图 6 80 Gy照射靶区胞体里可见吞噬颗粒的吞噬状小胶质细胞(→)

    Fig 6 Phagocytic microglia with recognizable particles were seen in target at dose of 80 Gy ×480
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    图 7 90 Gy照射侧梨状皮质区几乎不可见阳性细胞

    Fig 7 Almost no positive cells were stained in piriform cortex of irradiated side at 90 Gy ×120

    图 8 90 Gy对侧梨状皮质区密集的阳性细胞

    Fig 8 In contrast to ipsilateral side, piriform cortex in contralateral side had dense positive cells ×120

    基金项目:国家自然科学基金资助项目(39970230)

    作者简介:杨婷(1971-),女(汉族),陕西省西安市人.
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    博士生(导师饶志仁). Tel.(029)3374505 Email.zrrao@fmmu.edu.cn

    参考文献:

    [1] Fedoroff S. Neuroglia[A]. In: Kettenmann H, Ransom BR. ed. Neuroglia [M] New York: Oxford University Press, 1995: 162-181.

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    [3] Streit WJ, Graeber MB, Kreutzberg GW. Functional plasticity of microglia:A review[J]. Glia, 1988; 1(5): 301-307.
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    [4] Kamiryo T, Lopes MB; Berr SS et al. Occlusion of the anterior cerebral artery after Gamma Knife irradiation in a rat[J]. Acta Neurochir (Wien), 1996; 138(8): 983-991.

    [5] Takahashi S, Toshima M, Fukuoka S et al. Effect of gamma knife irradiation on relaxation and contraction responses of the common carotid artery in the rat[J]. Acta Neurochir (Wien), 1996; 138(8): 992-1001.

    [6] Kreutzberg GW. Microglia: A sensor for pathological events in the CNS[J]. Trends Neurosci, 1996; 19(8): 312-318.
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    [7] Giulian D, Chen J, Ingeman JE et al. The role of mononuclear phagocytes in wound healing after traumatic injury to adult mammalian brain[J]. J Neurosci, 1989; 9(12): 4416-4429.

    [8] Thomas WE. Brain macrophages: evaluation of microglia and their functions[J]. Brain Res Rev, 1992; 17(1): 61-74.

    收稿日期:1999-12-14; 修回日期:2000-06-27, http://www.100md.com